Die Autoren bedanken sich bei Catherine Alford für Anregungen Zelldissoziationslösung Methoden und Kevin Weller, David Flaherty und der Bretagne Matlock danken für die Unterstützung in der Durchflusszytometrie Shared Resource an der Vanderbilt University Medical Center und Melissa A. Musser für künstlerische Unterstützung mit Illustrationen. Wir danken Dr.. Jack Mosher und Sean Morrison Beratung beim Einsatz Isolierung von neuronalen Vorläuferzellen. Der VMC Durchflusszytometrie Shared Resource wird von der Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) und der Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404) unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus US-amerikanischen National Institutes of Health Zuschüsse DK064251, DK086594 und DK070219 unterstützt.

1. Vorbereitung der Medien (Alle Schritte in Gewebekultur Haube getan) <ol><li> Kombinieren der folgenden: 44 ml L-15 Medium, 0,5 ml 100X Penicillin / Streptomycin (P / S), 0,5 ml 100 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA), 0,5 ml 1 M HEPES, 5 ml Gewebekultur sterilem Wasser. Achten Sie darauf, BSA und P / S gründlich zu mischen, bevor Sie. Dieses Volumen sollte ausreichend sein für die Dissoziation von bis zu fünf verschiedenen Geweben Typen. Dieses Medium wird in Schritt 3.4 verwendet werden, um Abschrecken Lösungen für den Einsatz nach der enzymatischen Spaltung von Gewebe vorzubereiten. </li><li> Filtermedien obwohl 0,22 um Polyethersulfon (PES)-Filter. </li><li> Bereiten Sie 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) und 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ab 10x Stocks auf Gewebekulturen reines Wasser. Filtern durch 0,22 um PES-Filter. Große Mengen dieser Reagenzien können im Voraus hergestellt werden und bei 4 ° C, Aliquotieren kleineren Volumen in einer Gewebekulturabzug nach Bedarf. </li><li> Füllen Sie mehrere 15 ml konischen Röhrchen mit 1X HBSS (Anzahl der Rohre, um die Anzahl von Geweben garantieren auf Sub-Zerlegung) halten Röhrchen auf Eis gleich. </li></ol> 2. Zergliederung <ol><li> Zeitüberschreitung schwangere Maus in Einklang mit den institutionellen Pflege der Tiere und Use Committee gebilligt Protokolle und Transfer in eine Gebärmutter einschläfern 60 oder 100 mm Petrischale mit eiskaltem 1X PBS. </li><li> Embryonen aus der Gebärmutter entfernen und einschläfern durch Enthauptung in eiskaltem 1X PBS. Bildschirm einzeln unter Fluoreszenz-Beleuchtung, die Aufteilung in positiven transgenen und Wildtyp-(WT) nicht transgenen Pools. Halten Embryonen in eiskaltem 1X PBS während der Dissektion. </li><li> Unter einem Binokular, sub-sezieren des Urogenitaltrakts. Halten Sie den Embryo im Ort an der Vorderpfote Ebene mit feinen Pinzetten. Entfernen der Eingeweide aus der Leber auf der Genitalhöcker durch Einführen einer Pinzette auf der Ebene der Membran dann kräftig Ziehen der inneren Organe nach unten und weg von der dorsalen Körperwand. </li><li> Weitere Unterkategorien sezieren das Gewebe derInteresse von dem umgebenden Gewebe (1). Platzieren Sie jede einzeln Sub-seziert Gewebetyp in einem 15 ml konischen Röhrchen mit eiskaltem 1X HBSS. Pool jeden Gewebetyp zusammen nach Embryo-Phänotyp (dh alle GFP +-Proben von fetalen Darm sind in einem 15 ml konischen Röhrchen gepoolt). </li><li> Parallel dazu sezieren vergleichbar Gewebe von Wildtyp-Embryonen für die Wiedergutmachung der Kontrollen an der Durchflusszytometrie verwenden. </li></ol> 3. Die Dissoziation von Gewebe Subdissected <ol><li> Pellet Gewebe durch Zentrifugation bei 210 relative Zentrifugalbeschleunigung (RCF), 4 ° C für 5 min Sub-seziert. Nach der Zentrifugation, absaugen so viel wie möglich HBSS. </li><li> Resuspendieren Sie das Pellet in Gewebe Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), wobei Sie auf Pipettenspitzen zwischen jeder Probe ändern, um eine Kreuzkontamination von Gewebearten zu vermeiden. Die Menge des zugesetzten Accumax kann für größere oder kleinere Mengen von Gewebe skaliert werden. Typischerweise für 1-5 Fetalen Darm Proben, 1 ml Accumax würde verwendet werden, aber größere Gewebe Pools erfordert ein größeres Volumen zur Dissoziation zu erreichen. </li><li> Die Röhrchen in 37 ° C Wasserbad für 20-45 Minuten, je nach Stufe des Gewebes isoliert (zB 13.5 dpc Darm 20 min, 15,5 dpc Darm 35 min). Halfway obwohl die Dissoziation Zeit manuell brechen die Gewebe durch Klopfen das Rohr gegen die Seite des Wasserbad (oder jede feste Oberfläche) und &quot;blätterte&quot; die Röhre (wie man es schüttelt sich ein altmodisches Quecksilber-Thermometer). Am Ende der Dissoziation Zeit wiederholen Sie den Shake Down Vorgang mehrmals zu weiteren distanzieren die Probe. Für weitere empfindliche Proben, reduzieren Sie die Heftigkeit der Shake Down und stattdessen Pipette Verreibung während Schritt 3,5 bis ein angemessenes Maß an Dissoziation zu erreichen. Typische Zeiten für Dissoziation 14,5 und 15,5 DPC DPC LUT sind 35 und 45 min, bzw.. </li><li> Während Gewebe in Accumax Inkubation wird, Make up Abschrecken sosungen, Quench Quench bezeichnet und 1:5. Quench wird durch Zugabe von 45 ul 5 mg / ml DNase I bis 6 ml L-15 Medien. Quench 1:5 durch Zugabe von 45 ul 5 mg / ml DNase I in 30 ml L-15 Medien. </li><li> Am Ende der Dissoziation, bewegen Sie 15 ml Röhrchen auf Eis und sofort mit 1 ml Quench in jedes Röhrchen. Man reibt jede Probe auf und ab bis Gewebe ist fast vollständig dissoziiert (Abbildung 2). Es wird noch immer kleine Stücke des Gewebes in der Lösung vorhanden sein. Das Erreichen einer vollständig homogenen Probe ist weder leicht erreichbar noch wünschenswert, da es kann zu einer schlechten Lebensfähigkeit der Zellen führen. </li><li> Halten auf Eis so weit wie möglich für den Rest des Protokolls. Achten Sie darauf, um eine frische Pipettenspitze verwenden beim Pipettieren bis Quench Quench oder 01.05, um eine Kreuzkontamination von Proben zu vermeiden. </li></ol> 4. Filterung Zellsuspension <ol><li> Mit einer Pinzette, die in 70% Ethanol eingeweicht worden sind, legen Sie eine 3 cm im Quadrat von 38 um Nylon-Mesh-Membran (Sefar America) über dieMund eines neuen 15 ml konischen Röhrchen. Filter-Zellen durch das Netz durch Pipettieren in die Mitte des Membran mit enger Bohrung Tipps. Wenn die Membran gesättigt, während Filterung, entfernen Sie es, trocknen Sie die Mündung der Röhre mit einem Kimwipe, und verwenden Sie ein neues Stück Nylon-Mesh, den Rest der Zellsuspension zu filtern. Sobald alle Zellen gefiltert wurde, verwenden Sie 1 ml Quench 1:5 bis spülen Sie den Schlauch und Filter alle restlichen Zellen. </li><li> Beim Filtern abgeschlossen ist, oder beim Austausch einer verstopften Membran, verwenden Zange zu krempeln Sie die Seiten des Netzes und wischen Sie die Membran über Oberseite des Rohrs, um alle hängenden Tropfen der Zellen zu entfernen. </li><li> Pellet Zellsuspension durch Zentrifugation bei 210rcf, 4 ° C für 5 min. Absaugen Überstand und Pellet erneut in 1 ml Quench 1:5. </li><li> Filter Zellsuspension durch Nylon-Mesh in 5 ml Polystyrol-Röhrchen. Waschen Sie 15 ml Röhrchen mit 1 ml Quench 1:5 und Filter, um alle verbleibenden Zellen zu erfassen. </li></ol> 5. Probenvorbereitung für die FACS <ol&gt; <li> Wenn mit dem gleichen Gewebe zum Sortieren und zur Kompensation Kontrollen, 1/10 th bis 1/20 th des Probenvolumens auf ein neues 5 ml Polystyrol Röhrchen für die Wiedergutmachung der Steuerelemente verwenden zu übertragen. Teilen Sie den Wildtyp Gewebeprobe in zwei Teile. Ein Teil wird ungefärbt Wildtyp (WT Only) werden, während der zweiten Hälfte 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, eine fluoreszierende Interkalator von lebenden Zellen als &quot;Lebendfärbung&quot; verwendet ausgeschlossen) haben wird hinzugefügt, um es (7-AAD nur ). Diese einzelnen Kontrollen sind notwendig, um auf Ersatz aller hieraus spektrale Überlappung zwischen Emission von diskreten Fluorophore am Fluss Sorter ermöglichen. Zum Beispiel für einen einzelnen fluoreszierenden Reporter wie EGFP, würde notwendigen Kontrollen umfassen: EGFP nur, ungefärbten WT-Zellen, und ein Rohr mit 7-AAD nur (Abbildung 3) gefärbt. </li><li> Füllen Sie alle 5-ml-Röhrchen mit der Zellsuspension mit 1:5 und Quench-Zentrifuge bei 210rcf, 4 ° C für 5 min. Absaugen des Überstandes, so dass ungefähr 200 ul Flüssigkeitin Rohr. </li><li> Verdünnen Sie 7-AAD 1:1000 in Quench 1:5. Fügen Sie 7-AAD-Färbung Verdünnung auf 7-AAD nur Ausgleichs-Steuerung und Proben, die sortiert werden. Fügen Sie nicht nur auf die EGFP oder WT nur Entschädigung Kontrollen 7-AAD. Band 7-AAD hinzugefügt wird auf die Menge an Ausgangsmaterial und hat eine Größe von Zellpellet gewonnen werden, variieren. Nach 7-AAD hat, geeignete Röhrchen zugefügt wird, sind Proben bereit, sortiert werden. <table border="1"><tbody><tr><td> Gewebe </td><td> Probe Pool Size </td><td> Volume 7-AAD zu Rohr * hinzugefügt werden </td></tr><tr><td> 15,5 DPC Darm </td><td> 1-5 </td><td> 200 pl </td></tr><tr><td> 15,5 DPC LUT </td><td> 1-5 </td><td> 150 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Erzielte 7-AAD zugegeben, um verschiedene Gewebe dissoziiert * Die endgültige Summe in jedem Röhrchen wird um einen Betrag im Bereich von 50-100 &amp;mgr; variieren, da das Ansaugen von Medien ist einn ungefähren Prozess und durchgeführt, um die Pellets zu vermeiden. Abschließende Volumes werden nicht, welche die Handhabung von Zellen in der Lösung zu minimieren gemessen. </li><li> Bereiten Sammelröhrchen, um Zellen für RNA-Isolierung durch Zugabe von 0,75 ml TRIzol-LS auf 1,5 ml Reaktionsgefäßen zu erfassen. </li><li> Wenn Sammeln von Zellen in vitro-Kultur, als RNA-Isolierung, sortiert Zellen direkt in Selbsterneuerung Medien in 6-Well-Gewebekulturplatten, die mit Fibronectin beschichtet und gefüllt mit Medien, wie zuvor beschrieben. 2,6,7 </li></ol> 6. Durchflusszytometrie <ol><li> Am Durchflusszytometer, bewerten die Entschädigung Kontrollen zuerst, dass auf jeden Fall wieder zwischen jeder Probe spülen, um Verunreinigungen zu vermeiden. Verwenden Sie die Profile der Entschädigung Proben zu Spannungen / Tore für die Sortierung eingestellt. Beachten Sie, dass, wenn positive Zellen in dem Gewebe in gewünschte Begrenzung Zahlen sind, eine deutliche Gewebe verwendet werden, um Belichtungsausgleichseinstellungen solange die Fluoreszenzintensität und Zellgröße einzurichtenzwischen den Proben sind vergleichbar. </li><li> Set Kompensationsparametern und Tore, um tote Zellen, die bis zu 7-AAD-Farbstoff und sammeln Zellen, die eine hohe Intensität der GFP-Fluoreszenz relativ zu ungefärbten Steuerelemente (4) zu vermeiden. </li><li> Sortieren Sie maximal 25.000 Zellen in jedes Mikrozentrifugenröhrchen. Die Sortierung sollte bei möglichst geringen Druck mit einer großen Bohrung und Düse geringer Strömungsgeschwindigkeit (zB 17psi, 100 um Düse, 3.000 Veranstaltungen / sec) zu neuronalen Vorläuferzellen lebensfähig zu erhalten durchgeführt werden. Für Sorten EGFP +-Zellen zu isolieren, um führen wir unsere Isolierungen auf einer BD Biosciences FACSAriaII mit einem 488nm 20mW-Laser, um die EGFP-Reporter zu erregen. </li><li> Wenn die Proben hohe Konzentrationen Zelle enthalten, ist es ratsam, die Zellsuspension weitere Verwendung 1:1000 7-AAD Fleck auf höhere Wirkungsgrade zu erreichen Gefangennahme bei der Sortierung zu verdünnen. </li><li> Jedes Röhrchen von Zellen in Trizol-LS sofort nach der Sortierung erfasst. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Gewebedissoziation, um eine Zelle Suspensionen für die Sortierung Flow produzieren, ist eine heikle Balance zwischen ausreichender enzymatische Verdauung und die Vermeidung von Über-Verdauung, die in niedriger Zellvitalitäten führen kann. Ein Beispiel für gewünschte Gewebedissoziation ist in 2 gezeigt. In geeigneter Weise verdaute Gewebe vor der manuellen Verreibung Stücke von Sub-sezierten Organe sind noch deutlich zu erkennen (Abb. 2b, 2f). In Geweben, die enzymatisch zu lange Zeit oder bei einer zu hohen Konzentration des Enzyms behandelt werden, fehlt die resultierende Suspension alle restlichen große Gewebestücke (2d, 2h). Entsprechende Dissoziation und manuelle Filterung produzieren Art Profile bei der Durchflusszytometrie, die typischerweise mehr als 90% lebensfähige Zellen und zeigen ein hohes Maß an EGFP-Expression (Abbildung 4). Zellpopulationen durch dieses Verfahren erhalten illustrieren gutLebensfähigkeit und können für die spätere Kultur oder Analyse der Genexpression durch Gating werden zur Erfassung von neuronalen Vorläuferzellen EGFP + eingefangen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig1.jpg" /> Abbildung 1. Verteilung der TH-EGFP + neuronale Vorläuferzellen in der fötalen Maus LUT. Whole-mount Urogenitaltraktes bei 15,5 DPC ventral unter Hellfeldbeleuchtung angesehen (a) im Vergleich zur Verteilung von EGFP + Zellen von TH-EGFP Transgenexpression unter Fluoreszenz-Beleuchtung (b) identifiziert beschriftet. TH-EGFP-Expression ist in Nebenniere (a) und medial angeordnet Zöliakie Ganglien (cg). Seitliche (c) Blick von 15,5 DPC TH-EGFP Sub-seziert Blase Exponate Fluoreszenz von Transgenexpression in pelvinen Ganglien (PG), der Blasenwand (bla) und Harnröhre (u). In Dorsalansicht (d) EGFP + Zellen sind in der vorderen Rückenflosse Harnröhre deutlich. Andere Labels: Nieren (k), Hoden (t), Blase (bla) und Genitalhöcker (gt). <imgalt = &quot;Bild 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4188/4188fig2.jpg&quot; /&gt; 2. Hellfeld Bilder von 15 dpc fetalen LUT (a) und Darm (e), jeweils zur Hälfte abgebildet durch Dissoziation Inkubationszeit am Ende der Dissoziation Inkubation vor Störungen (b, f), nach manueller Unterbrechung (c, g) und in einer Probe, wurde übermäßig dissoziiert (d, h). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig3.jpg" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung veranschaulicht Entschädigung, die erforderlich sind, um rigorose FACS-Gating-Parameter zu etablieren. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig4.jpg" /> 4. Repräsentative Bild Strömungsrichtung Art Profilen 14.5 dpc (a) und 15,5 dpc (b). Schwarze Bevölkerung setzt sich aus einzelnen Zellen basierend auf Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht, die tot sind und gekennzeichnet durch umfasste7-AAD-Fluoreszenz. Grau Bevölkerung wird von Singulett-Zellen auf Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht, das 7-AAD ausgeschlossen haben und sind somit tragfähige Basis besteht. Grüne gated Bevölkerung wird durch boxed &quot;GFP +&quot;-Bereich angegeben und besteht aus einzelnen Zellen, die 7-AAD (lebensfähigen) ausgeschlossen haben und zeigen EGFP-Fluoreszenz zusammen.

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	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Maus-Reporter exprimieren fluoreszierenden Reporter sind eine immer stärkere Verbreitung über verschiedene Anstrengungen im murinen Genetik Gemeinde 1,8,9. Als ein Ergebnis die Dissoziation hier dargestellten Verfahren kann stark zur Isolierung von diskreten neuronalen Subtypen Neurotransmitter-Rezeptor oder Expressionsmuster von entweder fötalen oder adulten Geweben, aufgebracht werden. Während wir diese Methode auf Expression eines fluoreszierenden Reporter-Transgen Basis optimiert haben, kann es auch z...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz Namen </td><td> Verkäufer </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (MFR: Innovative Cell Technologies) </td><td> A7089-100ml </td><td> Bewahren eingefroren in 1 ml Aliquots </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Bei -20 ° C eingefroren 5 mg / ml in 1xHBSS, (Wird in Quench, Quench 1:5) </td></tr><tr><td> 10X PBS, pH 7,4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Machen Sie bis zu 1x mit Gewebekulturqualität Wasser dann Sterilfilter </td></tr><tr><td> 10x HBSS w / o Ca-oder Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Machen Sie bis zu 1x mit Gewebekulturqualität Wasser dann Sterilfilter </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin 100X </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Lagerung bei -20 ° C aliquotiert </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> -Store aliquotiert bei -20 ° C, 100 mg / ml in Wasser </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M HEPES in 0,85% NaCl </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 um NITEX Nylon-Mesh-Membran </td><td> Sefar America </td><td> 3-38/22 </td><td> Schneiden Sie in ca. 3 cm große Quadrate. UV-Behandlung über Nacht in der Gewebekultur Haube zu sterilisieren. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml Polystyrol-Röhrchen </td><td> Falke </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml konischen Röhrchen </td><td> Corning </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Feine Dissektionszangen </td><td> Fine Science Instruments </td><td> 11251-30 </td><td> Dumont Nr. 5 forcep, Dumoxel, Standard-Spitze 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Dissecting Löffel </td><td> Fine Science Instruments </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Bei der Entwicklung der Neuralleiste (NC)-abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen wandern weg von dem Neuralrohr zu autonomen Ganglien in inneren Organen wie dem Darm und der unteren Harnwege zu bilden. Sowohl während der Entwicklung und im reifen Gewebe Diese Zellen sind oft weit im gesamten Gewebe verteilt, so dass die Isolierung von diskreten Populationen mit Methoden wie Laser-Capture-Mikrodissektion ist schwierig. Sie können jedoch direkt visualisiert durch Expression von fluoreszierenden Reporter regulatorischen Regionen von Neuronen-spezifischen Gene, wie Tyrosin-Hydroxylase (TH) angetrieben wird. Wir beschreiben ein Verfahren, um hohe Ausbeuten von lebensfähigen TH + neuronalen Vorläuferzellen aus der fötalen Maus viszeralen Geweben, einschließlich Darm und unteren Urogenitaltrakts (LUT), bezogen auf Dissoziation und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) optimiert. Die Th-Gen kodiert für das geschwindigkeitsbestimmende Enzym für die Produktion von Katecholaminen. Magensaftresistente neuronalen Vorläuferzellen beginnen, während TH ausdrückenÝng ihrer Wanderung in der fetalen Darm 1 und TH ist auch in einer Untergruppe von Erwachsenen pelvinen Ganglien Neuronen 2-4. Der erste Auftritt dieser Linie und die Verteilung dieser Neuronen in anderen Aspekten der LUT und ihre Isolation ist nicht beschrieben worden. Neuronale Vorläuferzellen exprimiert TH kann leicht sichtbar gemacht durch die Expression von EGFP in Mäusen, die das Transgen-Konstrukt Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Wir abgebildet Ausdruck dieses Transgen in der fötalen Mäuse, die Verteilung der TH +-Zellen in den Entwicklungsländern LUT dokumentieren bei 15,5 Tage nach der Begattung (DPC), Benennung der Morgen des Plug-Erkennung als 0,5 DPC, und beobachtet, dass eine Teilmenge von neuronalen Vorläuferzellen in der Koaleszenz pelvinen Ganglien Express EGFP. Um LUT TH + neuronalen Vorläuferzellen zu isolieren, optimierte Methoden, die wir ursprünglich verwendet wurden, um Neuralleiste Stammzellen aus fetalem Mausdarm 2-6 zu reinigen. Vorherige Bemühungen zur NC-derived Populationen angeführten isolierenVerdau mit einem Cocktail von Collagenase, Trypsin, um Zellsuspensionen für die Durchflusszytometrie zu erhalten. In unseren Händen diesen Methoden hergestellten Zellsuspensionen aus der LUT mit relativ geringen Rentabilität. Angesichts der ohnehin schon niedrige Inzidenz von neuronalen Vorläuferzellen im fetalen Gewebe LUT, machten wir uns um die Dissoziation Verfahren, so dass das Überleben der Zelle in den letzten distanziert erhöht werden würde optimieren. Wir festgestellt, dass sanfte Dissoziation in Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc), manuelle Filterung, Sortierung und Durchfluss bei niedrigem Druck konnten wir durchweg höhere Überlebensrate (&gt; 70% der gesamten Zellen) mit anschließender Ausbeuten von neuronalen Vorläuferzellen ausreichend für Downstream-Analyse zu erzielen. Verfahren beschreiben wir können allgemein angewendet werden, um eine Vielzahl von neuronalen Populationen von entweder fötalen oder adulten Mausgeweben isolieren.

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An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Ein optimiertes Verfahren zur Neuralleiste abgeleitet neuronalen Vorläuferzellen-aus fetalen Gewebe der Maus zu reinigen, wird beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der Ausdruck von fluoreszierenden Reporter-Allele zu diskreten Populationen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zu isolieren. Die Technik kann angewendet, um neuronale Subpopulationen während der Entwicklung oder von adulten Geweben zu isolieren.

Eine optimierte Methode für Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Isolierung von Autonomic neuralen Vorläuferzellen aus inneren Organen des Fötus Mäuse

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

an-optimized-procedure-for-fluorescence-activated-cell-sorting-facs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

13.6K Aufrufe.  Vanderbilt University School of Medicine. Ein optimiertes Verfahren zur Neuralleiste abgeleitet neuronalen Vorläuferzellen-aus fetalen Gewebe der Maus zu reinigen, wird beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der Ausdruck von fluoreszierenden Reporter-Allele zu diskreten Populationen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zu isolieren. Die Technik kann angewendet, um neuronale Subpopulationen während der Entwicklung oder von adulten Geweben zu isolieren.

Serie: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Eine quantitative Assay für Zellmigration Murine Enteric neuralen Vorläuferzellen

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) und Genexpressionsanalyse von Fos-exprimierenden Neurone von Frische und Gefrorene Rattenhirngewebe

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Primärzellkultur von gereinigten Gurified GABAergic oder Glutamatergic Neuronen, die durch Fluoreszon-Sortierung gegründet wurden

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons innervating pelvic organs of rodents; the functionally equivalent structure in humans is the inferior hypogastric plexus. The major pelvic ganglia also provide the route by which lumbar and sacral sensory axons reach the pelvic organs. These complex, mixed ganglia can prove challenging to identify and dissect for further experimental study of normal autonomic mechanisms or to establish preclinical models of disease, injury or visceral pain. Here we describe a protocol to access and visualize these ganglia and their associated nerve tracts. We provide this protocol with schematics for both male and female rats, as the ganglion size and landmarks for identification differ between sexes. The protocol describes removal of the ganglion for in vitro studies, but this method can be integrated into a surgical recovery protocol for experimental interventions (e.g., nerve crush, nerve resection) or for mapping neuronal circuits (e.g., by microinjection of neural tracers). We also demonstrate the primary structures of the ganglion and its associated nerves immediately following dissection and following immunohistochemical staining.

The major pelvic ganglia contain parasympathetic and sympathetic neurons that innervate pelvic organs. Here we describe a dissection method and provide schematics for identification of these ganglia and their associated nerves. These methods can be applied to experimental manipulation of these ganglia in vivo or removal post-mortem for further study.