Wir möchten Ann Grimm und Michael Zimmermann für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Doug Hamilton für seine technische Unterstützung danken.

1. Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration Vorgehensweise <ol><li> Herstellung von Puffern und Lösungen: Elutionslösung (1 l): Um 1 L analysenreines Wasser hinzufügen, 0,1 g Natriumpolyphosphat, 0,1 ml Tween-80 und 0,01 ml Y-30 Entschäumer. </li><li> Bereiten Filteranordnung (Abbildung 1) in einem biologischen Sicherheitsschrank: <ol><li> Legen Sie Masterflex I / P 73 Labor-Schlauch durch eine Masterflex I / P Easy-Load Pumpenkopf verbunden mit einer Masterflex I / P Präzisions Brushless-Antrieb. </li><li> Sichern Sie den Schlauch mit einer 0-60 psi, Glycerin gefüllte Manometer mit NPT-Filiale T-Verbinder vor der Pumpe Kopf mit einer Schraubverbindung ausgestatteten, und zu einem HDPE-T-Stecker hinter dem Pumpenkopf. </li><li> Montieren Sie die Flasche Retentat durch den Einbau eines Nalgene 53-B Befüllung / Entlüftung Verschluss mit Masterflex L / S 15 Labor-Schlauch und ein T-Stück und befestigen Sie sie in einen 1 l Nalgene schwere Polypropylen-Flasche. </li><li> Fit Masterflex L / S 24 Schlauch wit einem Kneifklemme (Kneifklemme 2) und verbinden Sie es aus dem Retentat Flasche auf dem HDPE-T-Verbinder. </li><li> Verbinden Sie die Masterflex L / S 24 Labor-Schlauch aus dem Manometer an der Asahi Kasei Rexeed 25S High-Flux-Dialysatoren mit einer Schraubzwinge, und aus dem Dialysegerät zum Retentat Flasche. Verwenden Sie maßgeschneiderte DIN-Adapter entwickelt, um ¼ &quot;ID Schlauch aufnehmen, um den Schlauch an die Hohlfaser-Ultrafiltration zu verbinden. </li><li> Fit Masterflex L / S 24 Labor-Schlauch mit einer Schlauchklemme (Schlauchklemme 1) und verbinden Sie es mit einer 10 ml Kunststoff-Pipette mit der Spitze und Baumwolle Stecker entfernt werden, um als Probenaufnahme Linie handeln, und befestigen Sie dann den Schlauch mit dem HDPE-T- Stecker. </li><li> Befestigen Sie ein Ende der Masterflex L/S-36 Labor-Schlauch mit einer Rampe spannen und verbinden Sie den Schlauch an den Abwasser-Anschluss in der Nähe der Ausfahrt Ende des Filters befindet. Legen Sie das andere Ende in den Abfallbehälter. </li></ol></li><li> In 0,01% (w / v) Natriumpolyphosphat die 10 L Wasserprobe und Mischen für 3 min. </li><li> Schließen einer Klammer 2und entfernen Sie die Entlüftungskappe aus dem Retentat Flasche. Alle anderen Klemmen offen sein sollte. </li><li> Stellen Sie die Pumpe Richtung, um die Flüssigkeit aus dem T-Stück bewegen, um das Manometer (von rechts nach links folgende Abbildung 1). Stellen Sie die Drehzahl der Pumpe auf 25% der maximalen Drehzahl und schalten Sie die Pumpe. </li><li> Wenn das Retentat Flasche 2/3 voll, offene Schlauchklemme 2 ist, und ersetzen Sie die Entlüftungskappe zum Retentat Flasche. Prüfen Sie alle Leitungen und Armaturen zu gewährleisten, keine Lecks vorhanden sind. </li><li> Steigern Sie langsam die Drehzahl der Pumpe auf den gewünschten Filtrationsrate (ca. 1,5 L / min), Prüfung auf Dichtheit prüfen. Mit einem Messzylinder und einen Timer oder Durchflussmesser, überprüfen Sie das Filtrat des Wassers dem Austritt aus dem Abwasser Linie (blau L / S 36 Schlauch in Abbildung 1). Luftblasen können typischerweise am Ausgangsende des Filters macht es schwierig, einen stabilen Druck und Filtration zu erzielen bilden. Dies wird durch Einklemmen des Abflussleitung von Hand für einen Moment korrigiert. Diese Aktionwird in der Regel Koax die Luftblase zum Filtrat Hafen und über das Abwasser Linie zu verlassen. Wiederholen Sie nach Bedarf, wenn man bedenkt, dass Erbsengröße Luftblasen oft unvermeidlich sind. </li><li> Überwachen Sie die Filtration. Messung und Aufzeichnung des Druckes und der Filtrationsrate nach Bedarf. Der Druck sollte nie mehr als 20 psi. Es wird empfohlen, dass die Filtrationsrate sollte nicht mehr als 2,0 l / min. Es ist wichtig, dass das Volumen des Wassers in der Flasche Retentat überwacht, um sicherzustellen, dass es nie entleert werden. Es ist normal, das Volumen zu erhöhen oder zu verringern leicht. Wenn die Wassermenge im Retentat Flasche fällt unter 1/3 voll ist, entfernen Sie dann die Entlüftungskappe und enge Kneifklemme 2 auf dem Retentat Flasche Linie. Bringen Sie die Lautstärke wieder auf etwa 2/3 voll, öffnen Sie die Klemme und schnell ersetzen Sie die Entlüftungskappe, wodurch eine gute Abdichtung. Wenn die Lautstärke im Retentat Flasche fällt schnell und kontinuierlich, dann sicher, das Retentat Flaschendeckel ist dicht und die Entlüftungskappe ist sicher an seinem Platz, und dass die tubing ist immer noch in Kontakt mit der Wasserprobe. Wenn diese Probleme nicht auftreten, dann ist es wahrscheinlich, dass die Dichtung im Retentat Flaschendeckel ist schlecht und sollte ausgetauscht werden. </li><li> Wenn die Probe Behälter leer ist, unmittelbar in der Nähe einer Klammer ein, reduzieren Sie die Drehzahl der Pumpe bis 20% seiner maximalen, entfernen Sie die Entlüftungskappe aus dem Retentat Flasche und schließen Sie die Rampe Klemme. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke der Probe im Retentat Flasche auf ca. 200 ml durch Anziehen oder Lösen der Klemme Rampe. Nachdem das Volumen beträgt ca. 200 ml, ziehen Sie die Klammer für die Rampe Elutionsschritte (1,11-1,12). </li><li> In 500 ml Elutionslösung auf die Probe und spülen das Innere des Behälters. Legen Sie die 10 ml-Pipette mit dem Probenaufnahme Linie in den Behälter, der die Elutionslösung enthält. Stellen Sie sicher, dass die Rampe Nadelklemme geschlossen ist. Offene Schlauchklemme 1 und 2 nahe Kneifklemme momentan für die Erarbeitung der Elutionslösung. </li><li> Nachdem die 500 ml Elutionslösung erstellt wird, In der Nähe einer Klammer 1 und 2 offene Schlauchklemme. Lassen Sie die Elutionslösung für 5 Minuten mit einer Drehzahl von 20% seiner maximalen zirkulieren. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke der Probe im Retentat Flasche auf etwa 100 ml durch Anziehen oder Lösen der Klemme an der Rampe Abwasser Linie. Ziehen Sie die Rampe Klammer und lassen Sie die Probe für 1 Minute zirkulieren. Vermeiden Ziehen von Luft in der Rohrleitung, indem sie die Menge der Probe in dem Retentat Flasche ist hoch genug, um die L / S 15 Schlauch in die Flasche Retentat bestimmt. </li><li> Umkehren der Richtung der Pumpe, die die Probe in das Retentat zwingt Flasche. Die Pumpe in umgekehrter für 20 Sekunden, was zu einer insgesamt ~ 225 ml Flasche im Retentat ausgeführt. Schalten Sie die Pumpe. </li><li> Entfernen Sie die Masterflex I / P 73 Schläuche aus dem Pumpenkopf und ziehen Sie das Manometer. Trennen Sie die Masterflex L / S 24 Schlauch Verlassen des Hohlfaser-Ultrafiltration. Halten Sie den Schlauch über dem Retentat Flasche, um alle verbleibenden Probe in die KraftRetentat Flasche. </li><li> Trennen Sie alle Schläuche von der Flasche, und ersetzen Sie die Entlüftungskappe mit einem nicht-Entlüftungskappe. </li><li> Fahren Sie mit dem IMS / IFA Prozedur mit der ~ 225 ml Retentat. </li></ol> 2. Immunomagnetische Trennverfahren <ol><li> Herstellung von Puffern und Lösungen: <ol><li> Lassen Sie die Puffer in den Dynabeads enthalten: Cryptosporidium / Giardia Combo Kit auf Raumtemperatur bringen. </li><li> 1X SL-Puffer A: 1 ml 10X SL-Puffer A bis 9 ml gereinigtem Wasser. </li></ol></li><li> Übertragen der ~ 225 ml Flüssigkeit aus dem Retentat Flasche mit einer markierten konischen 250 ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das Retentat Flasche zweimal mit 10 ml Reagenz Wasser, und fügen Sie die Spülungen an den konischen Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1500 xg für 15 min bei 4 ° C ohne Bremse. </li><li> Vorsichtig Aspiration des Überstands aus der Luft-Wasser-Grenzfläche zu 5 ml oberhalb der verdichteten Pellets für jeden 0,5 ml Pellet-Volumen (dh Anspruch 1 Aspirat5 ml oberhalb einer Pellet-Volumen von 1,3 ml, und saugen bis 5 ml für eine Pellet von 0,5 ml oder weniger). </li><li> Gründlich das Pellet in den Überstand durch Vortexen und / oder Mischen in der Pipette. Übertragen Sie jede 5 ml Volumen der Flüssigkeit auf die flachseitige Dynal L10 Röhrchen mit 1 ml jeder der SL-10X und 10X Puffer A SL-Puffer B. Spülen Sie den konischen Zentrifugenröhrchen zweimal mit 2,5 ml Reagenz Wasser und fügen Sie die zu spülen die L10 Rohr, wodurch das Gesamtvolumen der L10 Rohr 12 ml, einschließlich den Puffern. </li><li> Geben Sie 100 ul jeder der gut gemischten resuspendierten anti-Cryptosporidium und Giardia Dynabeads anti-L10 an die Röhre. Drehen Sie das Rohr L10 bei 18 UpM für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator Mixer. </li><li> Legen Sie die flache Seite der L10 Rohr gegen den MPC-6 Magneten und sanft die Hand Fels das Rohr Ende-zu-Ende, 180 ° für 2 Minuten. </li><li> Halten Sie die L10 Rohr in der MPC-6-Magnet mit dem Magnet nach oben, dekantieren Sie den Überstand weg von der Raupe / (oo) Zyste Komplexe bound auf den Magneten. Entfernen Sie die L10 Rohr vom Magneten und 0,5 ml 1X SL-Puffer A auf das Rohr. Die Suspension unter Verwendung von zwei zusätzlichen Spülungen von 0,5 ml 1X SL-Puffer A in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen im MPC-S mit dem Magneten in der vertikalen Position gehalten wird. </li><li> Schütteln Sie die Röhre in den MPC-S Magnet 180 ° für 1 Minute. Mit dem Magneten an Ort und Stelle, Aspiration des Überstands mit einer Pasteurpipette nach unten gerichteten der Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> 1 ml 1X PBS, um die Vorderseite des Mikrozentrifugenröhrchen, entfernen Sie den Magneten und rocken das Rohr nur sanft, bis die Beads resuspendiert werden. Ersetzen Sie den Magneten in die senkrechte Position und schaukeln das Rohr um 180 ° für 1 Minute. Saugen Sie das PBS spülen, ohne das Pellet Perle, mit einer Pasteurpipette, um so viel Schmutz wie möglich zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie den Magneten und 50 l Reagens Wasser auf die Rückseite des Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex die Röhre bei voller Geschwindigkeit für 50 Sekunden,dann Inkubieren der Röhrchen bei 80 ° C für 10 Minuten gefolgt von 30 Sekunden Wirbels folgt. Ersetzen Magnet in den MPC-S in der angeschrägten Position, die Bindung der Kügelchen an dem Magneten und Verlassen der (oo) Zysten in der Flüssigkeit. Tragen Sie die (oo) Zyste Suspension auf einen SingleSpot gut gleiten. </li><li> Wiederholen Schritt 2.10, Aufbringen der Flüssigkeit auf der gleichen Quelle, welche die erste Dissoziation. Objektträger auf einem 37 ° C wärmer Rutsche für 1 Stunde, um die Suspension auf den Objektträger gut trocknen lassen. </li></ol> 3. Färbung und Untersuchung <ol><li> Herstellung von Puffern und Lösungen: Arbeiten DAPI-Lösung: Fügen Sie 25 ul DAPI-Stammlösung (2 mg / ml in Methanol) zu 25 ml 1X PBS. Shop Lager und funktionierende Lösungen zwischen 1 ° C und 10 ° C im Dunkeln. </li><li> Bewerben 50 ul Methanol zu der Folie gut und lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen. </li><li> Dann werden 50 ul der Arbeiterklasse DAPI-Lösung auf den Objektträger gut und inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Verwenden Sie einen Kimwipe, die DAPI aus dem Brunnen Docht. Bewerben 50 ul EasyStain. Bei 35 ° C für 30 Minuten. </li><li> Wick den Fleck weg das auch mit einem Kimwipe, und dann langsam 300 pl kaltem EasyStain Befestigung Puffer, so dass sie gut über den Rand fließen. Inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Verwenden Sie einen Kimwipe, um den Puffer aus dem Brunnen Docht und anwenden 10 ul EasyStain Eindeckmedium. </li><li> Tragen Sie vorsichtig ein Deckgläschen werden, indem alle Blasen, die auftreten können. Dichten Sie das Deckglas mit klarem Nagellack. </li><li> Scannen Sie die gesamte Folie mit dem FITC-Filter, bei 200facher Gesamtvergrößerung, für eiförmig oder kugelig Apfel-grün fluoreszierende Objekte, die ein Oozysten oder Zysten ähneln. Untersuchen Sie alle diese Objekte mit dem DAPI-Filter bei 1000X Gesamtvergrößerung und dann mit DIC, auch bei 1000X Gesamtvergrößerung. Notieren Sie die Größe mit einem kalibrierten Okularmikrometer und morphologischen Eigenschaften. </li><li> Resultate zu dokumentieren. </li></ol> Hinweis: Weitere InformationenInformationen über die ursprüngliche Prozedur kann in der Dezember-2005-Version von EPA-Methode 1623 12 zu finden. Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration beschriebenen Verfahren wird anstelle Abschnitt 12.0 der EPA-Methode 1623 verwendet. Die Hitze Dissoziation ändert Abschnitt 13.3.3 der EPA-Methode 1623. Das Verfahren beschreibt auch eine zusätzliche PBS während der IMS-Prozess, der in der Dezember-2005-Version von Method 1623 nach Abschnitt 13.3.2.16 eingefügt werden können spülen. Die vollständige Liste der Verbrauchsmaterialien, Reagenzien und Geräte für die EPA-Methode 1623 auch diese Modifikationen verwendet wird in der Anlage aufgeführt. 4. Repräsentative Ergebnisse Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten durch die Prozesse der Filtration und Separation immunomagnetische zurückgewonnen werden durch mikroskopische Analyse nachgewiesen. Bei 200facher Gesamtvergrößerung, zeigt jeder Organismus eine typische Färbemuster, Größe und Form wie in Abbildung 2 gezeigt </strong&gt; sollte weiter beobachtet werden mittels Ölimmersion bei 1000X Gesamtvergrößerung. Dies wird für die Messung und Identifizierung von entweder typisch oder atypisch bestimmenden Merkmale Features, die ausschließen, würde eine positive Identifizierung zu ermöglichen. Cryptosporidium ist ein kugelförmiges Objekt eiförmig bis 4 bis 6 &amp;mgr; m im Durchmesser, die brillante apfelgrün FITC-Fluoreszenz mit hell hervorgehobenen Kanten (Abbildung 3A zeigt ). Mit DAPI UV, wird ein Oozysten weisen eine der folgenden Kategorien typisches Merkmal: hellblau interne Färbung mit einem grünen Rand und ohne deutliche Kerne (DAPI negativ), intensiv blaue Färbung interne oder bis zu vier verschiedene, himmelblauen Zellkerne (DAPI positiv - 3B). Atypische Features sind Abweichungen in Farbe, Struktur oder DAPI-Fluoreszenz (zB zu viele gefärbte Zellkerne, rot fluoreszierende internen Strukturen). Wenn das fluoreszierende Objekt Kriterien für typische FITC und DAPI-Färbung erfüllt hat, wird untersucht, mit Differential-Interferenz-conKontrast (DIC). Die Aufgabe wird für atypische äußeren oder inneren morphologischen Merkmalen wie Zellwand Ornamente oder ein oder zwei große Kerne Füllen der Zelle untersucht. Wenn atypische Strukturen nicht eingehalten, wird das Objekt in der gesamten IFA Zählung erfasst und kategorisiert als leere oder amorphe Struktur mit 1-4 Sporozoiten vorhanden (Abbildung 3C). Ebenso werden Giardia-ähnliche Objekte in Bezug auf FITC und DAPI-Färbung sowie DIC Eigenschaften, wie Axonemen, Median Körper und Kernen untersucht Giardia Zysten sind rund bis eiförmig brillante apfelgrün Objekte, 8 -. Von 18 &amp;mgr; m lange 5 - 15 mu m breit mit hell hervorgehobenen Kanten (3D). Mit UV-DAPI wird die Giardia Zyste zeigen DAPI-negative Färbung, oder DAPI-positiven Eigenschaften (3E). Das fluoreszierende Aufgabe wird durch DIC für typischen und atypischen Merkmalen in der gleichen Weise untersucht wie Cryptosporidium beschrieben.Wenn atypische Merkmale nicht eingehalten, wird das Objekt in der gesamten IFA Zählung erfasst und kategorisiert als leere haltige amorphe Struktur, oder mit einem oder mehreren Art der internen Strukturen vorhanden (3F). Jeder Organismus, der beobachtet, dass atypische Merkmale aufweisen wird, sollte nicht als ein (oo) Zyste gezählt werden. Die mikroskopische Analyse von Umweltproben kann eine Herausforderung sein, da es Organismen, die Auto-fluoreszieren oder kann mit dem FITC-konjugierten anti-Cryptosporidium und / oder anti-Giardia Antikörper ein kreuzreagieren. Es wird empfohlen, ein Analyst vertraut mit aquatischen Mikroben und Kritik Dutzende von Dias zu identifizieren Erfahrung Cryptosporidium und Giardia zu gewinnen. Mindestens drei (oo) Zysten an der positiven Färbung Kontrollen sollten vor jeder Sitzung am Mikroskop charakterisiert werden. Qualitätskontrolle Proben können mit (oo) Zysten versetzt werden, um die Prozent rec bestimmenOvery für jedes Protozoon mit der Berechnung: (Oo) Zyste prozentuale Ausbeute = ((QC Probe Graf - Graf von unversetzten Sample) / Spike) x 100. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> Abbildung 1. Grafische Darstellung der Tangentialströmung Hohlfaser-Ultrafiltration. Der Schlauch wird farbkodiert, um zu helfen ist die Montage des Systems. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vertreter Fluoreszenzbild Cryptosporidium und Giardia (oo) Zysten. Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wurden mit FITC-markiertem anti-Cryptosporidium / Giardia Antikörpern gefärbt. Arrows, Giardia Zysten, Pfeilspitzen, Cryptosporidium-Oozysten. Insgesamt vier Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wurden sechs in der Ebene der Fokus gefunden. Die Proben beobachtbareed unter 200-facher Vergrößerung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> . Abbildung 3 Vertreter mikroskopische Aufnahmen von Cryptosporidium-Oozysten und Zysten Giaridia zur Charakterisierung herangezogen Cryptosporidium-Oozysten (A - C).. Brilliant apfelgrün FITC Fluoreszenz von kugelförmigen Objekten von 4 bis 6 &amp;mgr; m im Durchmesser mit hell hervorgehobenen Kanten (A) mit bis zu vier verschiedene, himmelblauen DAPI Kerne (B) und 03.59 Sporozoiten (S) pro Oozysten (C). Giardia-Zysten (D - F). Brilliant apfelgrün FITC Fluoreszenz von rund bis eiförmig Objekte von 8 bis 18 mu m lang und 5 bis 15 &amp;mgr; m breit mit hell hervorgehobenen Kanten (D) mit bis zu vier himmelblauen DAPI Kernen (E) und mit einem oder mehreren erkennbaren inneren Struktur solcher als Kerne (N), mittleren Körper (M) und Axonemen oder (A) (F). Weiße Pfeile, brillante apfelgrün Fluoreszenzfärbung Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wBesserwisser, weiße Pfeilspitzen, DAPI positiven Kernen. Proben beobachtet unter 1000-facher Vergrößerung.

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Die United States Environmental Protection Agency durch ihr Amt für Forschung und Entwicklung in Zusammenarbeit mit dem Amt für Boden-und Trinkwasser der Technical Support Center finanzierte die Forschung hier beschrieben. Alle Arbeiten wurden vor Ort bei der US-EPA, Cincinnati, Ohio unterstützt. Obwohl die Informationen in diesem Artikel beschrieben wurde ganz oder teilweise von der United States Environmental Protection Agency unter Vertrag (Contract EP-C-06-031) zu Shaw Environmental and Infrastructure, Inc finanziert wird, ist es nicht unbedingt die Meinung der Agentur und nicht offiziell ist rein zufällig. Es ist zu Agentur Kritik unterzogen wurde und zur Veröffentlichung freigegeben.

Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration ist eine alternative und effiziente Technik für die anfängliche Konzentration von Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Cysten aus Wasser. Hohlfaser-Ultrafiltration ist weniger teuer als herkömmliche Filter. Da es die Möglichkeit, Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten aus einer Vielzahl von verschiedenen Matrices Wasser konzentrieren muss, ist es eine sinnvolle Alternative zu den derzeitigen Filtertechniken für EPA-Methode 1623 verwendet. Wie bei den meisten anderen Filtrationsverfahren ist Hohlfaser-Ultrafiltration anfällig für Verschmutzung mit extrem trüben Proben. Hoher Wasserdruck würde aus dem Filter Fouling führen, daher empfiehlt es sich, den Druck während der Filtration Lauf zu überwachen. Neben Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten, hat Hohlfaser-Ultrafiltration der Lage gezeigt, konzentrieren Bakterien und Viren 1-3,5,8. Hohlfaser-Ultrafiltration outlined in dieser Methode können mehrere Organismen in einer einzigen Probe zu konzentrieren. Es ist bemerkenswert, dass die Erzielung einer endgültigen Volumen zwischen 200 und 250 ml ist die kritische letzte Schritt in der Konzentration Prozedur, so daß zusätzliche Zentrifugationsschritte, die in (oo) Zyste Verlust zur Folge haben, vermieden werden (Schritt 2.2). Allerdings kann damit das Volumen in der Flasche bis zu stark abnimmt haben ungünstige Auswirkungen auf die Erholungen da es nicht genug Flüssigkeitsvolumen, um alle Oozysten oder Zysten in das Retentat Flasche zu zwängen. Daher empfiehlt es sich um ein Endvolumen von 200 bis 250 ml zu erhalten. Wärme-Dissoziation ist eine Alternative zu der Säure Dissoziation Schritt in Method 1623. Diese Alternative Schritt hat sich gezeigt, Cryptosporidium Oozysten Erholung zu verbessern und die Verfahren Variation, wenn entweder von Fluss oder Wasser 9 Reagenz isoliert. Ein Side-by-Side-Vergleich von Säure und Hitze Dissoziation Methoden nachgewiesen, dass unter Anwendung von Wärme zu Dissoziationte die Organismen von den immunomagnetische Kügelchen erzeugt höhere mittlere Wiederfindung sowohl für Cryptosporidium und Giardia. Darüber hinaus war die Genauigkeit der Cryptosporidium und Giardia Einziehungen besser in Proben mit Wärme Dissoziation verarbeitet verglichen mit Säuredissoziationskonstante 9. Der Einbau von HFUF als die Konzentration Schritt ermöglicht eine größere Flexibilität durch die Möglichkeit, mehrere Organismen konzentrieren. Darüber hinaus ist es eine preiswerte Alternative zum aktuellen Methode 1623 Filtration Optionen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ausstattung / Reagent </td><td> Verkäufer </td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> Asahi Kasei Rexeed 25 S / R nass Hohlfaser-Ultrafilter </td><td> Wählen Medical </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P-73 (Masterflex R-3603), oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex Platinum-gehärtet) oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex Platinum-gehärtet) oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex Platinum-gehärtet) oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-36 </td></tr><tr><td> I / P Präzisions Brushless Antrieb </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77410-10 </td></tr><tr><td> I / P-Easy Load Pumpenkopf </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> Schwarze HDPE-T-Stück, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> US-Kunststoffe </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-Verbinder L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> EG-30613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene Heavy-Duty-PP 1 L Flasche </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06257-10 </td></tr><tr><td> 10 ml Pipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 678-11C </td></tr><tr><td> Nalgene Füllung / Entlüftungskappe für 1/4 &quot;-Schlauch, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06258-10 </td></tr><tr><td> Manometer </td><td> Cole Parmer </td><td> Ein-680-46-10 </td></tr><tr><td> Gerade Verschraubung, NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06469-18 </td></tr><tr><td> NPT-Filiale tee, PP-natur </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30.610-75 </td></tr><tr><td> Quetschklemmen, 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06833-00 </td></tr><tr><td> CuStom fit DIN-Adapter </td><td> Molded Products Corp </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Ring-Stand </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> Ring Stativklammern </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05 bis 769-6Q </td></tr><tr><td> Keck Rampe Klammer, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06835-10 </td></tr><tr><td> Natriumpolyphosphat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Natriumthiosulfatpentahydrat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Entschäumer Y-30-Emulsion </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L Faltbarer High-Density-Polyethylen Cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Zentrifugieren Flaschenregal </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ml konischen Zentrifugenröhrchen </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Einweg-Trichter </td><td> Cole Parmer </td><td> U-6122 bis 10 </td></tr><tr><td> Waschflasche </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06.252-40 </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Ausschwingrotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> Zentrifugenbecher Adapter für 250 ml konischen Röhrchen </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 pl großen Bohrung Pipettenspitzen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> Vacushield Filter </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 ml Pipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia Combo Kit </td><td> IchDexx </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen </td><td> Falke </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 flachwandigen Rohre </td><td> IDEXX </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Timer </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6-Magnet </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 ml Pipetten </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1,5 ml geringe Haftung Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 ul Pipette &amp; entsprechende Barriere Tipps </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 ul Pipette &amp; entsprechende Barriere Tipps </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9-Zoll-Pasteurpipetten </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S Magnet </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Wirbel </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads Rotator Mixer </td><td> IDEXX </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Heizblock </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Lab Rüstung Perlen </td><td> Lab Rüstung </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Digital-Thermometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung 1X pH 7,4 (PBS 1X) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Single-Spot-Dias </td><td> IDEXX </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> EasyStain direkten Kit </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 ul Pipette &amp; entsprechende Barriere Tipps </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Klaren Nagellack </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Boekel Scientific </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> schieben wärmer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Immersionsöl, Typ A ND = 1,515 </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> Nikon 90i-Mikroskop mit DIC-Fähigkeiten </td><td> Nikon </td><td> MBA-77000 </td></tr><tr><td> Plan APO 100x Öl-Objektiv </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Planen Achro 20X </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC-Filter </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPI-Filter </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> X-Cite Fluoreszenzilluminator </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Objektiv-Papier </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Biohazard Einweg-Beutel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard Kanülenbox </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> 3% Wasserstoffperoxid </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Bleichmittel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

a modified epa method 1623 that uses tangential flow hollow-fiber ultrafiltration and heat dissociation steps to detect waterborne cryptosporidium and giardia spp.

Cryptosporidium und Giardia Arten sind zwei der häufigsten Protozoen, die Ursache wässrigen Durchfall-Ausbruch von Krankheiten weltweit. Zur besseren Charakterisierung der Prävalenz dieser Erreger, EPA-Methode 1623 wurde entwickelt und verwendet, um Mengen dieser Organismen in der US-Trinkwasser zu überwachen liefert 12. Verfahren besteht aus drei Hauptteilen: Das erste ist die Probenkonzentration, bei dem mindestens 10 l Wundfläche Wasser gefiltert wird. Die Organismen und eingeschlossen Trümmer werden dann aus dem Filter eluiert und zentrifugiert, um weitere Konzentration der Probe. Der zweite Teil der Methode wird ein immunomagnetische Trennverfahren, wo die konzentrierte Wasserprobe zu immunomagnetische Kügelchen, die spezifisch an den Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten ermöglicht für bestimmte Entfernung der Parasiten aus der konzentrierten Schutt angewendet wird. Diese (oo) Zysten werden dann von den magnetischen Beads durch eine Säure-Dissoziations-Verfah abgelöstDure. Der letzte Teil des Verfahrens ist die Immunfluoreszenzfärbung und Aufzählung, wo (oo) Zysten zu einer Folie, gebeizt angewendet werden, und aufgezählt durch Mikroskopie. Methode 1623 hat vier börsennotierte Probenkonzentration Systeme zu Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten in Wasser einzufangen: Envirochek Filter (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV-Filter (Pall Corporation), Filta-Max-Filter (IDEXX, Westbrook, MA), oder Continuous Flow Zentrifugation (Haemonetics, Boston, MA). Allerdings haben Cryptosporidium und Giardia (oo) Zyste Erholungen stark abhängig von der Quelle Wasser-Matrix und Filtern eingesetzt 1,14 variiert. Eine neue Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration (HFUF)-System wurde vor kurzem gezeigt, dass effizienter und robust Gewinnen Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten aus verschiedenen Matrices Wasser, außerdem ist es günstiger als andere Kapsel-Filter-Options und kann mehrere Erreger gleichzeitig konzentrieren 1-3,5-8,10,11. Darüber hinaus zeigten frühere Studien von Hill und Kollegen, dass die HFUF deutlich Cryptosporidium-Oozysten Erholungen verbessert, wenn sie direkt mit den Envirochek HV-Filter 4 verglichen. Zusätzliche Änderungen an den gegenwärtigen Methoden sind auch berichtet worden, um die Leistungsfähigkeit der Methode zu verbessern. Austauschen der Säuredissoziationskonstante Verfahren mit Wärme Dissoziation wurde gezeigt, dass sie wirksam bei der Abtrennung Cryptosporidium aus den magnetischen Kügelchen in einigen Matrizen 9,13. Dieses Protokoll beschreibt eine modifizierte Methode 1623, die das neue System verwendet HFUF Filtration mit der Hitze Dissoziation Schritt. Die Verwendung von HFUF mit diesem modifizierten Verfahren ist eine preiswerte Alternative zum aktuellen EPA-Methode 1623 Filtration Optionen und bietet mehr Flexibilität durch die Möglichkeit der Konzentration mehrerer Organismen.

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A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung einer Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration Probenkonzentration und eine Wärme Dissoziation als alternative Schritte zum Nachweis von wässrigen<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Und<em&gt; Giardia</em&gt; Arten der amerikanischen Umweltschutzbehörde EPA-Methode 1623.

Eine Änderung, die EPA-Methode 1623 Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration und Wärme Dissoziationsstufen nutzt, um auf Wasserbasis Detect<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Und<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

a-modified-epa-method-1623-that-uses-tangential-flow-hollow-fiber

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

20.3K Aufrufe.  Office of Research and Development, US Environmental Protection Agency. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung einer Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration Probenkonzentration und eine Wärme Dissoziation als alternative Schritte zum Nachweis von wässrigen Cryptosporidium Und Giardia Arten der amerikanischen Umweltschutzbehörde EPA-Methode 1623.

Serie: A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

High-und Low Throughput-Screens mit Wurzelknoten-Nematoden Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

Glaswolle-Filter für die Konzentration auf Wasserbasis Viren-und Landwirtschaftsorganisation der Zoonose-Erreger

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten<em&gt; In-vitro-</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Eine Referenz Broth Mikrodilutionsverfahren für Dalbavancin<em&gt; In-vitro-</em&gt; Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien, die wachsen aerob

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...