Wir möchten Ann Grimm und Michael Zimmermann für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Doug Hamilton für seine technische Unterstützung danken.

1. Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration Vorgehensweise <ol><li> Herstellung von Puffern und Lösungen: Elutionslösung (1 l): Um 1 L analysenreines Wasser hinzufügen, 0,1 g Natriumpolyphosphat, 0,1 ml Tween-80 und 0,01 ml Y-30 Entschäumer. </li><li> Bereiten Filteranordnung (Abbildung 1) in einem biologischen Sicherheitsschrank: <ol><li> Legen Sie Masterflex I / P 73 Labor-Schlauch durch eine Masterflex I / P Easy-Load Pumpenkopf verbunden mit einer Masterflex I / P Präzisions Brushless-Antrieb. </li><li> Sichern Sie den Schlauch mit einer 0-60 psi, Glycerin gefüllte Manometer mit NPT-Filiale T-Verbinder vor der Pumpe Kopf mit einer Schraubverbindung ausgestatteten, und zu einem HDPE-T-Stecker hinter dem Pumpenkopf. </li><li> Montieren Sie die Flasche Retentat durch den Einbau eines Nalgene 53-B Befüllung / Entlüftung Verschluss mit Masterflex L / S 15 Labor-Schlauch und ein T-Stück und befestigen Sie sie in einen 1 l Nalgene schwere Polypropylen-Flasche. </li><li> Fit Masterflex L / S 24 Schlauch wit einem Kneifklemme (Kneifklemme 2) und verbinden Sie es aus dem Retentat Flasche auf dem HDPE-T-Verbinder. </li><li> Verbinden Sie die Masterflex L / S 24 Labor-Schlauch aus dem Manometer an der Asahi Kasei Rexeed 25S High-Flux-Dialysatoren mit einer Schraubzwinge, und aus dem Dialysegerät zum Retentat Flasche. Verwenden Sie maßgeschneiderte DIN-Adapter entwickelt, um ¼ &quot;ID Schlauch aufnehmen, um den Schlauch an die Hohlfaser-Ultrafiltration zu verbinden. </li><li> Fit Masterflex L / S 24 Labor-Schlauch mit einer Schlauchklemme (Schlauchklemme 1) und verbinden Sie es mit einer 10 ml Kunststoff-Pipette mit der Spitze und Baumwolle Stecker entfernt werden, um als Probenaufnahme Linie handeln, und befestigen Sie dann den Schlauch mit dem HDPE-T- Stecker. </li><li> Befestigen Sie ein Ende der Masterflex L/S-36 Labor-Schlauch mit einer Rampe spannen und verbinden Sie den Schlauch an den Abwasser-Anschluss in der Nähe der Ausfahrt Ende des Filters befindet. Legen Sie das andere Ende in den Abfallbehälter. </li></ol></li><li> In 0,01% (w / v) Natriumpolyphosphat die 10 L Wasserprobe und Mischen für 3 min. </li><li> Schließen einer Klammer 2und entfernen Sie die Entlüftungskappe aus dem Retentat Flasche. Alle anderen Klemmen offen sein sollte. </li><li> Stellen Sie die Pumpe Richtung, um die Flüssigkeit aus dem T-Stück bewegen, um das Manometer (von rechts nach links folgende Abbildung 1). Stellen Sie die Drehzahl der Pumpe auf 25% der maximalen Drehzahl und schalten Sie die Pumpe. </li><li> Wenn das Retentat Flasche 2/3 voll, offene Schlauchklemme 2 ist, und ersetzen Sie die Entlüftungskappe zum Retentat Flasche. Prüfen Sie alle Leitungen und Armaturen zu gewährleisten, keine Lecks vorhanden sind. </li><li> Steigern Sie langsam die Drehzahl der Pumpe auf den gewünschten Filtrationsrate (ca. 1,5 L / min), Prüfung auf Dichtheit prüfen. Mit einem Messzylinder und einen Timer oder Durchflussmesser, überprüfen Sie das Filtrat des Wassers dem Austritt aus dem Abwasser Linie (blau L / S 36 Schlauch in Abbildung 1). Luftblasen können typischerweise am Ausgangsende des Filters macht es schwierig, einen stabilen Druck und Filtration zu erzielen bilden. Dies wird durch Einklemmen des Abflussleitung von Hand für einen Moment korrigiert. Diese Aktionwird in der Regel Koax die Luftblase zum Filtrat Hafen und über das Abwasser Linie zu verlassen. Wiederholen Sie nach Bedarf, wenn man bedenkt, dass Erbsengröße Luftblasen oft unvermeidlich sind. </li><li> Überwachen Sie die Filtration. Messung und Aufzeichnung des Druckes und der Filtrationsrate nach Bedarf. Der Druck sollte nie mehr als 20 psi. Es wird empfohlen, dass die Filtrationsrate sollte nicht mehr als 2,0 l / min. Es ist wichtig, dass das Volumen des Wassers in der Flasche Retentat überwacht, um sicherzustellen, dass es nie entleert werden. Es ist normal, das Volumen zu erhöhen oder zu verringern leicht. Wenn die Wassermenge im Retentat Flasche fällt unter 1/3 voll ist, entfernen Sie dann die Entlüftungskappe und enge Kneifklemme 2 auf dem Retentat Flasche Linie. Bringen Sie die Lautstärke wieder auf etwa 2/3 voll, öffnen Sie die Klemme und schnell ersetzen Sie die Entlüftungskappe, wodurch eine gute Abdichtung. Wenn die Lautstärke im Retentat Flasche fällt schnell und kontinuierlich, dann sicher, das Retentat Flaschendeckel ist dicht und die Entlüftungskappe ist sicher an seinem Platz, und dass die tubing ist immer noch in Kontakt mit der Wasserprobe. Wenn diese Probleme nicht auftreten, dann ist es wahrscheinlich, dass die Dichtung im Retentat Flaschendeckel ist schlecht und sollte ausgetauscht werden. </li><li> Wenn die Probe Behälter leer ist, unmittelbar in der Nähe einer Klammer ein, reduzieren Sie die Drehzahl der Pumpe bis 20% seiner maximalen, entfernen Sie die Entlüftungskappe aus dem Retentat Flasche und schließen Sie die Rampe Klemme. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke der Probe im Retentat Flasche auf ca. 200 ml durch Anziehen oder Lösen der Klemme Rampe. Nachdem das Volumen beträgt ca. 200 ml, ziehen Sie die Klammer für die Rampe Elutionsschritte (1,11-1,12). </li><li> In 500 ml Elutionslösung auf die Probe und spülen das Innere des Behälters. Legen Sie die 10 ml-Pipette mit dem Probenaufnahme Linie in den Behälter, der die Elutionslösung enthält. Stellen Sie sicher, dass die Rampe Nadelklemme geschlossen ist. Offene Schlauchklemme 1 und 2 nahe Kneifklemme momentan für die Erarbeitung der Elutionslösung. </li><li> Nachdem die 500 ml Elutionslösung erstellt wird, In der Nähe einer Klammer 1 und 2 offene Schlauchklemme. Lassen Sie die Elutionslösung für 5 Minuten mit einer Drehzahl von 20% seiner maximalen zirkulieren. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke der Probe im Retentat Flasche auf etwa 100 ml durch Anziehen oder Lösen der Klemme an der Rampe Abwasser Linie. Ziehen Sie die Rampe Klammer und lassen Sie die Probe für 1 Minute zirkulieren. Vermeiden Ziehen von Luft in der Rohrleitung, indem sie die Menge der Probe in dem Retentat Flasche ist hoch genug, um die L / S 15 Schlauch in die Flasche Retentat bestimmt. </li><li> Umkehren der Richtung der Pumpe, die die Probe in das Retentat zwingt Flasche. Die Pumpe in umgekehrter für 20 Sekunden, was zu einer insgesamt ~ 225 ml Flasche im Retentat ausgeführt. Schalten Sie die Pumpe. </li><li> Entfernen Sie die Masterflex I / P 73 Schläuche aus dem Pumpenkopf und ziehen Sie das Manometer. Trennen Sie die Masterflex L / S 24 Schlauch Verlassen des Hohlfaser-Ultrafiltration. Halten Sie den Schlauch über dem Retentat Flasche, um alle verbleibenden Probe in die KraftRetentat Flasche. </li><li> Trennen Sie alle Schläuche von der Flasche, und ersetzen Sie die Entlüftungskappe mit einem nicht-Entlüftungskappe. </li><li> Fahren Sie mit dem IMS / IFA Prozedur mit der ~ 225 ml Retentat. </li></ol> 2. Immunomagnetische Trennverfahren <ol><li> Herstellung von Puffern und Lösungen: <ol><li> Lassen Sie die Puffer in den Dynabeads enthalten: Cryptosporidium / Giardia Combo Kit auf Raumtemperatur bringen. </li><li> 1X SL-Puffer A: 1 ml 10X SL-Puffer A bis 9 ml gereinigtem Wasser. </li></ol></li><li> Übertragen der ~ 225 ml Flüssigkeit aus dem Retentat Flasche mit einer markierten konischen 250 ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das Retentat Flasche zweimal mit 10 ml Reagenz Wasser, und fügen Sie die Spülungen an den konischen Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1500 xg für 15 min bei 4 ° C ohne Bremse. </li><li> Vorsichtig Aspiration des Überstands aus der Luft-Wasser-Grenzfläche zu 5 ml oberhalb der verdichteten Pellets für jeden 0,5 ml Pellet-Volumen (dh Anspruch 1 Aspirat5 ml oberhalb einer Pellet-Volumen von 1,3 ml, und saugen bis 5 ml für eine Pellet von 0,5 ml oder weniger). </li><li> Gründlich das Pellet in den Überstand durch Vortexen und / oder Mischen in der Pipette. Übertragen Sie jede 5 ml Volumen der Flüssigkeit auf die flachseitige Dynal L10 Röhrchen mit 1 ml jeder der SL-10X und 10X Puffer A SL-Puffer B. Spülen Sie den konischen Zentrifugenröhrchen zweimal mit 2,5 ml Reagenz Wasser und fügen Sie die zu spülen die L10 Rohr, wodurch das Gesamtvolumen der L10 Rohr 12 ml, einschließlich den Puffern. </li><li> Geben Sie 100 ul jeder der gut gemischten resuspendierten anti-Cryptosporidium und Giardia Dynabeads anti-L10 an die Röhre. Drehen Sie das Rohr L10 bei 18 UpM für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Rotator Mixer. </li><li> Legen Sie die flache Seite der L10 Rohr gegen den MPC-6 Magneten und sanft die Hand Fels das Rohr Ende-zu-Ende, 180 ° für 2 Minuten. </li><li> Halten Sie die L10 Rohr in der MPC-6-Magnet mit dem Magnet nach oben, dekantieren Sie den Überstand weg von der Raupe / (oo) Zyste Komplexe bound auf den Magneten. Entfernen Sie die L10 Rohr vom Magneten und 0,5 ml 1X SL-Puffer A auf das Rohr. Die Suspension unter Verwendung von zwei zusätzlichen Spülungen von 0,5 ml 1X SL-Puffer A in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen im MPC-S mit dem Magneten in der vertikalen Position gehalten wird. </li><li> Schütteln Sie die Röhre in den MPC-S Magnet 180 ° für 1 Minute. Mit dem Magneten an Ort und Stelle, Aspiration des Überstands mit einer Pasteurpipette nach unten gerichteten der Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> 1 ml 1X PBS, um die Vorderseite des Mikrozentrifugenröhrchen, entfernen Sie den Magneten und rocken das Rohr nur sanft, bis die Beads resuspendiert werden. Ersetzen Sie den Magneten in die senkrechte Position und schaukeln das Rohr um 180 ° für 1 Minute. Saugen Sie das PBS spülen, ohne das Pellet Perle, mit einer Pasteurpipette, um so viel Schmutz wie möglich zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie den Magneten und 50 l Reagens Wasser auf die Rückseite des Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex die Röhre bei voller Geschwindigkeit für 50 Sekunden,dann Inkubieren der Röhrchen bei 80 ° C für 10 Minuten gefolgt von 30 Sekunden Wirbels folgt. Ersetzen Magnet in den MPC-S in der angeschrägten Position, die Bindung der Kügelchen an dem Magneten und Verlassen der (oo) Zysten in der Flüssigkeit. Tragen Sie die (oo) Zyste Suspension auf einen SingleSpot gut gleiten. </li><li> Wiederholen Schritt 2.10, Aufbringen der Flüssigkeit auf der gleichen Quelle, welche die erste Dissoziation. Objektträger auf einem 37 ° C wärmer Rutsche für 1 Stunde, um die Suspension auf den Objektträger gut trocknen lassen. </li></ol> 3. Färbung und Untersuchung <ol><li> Herstellung von Puffern und Lösungen: Arbeiten DAPI-Lösung: Fügen Sie 25 ul DAPI-Stammlösung (2 mg / ml in Methanol) zu 25 ml 1X PBS. Shop Lager und funktionierende Lösungen zwischen 1 ° C und 10 ° C im Dunkeln. </li><li> Bewerben 50 ul Methanol zu der Folie gut und lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen. </li><li> Dann werden 50 ul der Arbeiterklasse DAPI-Lösung auf den Objektträger gut und inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Verwenden Sie einen Kimwipe, die DAPI aus dem Brunnen Docht. Bewerben 50 ul EasyStain. Bei 35 ° C für 30 Minuten. </li><li> Wick den Fleck weg das auch mit einem Kimwipe, und dann langsam 300 pl kaltem EasyStain Befestigung Puffer, so dass sie gut über den Rand fließen. Inkubieren für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Verwenden Sie einen Kimwipe, um den Puffer aus dem Brunnen Docht und anwenden 10 ul EasyStain Eindeckmedium. </li><li> Tragen Sie vorsichtig ein Deckgläschen werden, indem alle Blasen, die auftreten können. Dichten Sie das Deckglas mit klarem Nagellack. </li><li> Scannen Sie die gesamte Folie mit dem FITC-Filter, bei 200facher Gesamtvergrößerung, für eiförmig oder kugelig Apfel-grün fluoreszierende Objekte, die ein Oozysten oder Zysten ähneln. Untersuchen Sie alle diese Objekte mit dem DAPI-Filter bei 1000X Gesamtvergrößerung und dann mit DIC, auch bei 1000X Gesamtvergrößerung. Notieren Sie die Größe mit einem kalibrierten Okularmikrometer und morphologischen Eigenschaften. </li><li> Resultate zu dokumentieren. </li></ol> Hinweis: Weitere InformationenInformationen über die ursprüngliche Prozedur kann in der Dezember-2005-Version von EPA-Methode 1623 12 zu finden. Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration beschriebenen Verfahren wird anstelle Abschnitt 12.0 der EPA-Methode 1623 verwendet. Die Hitze Dissoziation ändert Abschnitt 13.3.3 der EPA-Methode 1623. Das Verfahren beschreibt auch eine zusätzliche PBS während der IMS-Prozess, der in der Dezember-2005-Version von Method 1623 nach Abschnitt 13.3.2.16 eingefügt werden können spülen. Die vollständige Liste der Verbrauchsmaterialien, Reagenzien und Geräte für die EPA-Methode 1623 auch diese Modifikationen verwendet wird in der Anlage aufgeführt. 4. Repräsentative Ergebnisse Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten durch die Prozesse der Filtration und Separation immunomagnetische zurückgewonnen werden durch mikroskopische Analyse nachgewiesen. Bei 200facher Gesamtvergrößerung, zeigt jeder Organismus eine typische Färbemuster, Größe und Form wie in Abbildung 2 gezeigt </strong&gt; sollte weiter beobachtet werden mittels Ölimmersion bei 1000X Gesamtvergrößerung. Dies wird für die Messung und Identifizierung von entweder typisch oder atypisch bestimmenden Merkmale Features, die ausschließen, würde eine positive Identifizierung zu ermöglichen. Cryptosporidium ist ein kugelförmiges Objekt eiförmig bis 4 bis 6 &amp;mgr; m im Durchmesser, die brillante apfelgrün FITC-Fluoreszenz mit hell hervorgehobenen Kanten (Abbildung 3A zeigt ). Mit DAPI UV, wird ein Oozysten weisen eine der folgenden Kategorien typisches Merkmal: hellblau interne Färbung mit einem grünen Rand und ohne deutliche Kerne (DAPI negativ), intensiv blaue Färbung interne oder bis zu vier verschiedene, himmelblauen Zellkerne (DAPI positiv - 3B). Atypische Features sind Abweichungen in Farbe, Struktur oder DAPI-Fluoreszenz (zB zu viele gefärbte Zellkerne, rot fluoreszierende internen Strukturen). Wenn das fluoreszierende Objekt Kriterien für typische FITC und DAPI-Färbung erfüllt hat, wird untersucht, mit Differential-Interferenz-conKontrast (DIC). Die Aufgabe wird für atypische äußeren oder inneren morphologischen Merkmalen wie Zellwand Ornamente oder ein oder zwei große Kerne Füllen der Zelle untersucht. Wenn atypische Strukturen nicht eingehalten, wird das Objekt in der gesamten IFA Zählung erfasst und kategorisiert als leere oder amorphe Struktur mit 1-4 Sporozoiten vorhanden (Abbildung 3C). Ebenso werden Giardia-ähnliche Objekte in Bezug auf FITC und DAPI-Färbung sowie DIC Eigenschaften, wie Axonemen, Median Körper und Kernen untersucht Giardia Zysten sind rund bis eiförmig brillante apfelgrün Objekte, 8 -. Von 18 &amp;mgr; m lange 5 - 15 mu m breit mit hell hervorgehobenen Kanten (3D). Mit UV-DAPI wird die Giardia Zyste zeigen DAPI-negative Färbung, oder DAPI-positiven Eigenschaften (3E). Das fluoreszierende Aufgabe wird durch DIC für typischen und atypischen Merkmalen in der gleichen Weise untersucht wie Cryptosporidium beschrieben.Wenn atypische Merkmale nicht eingehalten, wird das Objekt in der gesamten IFA Zählung erfasst und kategorisiert als leere haltige amorphe Struktur, oder mit einem oder mehreren Art der internen Strukturen vorhanden (3F). Jeder Organismus, der beobachtet, dass atypische Merkmale aufweisen wird, sollte nicht als ein (oo) Zyste gezählt werden. Die mikroskopische Analyse von Umweltproben kann eine Herausforderung sein, da es Organismen, die Auto-fluoreszieren oder kann mit dem FITC-konjugierten anti-Cryptosporidium und / oder anti-Giardia Antikörper ein kreuzreagieren. Es wird empfohlen, ein Analyst vertraut mit aquatischen Mikroben und Kritik Dutzende von Dias zu identifizieren Erfahrung Cryptosporidium und Giardia zu gewinnen. Mindestens drei (oo) Zysten an der positiven Färbung Kontrollen sollten vor jeder Sitzung am Mikroskop charakterisiert werden. Qualitätskontrolle Proben können mit (oo) Zysten versetzt werden, um die Prozent rec bestimmenOvery für jedes Protozoon mit der Berechnung: (Oo) Zyste prozentuale Ausbeute = ((QC Probe Graf - Graf von unversetzten Sample) / Spike) x 100. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig1.jpg" /> Abbildung 1. Grafische Darstellung der Tangentialströmung Hohlfaser-Ultrafiltration. Der Schlauch wird farbkodiert, um zu helfen ist die Montage des Systems. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vertreter Fluoreszenzbild Cryptosporidium und Giardia (oo) Zysten. Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wurden mit FITC-markiertem anti-Cryptosporidium / Giardia Antikörpern gefärbt. Arrows, Giardia Zysten, Pfeilspitzen, Cryptosporidium-Oozysten. Insgesamt vier Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wurden sechs in der Ebene der Fokus gefunden. Die Proben beobachtbareed unter 200-facher Vergrößerung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4177/4177fig3.jpg" /> . Abbildung 3 Vertreter mikroskopische Aufnahmen von Cryptosporidium-Oozysten und Zysten Giaridia zur Charakterisierung herangezogen Cryptosporidium-Oozysten (A - C).. Brilliant apfelgrün FITC Fluoreszenz von kugelförmigen Objekten von 4 bis 6 &amp;mgr; m im Durchmesser mit hell hervorgehobenen Kanten (A) mit bis zu vier verschiedene, himmelblauen DAPI Kerne (B) und 03.59 Sporozoiten (S) pro Oozysten (C). Giardia-Zysten (D - F). Brilliant apfelgrün FITC Fluoreszenz von rund bis eiförmig Objekte von 8 bis 18 mu m lang und 5 bis 15 &amp;mgr; m breit mit hell hervorgehobenen Kanten (D) mit bis zu vier himmelblauen DAPI Kernen (E) und mit einem oder mehreren erkennbaren inneren Struktur solcher als Kerne (N), mittleren Körper (M) und Axonemen oder (A) (F). Weiße Pfeile, brillante apfelgrün Fluoreszenzfärbung Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten wBesserwisser, weiße Pfeilspitzen, DAPI positiven Kernen. Proben beobachtet unter 1000-facher Vergrößerung.

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Die United States Environmental Protection Agency durch ihr Amt für Forschung und Entwicklung in Zusammenarbeit mit dem Amt für Boden-und Trinkwasser der Technical Support Center finanzierte die Forschung hier beschrieben. Alle Arbeiten wurden vor Ort bei der US-EPA, Cincinnati, Ohio unterstützt. Obwohl die Informationen in diesem Artikel beschrieben wurde ganz oder teilweise von der United States Environmental Protection Agency unter Vertrag (Contract EP-C-06-031) zu Shaw Environmental and Infrastructure, Inc finanziert wird, ist es nicht unbedingt die Meinung der Agentur und nicht offiziell ist rein zufällig. Es ist zu Agentur Kritik unterzogen wurde und zur Veröffentlichung freigegeben.

Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration ist eine alternative und effiziente Technik für die anfängliche Konzentration von Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Cysten aus Wasser. Hohlfaser-Ultrafiltration ist weniger teuer als herkömmliche Filter. Da es die Möglichkeit, Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten aus einer Vielzahl von verschiedenen Matrices Wasser konzentrieren muss, ist es eine sinnvolle Alternative zu den derzeitigen Filtertechniken für EPA-Methode 1623 verwendet. Wie bei den meisten anderen Filtrationsverfahren ist Hohlfaser-Ultrafiltration anfällig für Verschmutzung mit extrem trüben Proben. Hoher Wasserdruck würde aus dem Filter Fouling führen, daher empfiehlt es sich, den Druck während der Filtration Lauf zu überwachen. Neben Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten, hat Hohlfaser-Ultrafiltration der Lage gezeigt, konzentrieren Bakterien und Viren 1-3,5,8. Hohlfaser-Ultrafiltration outlined in dieser Methode können mehrere Organismen in einer einzigen Probe zu konzentrieren. Es ist bemerkenswert, dass die Erzielung einer endgültigen Volumen zwischen 200 und 250 ml ist die kritische letzte Schritt in der Konzentration Prozedur, so daß zusätzliche Zentrifugationsschritte, die in (oo) Zyste Verlust zur Folge haben, vermieden werden (Schritt 2.2). Allerdings kann damit das Volumen in der Flasche bis zu stark abnimmt haben ungünstige Auswirkungen auf die Erholungen da es nicht genug Flüssigkeitsvolumen, um alle Oozysten oder Zysten in das Retentat Flasche zu zwängen. Daher empfiehlt es sich um ein Endvolumen von 200 bis 250 ml zu erhalten. Wärme-Dissoziation ist eine Alternative zu der Säure Dissoziation Schritt in Method 1623. Diese Alternative Schritt hat sich gezeigt, Cryptosporidium Oozysten Erholung zu verbessern und die Verfahren Variation, wenn entweder von Fluss oder Wasser 9 Reagenz isoliert. Ein Side-by-Side-Vergleich von Säure und Hitze Dissoziation Methoden nachgewiesen, dass unter Anwendung von Wärme zu Dissoziationte die Organismen von den immunomagnetische Kügelchen erzeugt höhere mittlere Wiederfindung sowohl für Cryptosporidium und Giardia. Darüber hinaus war die Genauigkeit der Cryptosporidium und Giardia Einziehungen besser in Proben mit Wärme Dissoziation verarbeitet verglichen mit Säuredissoziationskonstante 9. Der Einbau von HFUF als die Konzentration Schritt ermöglicht eine größere Flexibilität durch die Möglichkeit, mehrere Organismen konzentrieren. Darüber hinaus ist es eine preiswerte Alternative zum aktuellen Methode 1623 Filtration Optionen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Ausstattung / Reagent </td><td> Verkäufer </td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> Asahi Kasei Rexeed 25 S / R nass Hohlfaser-Ultrafilter </td><td> Wählen Medical </td><td> REXEED25S / R </td></tr><tr><td> I / P-73 (Masterflex R-3603), oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06408-73 </td></tr><tr><td> L / S 24 (Masterflex Platinum-gehärtet) oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-24 </td></tr><tr><td> L / S 15 (Masterflex Platinum-gehärtet) oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-15 </td></tr><tr><td> L / S 36 (Masterflex Platinum-gehärtet) oder gleichwertig </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-96410-36 </td></tr><tr><td> I / P Präzisions Brushless Antrieb </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77410-10 </td></tr><tr><td> I / P-Easy Load Pumpenkopf </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-77601-10 </td></tr><tr><td> Schwarze HDPE-T-Stück, 1/4 &quot;x 3/8&quot; x 3/8 &quot; </td><td> US-Kunststoffe </td><td> 62064 </td></tr><tr><td> Masterflex T-Verbinder L / S 15-25 </td><td> Cole Parmer </td><td> EG-30613-12 </td></tr><tr><td> Nalgene Heavy-Duty-PP 1 L Flasche </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06257-10 </td></tr><tr><td> 10 ml Pipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 678-11C </td></tr><tr><td> Nalgene Füllung / Entlüftungskappe für 1/4 &quot;-Schlauch, 53B </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06258-10 </td></tr><tr><td> Manometer </td><td> Cole Parmer </td><td> Ein-680-46-10 </td></tr><tr><td> Gerade Verschraubung, NPT (F), 1/4 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06469-18 </td></tr><tr><td> NPT-Filiale tee, PP-natur </td><td> Cole Parmer </td><td> A-30.610-75 </td></tr><tr><td> Quetschklemmen, 1/2 &quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06833-00 </td></tr><tr><td> CuStom fit DIN-Adapter </td><td> Molded Products Corp </td><td> MPC-855NS.250 </td></tr><tr><td> Ring-Stand </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-670B </td></tr><tr><td> Ring Stativklammern </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05 bis 769-6Q </td></tr><tr><td> Keck Rampe Klammer, 14mm </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06835-10 </td></tr><tr><td> Natriumpolyphosphat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 305553 </td></tr><tr><td> Natriumthiosulfatpentahydrat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 72050 </td></tr><tr><td> Entschäumer Y-30-Emulsion </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A5758 </td></tr><tr><td> Tween-80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> 10 L Faltbarer High-Density-Polyethylen Cubitainer </td><td> VWR </td><td> IR314-0025 </td></tr><tr><td> Zentrifugieren Flaschenregal </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-663-103 </td></tr><tr><td> 250 ml konischen Zentrifugenröhrchen </td><td> Corning </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> Einweg-Trichter </td><td> Cole Parmer </td><td> U-6122 bis 10 </td></tr><tr><td> Waschflasche </td><td> Cole Parmer </td><td> U-06.252-40 </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X-15R </td></tr><tr><td> Ausschwingrotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> ARIES SX4750 </td></tr><tr><td> Zentrifugenbecher Adapter für 250 ml konischen Röhrchen </td><td> Beckman Coulter </td><td> 349849 </td></tr><tr><td> 200 pl großen Bohrung Pipettenspitzen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-707-134 </td></tr><tr><td> Vacushield Filter </td><td> Gelman </td><td> 629-4402 </td></tr><tr><td> 5 ml Pipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 bis 678-11D </td></tr><tr><td> Dynabeads: Cryptosporidium / Giardia Combo Kit </td><td> IchDexx </td><td> 73002 </td></tr><tr><td> 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen </td><td> Falke </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Dynal L10 flachwandigen Rohre </td><td> IDEXX </td><td> 74003 </td></tr><tr><td> Timer </td><td> VWR </td><td> 23609-202 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-6-Magnet </td><td> IDEXX </td><td> 12002D </td></tr><tr><td> 1 ml Pipetten </td><td> VWR </td><td> 53283-700 </td></tr><tr><td> 1,5 ml geringe Haftung Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-681-320 </td></tr><tr><td> 1000 ul Pipette &amp; entsprechende Barriere Tipps </td><td> Gilson </td><td> P1000/DF1000ST </td></tr><tr><td> 100 ul Pipette &amp; entsprechende Barriere Tipps </td><td> Gilson </td><td> P100/DF100ST </td></tr><tr><td> 9-Zoll-Pasteurpipetten </td><td> VWR </td><td> 14672-412 </td></tr><tr><td> Dynal MPC-S Magnet </td><td> IDEXX</td><td> 12020D </td></tr><tr><td> Wirbel </td><td> VWR </td><td> 14216-188 </td></tr><tr><td> Dynabeads Rotator Mixer </td><td> IDEXX </td><td> 94701 </td></tr><tr><td> Heizblock </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718-2 </td></tr><tr><td> Lab Rüstung Perlen </td><td> Lab Rüstung </td><td> 42370-750 </td></tr><tr><td> Digital-Thermometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-077-60 </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung 1X pH 7,4 (PBS 1X) </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td></tr><tr><td> Single-Spot-Dias </td><td> IDEXX </td><td> 30201 </td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Corning </td><td> 287018 </td></tr><tr><td> EasyStain direkten Kit </td><td> BTF </td><td> - </td></tr><tr><td> 10 ul Pipette &amp; entsprechende Barriere Tipps </td><td> Gilson </td><td> P10 &amp; DF10ST </td></tr><tr><td> 4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td></tr><tr><td> Klaren Nagellack </td><td> Fisher Scientific </td><td> S30697 </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> L6815 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34155 </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Boekel Scientific </td><td> 133000 </td></tr><tr><td> schieben wärmer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-474-521 </td></tr><tr><td> Immersionsöl, Typ A ND = 1,515 </td><td> Nikon </td><td> MXA20234 </td></tr><tr><td> Nikon 90i-Mikroskop mit DIC-Fähigkeiten </td><td> Nikon </td><td> MBA-77000 </td></tr><tr><td> Plan APO 100x Öl-Objektiv </td><td> Nikon </td><td> MRD01901 </td></tr><tr><td> Planen Achro 20X </td><td> Nikon </td><td> MRL00202 </td></tr><tr><td> FITC-Filter </td><td> Nikon </td><td> 96302 </td></tr><tr><td> DAPI-Filter </td><td> Nikon </td><td> 96301 </td></tr><tr><td> X-Cite Fluoreszenzilluminator </td><td> Nikon </td><td> 87540 </td></tr><tr><td> Objektiv-Papier </td><td> Nikon </td><td> 76997 </td></tr><tr><td> Biohazard Einweg-Beutel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-829D </td></tr><tr><td> Biohazard Kanülenbox </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-827-117 </td></tr><tr><td> 3% Wasserstoffperoxid </td><td> VWR </td><td> BDH3540-2 </td></tr><tr><td> Bleichmittel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1952030 </td></tr><tr><td> Wypall </td><td> Kimberly Clark </td><td> 34790 </td></tr></tbody></table>

a modified epa method 1623 that uses tangential flow hollow-fiber ultrafiltration and heat dissociation steps to detect waterborne cryptosporidium and giardia spp.

Cryptosporidium und Giardia Arten sind zwei der häufigsten Protozoen, die Ursache wässrigen Durchfall-Ausbruch von Krankheiten weltweit. Zur besseren Charakterisierung der Prävalenz dieser Erreger, EPA-Methode 1623 wurde entwickelt und verwendet, um Mengen dieser Organismen in der US-Trinkwasser zu überwachen liefert 12. Verfahren besteht aus drei Hauptteilen: Das erste ist die Probenkonzentration, bei dem mindestens 10 l Wundfläche Wasser gefiltert wird. Die Organismen und eingeschlossen Trümmer werden dann aus dem Filter eluiert und zentrifugiert, um weitere Konzentration der Probe. Der zweite Teil der Methode wird ein immunomagnetische Trennverfahren, wo die konzentrierte Wasserprobe zu immunomagnetische Kügelchen, die spezifisch an den Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten ermöglicht für bestimmte Entfernung der Parasiten aus der konzentrierten Schutt angewendet wird. Diese (oo) Zysten werden dann von den magnetischen Beads durch eine Säure-Dissoziations-Verfah abgelöstDure. Der letzte Teil des Verfahrens ist die Immunfluoreszenzfärbung und Aufzählung, wo (oo) Zysten zu einer Folie, gebeizt angewendet werden, und aufgezählt durch Mikroskopie. Methode 1623 hat vier börsennotierte Probenkonzentration Systeme zu Cryptosporidium-Oozysten und Giardia Zysten in Wasser einzufangen: Envirochek Filter (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV-Filter (Pall Corporation), Filta-Max-Filter (IDEXX, Westbrook, MA), oder Continuous Flow Zentrifugation (Haemonetics, Boston, MA). Allerdings haben Cryptosporidium und Giardia (oo) Zyste Erholungen stark abhängig von der Quelle Wasser-Matrix und Filtern eingesetzt 1,14 variiert. Eine neue Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration (HFUF)-System wurde vor kurzem gezeigt, dass effizienter und robust Gewinnen Cryptosporidium-Oozysten und Giardia-Zysten aus verschiedenen Matrices Wasser, außerdem ist es günstiger als andere Kapsel-Filter-Options und kann mehrere Erreger gleichzeitig konzentrieren 1-3,5-8,10,11. Darüber hinaus zeigten frühere Studien von Hill und Kollegen, dass die HFUF deutlich Cryptosporidium-Oozysten Erholungen verbessert, wenn sie direkt mit den Envirochek HV-Filter 4 verglichen. Zusätzliche Änderungen an den gegenwärtigen Methoden sind auch berichtet worden, um die Leistungsfähigkeit der Methode zu verbessern. Austauschen der Säuredissoziationskonstante Verfahren mit Wärme Dissoziation wurde gezeigt, dass sie wirksam bei der Abtrennung Cryptosporidium aus den magnetischen Kügelchen in einigen Matrizen 9,13. Dieses Protokoll beschreibt eine modifizierte Methode 1623, die das neue System verwendet HFUF Filtration mit der Hitze Dissoziation Schritt. Die Verwendung von HFUF mit diesem modifizierten Verfahren ist eine preiswerte Alternative zum aktuellen EPA-Methode 1623 Filtration Optionen und bietet mehr Flexibilität durch die Möglichkeit der Konzentration mehrerer Organismen.

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A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung einer Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration Probenkonzentration und eine Wärme Dissoziation als alternative Schritte zum Nachweis von wässrigen<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Und<em&gt; Giardia</em&gt; Arten der amerikanischen Umweltschutzbehörde EPA-Methode 1623.

Eine Änderung, die EPA-Methode 1623 Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration und Wärme Dissoziationsstufen nutzt, um auf Wasserbasis Detect<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Und<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

a-modified-epa-method-1623-that-uses-tangential-flow-hollow-fiber

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

20.3K Aufrufe.  Office of Research and Development, US Environmental Protection Agency. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung einer Tangentialströmungs-Hohlfaser-Ultrafiltration Probenkonzentration und eine Wärme Dissoziation als alternative Schritte zum Nachweis von wässrigen Cryptosporidium Und Giardia Arten der amerikanischen Umweltschutzbehörde EPA-Methode 1623.

Serie: A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of agricultural waters. Here, water is filtered through sterile Modified Moore Swabs (MMS), which consist&#160;of a simple gauze filter enclosed in a plastic cartridge, to concentrate bacteria. Following filtration, non-selective or selective enrichments for the target bacteria are performed in the MMS. For colorimetric detection of the target bacteria, the enrichments are then assayed using paper-based analytical devices (&#181;PADs) embedded with bacteria-indicative substrates. Each substrate reacts with target-indicative bacterial enzymes, generating colored products that can be detected visually (qualitative detection) on the &#181;PAD. Alternatively, digital images of the reacted &#181;PADs can be generated with common scanning or photographic devices and analyzed using ImageJ software, allowing for more objective and standardized interpretation of results. Although the biochemical screening procedures are designed to identify the aforementioned bacterial pathogens, in some cases enzymes produced by background microbiota or the degradation of the colorimetric substrates may produce a false positive. Therefore, confirmation using a more discriminatory diagnostic is needed. Nonetheless, this bacterial concentration and detection platform is inexpensive, sensitive (0.1 CFU/ml detection limit), easy to perform, and rapid (concentration, enrichment, and detection are performed within approximately 24&#160;hr), justifying its use as an initial screening method for the microbiological quality of agricultural water.

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (&#181;PAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.

Farbmetrische Papierbasierte Erkennung von<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonellen</em&gt; Spp. Und<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Von großen Mengen von Landwirtschaftliche Wasser

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Forschung

Umwelt

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser von Kultur und RT-qPCR. I. Sammlung von Virenproben

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Entwirren der unsichtbaren Spieler im Ozean - ein Feld Führer zu Wasserchemie und Marine Mikrobiologie

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

EPA-Methode 1615 Messung von Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser durch Kultur und RT-qPCR. II. Insgesamt kultivierbaren Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VACUSIP eine verbesserte Inex Methode für<em&gt; In Situ</em&gt; Messung von partikulären und gelösten Verbindungen, die durch Active Suspension Feeders Verarbeitet

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

Glaswolle-Filter für die Konzentration auf Wasserbasis Viren-und Landwirtschaftsorganisation der Zoonose-Erreger

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

Immunologie und Infektion

Capture of Environmental DNA (eDNA) from Water Samples by Flocculation

The analysis of environmental DNA (eDNA) has become a widely used approach to problem solving in species management. The detection of cryptic species including invasive and (or) species at risk is the goal, typically accomplished by testing water and sediment for the presence of characteristic DNA signatures. Reliable and efficient procedures for the capture of eDNA are required, especially those that can be performed easily in the field by personnel with limited training and citizen scientists. The capture of eDNA using membrane filtration is widely used currently. This approach has inherent issues that include the choice of filter material and porosity, filter fouling, and time required on site for the process to be performed. Flocculation offers an alternative that can be easily implemented and applied to sampling regimes that strive to cover broad territories in limited time.

Capture of Environmental DNA eDNA from Water Samples by Flocculation

Environmental DNA (eDNA) is typically captured from water samples using alcohol precipitation, filtration, or flocculation. Presented here is an alternative protocol that uses lanthanum chloride to enable collection of dissolved and particulate-bound nucleic acids from water samples containing eukaryotic cells, prokaryotic cells, and virus.

The analysis of environmental DNA (eDNA) has become a widely used approach to problem solving in species management. The detection of cryptic species ...

Determining Viral Disinfection Efficacy of Hot Water Laundering

This protocol provides an example of a laboratory process for conducting laundering studies that generate data on viral disinfection. While the protocol was developed for research during the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic, it is intended to be a framework, adaptable to other virus disinfection studies; it demonstrates the steps for preparing the test virus, inoculating the test material, assessing visual and integrity changes to the washed items due to the laundering process, and quantifying the reduction in viral load. Additionally, the protocol outlines the necessary quality control samples for ensuring the experiments are not biased by contamination and measurements/observations that should be recorded to track the material integrity of the personal protective equipment (PPE) items after multiple laundering cycles. The representative results presented with the protocol use the Phi6 bacteriophage inoculated onto cotton scrub, denim, and cotton face-covering materials and indicate that the hot water laundering and drying process achieved over a 3-log (99.9%) reduction in viral load for all samples (a 3-log reduction is the disinfectant performance metric in U.S. Environmental Protection Agency's Product Performance Test Guideline 810.2200). The reduction in viral load was uniform across different locations on the PPE items. The results of this viral disinfection efficacy testing protocol should help the scientific community explore the effectiveness of home laundering for other types of test viruses and laundering procedures.

In response to the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemic, a laboratory protocol was developed to test the viral disinfection efficacy of hot water laundering of cloth face coverings, cotton scrubs, and denim pants. The Phi6 virus (bacteriophage) was used as the organism to test disinfection efficacy.

Bestimmung der Wirksamkeit der Virusdesinfektion durch Heißwasserwäsche

This protocol provides an example of a laboratory process for conducting laundering studies that generate data on viral disinfection. While the protocol ...

Eine Änderung, die EPA-Methode 1623 Tangential Flow Hohlfaser-Ultrafiltration und Wärme Dissoziationsstufen nutzt, um auf Wasserbasis Detect

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