Humorale Immunantworten in Cardiovascular Diseases (- Diese Arbeit wurde durch den Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie Projekt ZIM-KF 2727801MD0 und das Zentrum für Innovationskompetenz unterstützt ZIK-Wanderung, BMBF FKZ 03Z2CN12) des Bundesministeriums für Bildung und Forschung, Deutschland. Gehäuse und Experimente mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Society for Laboratory Animal Science (Gesellschaft für Versuchstierkunde GV-SOLAS) und der Federation of European Laboratory Animal Science Association (FELASA) durchgeführt.

Ein. IgG Isolation aus Patientenproben <ol><li> Bereiten Mini-Immunadsorption Spalten, indem 3 ml anti-IgG-Sepharose pro 2 ml Patienten EDTA-Plasma in ein leeres Econo Pac Spalte. IgG Isolation erfordert mindestens 2 ml Patientenplasma. </li><li> Legen Sie einen Filter auf der Anti-IgG Sepharose, schnitt den unteren Spitze der Kolonne und drücken Sie die Filter, um eine Flussrate von ca. 1 Tropfen / sec erreichen. Lassen Sie die Konservierungslösung aus der Säule laufen. </li><li> Die Säule wird mit 3 Volumen 0,9% NaCl pro Volumen des Plasmas. </li><li> Pipettieren das Plasma auf der Säule. Wenn das Plasma vollständig in der anti-IgG Sepharose eingetaucht, mit dem gleichen Volumen 0.9% NaCl waschen. </li><li> Pipette ein Plasma-Volumen von 0,2 M Glycin-HCl, pH 2,8 auf der Säule und lassen eintauchen in die Sepharose. Hinzufügen Volumen von Glycin-HCl auf die Säule. Sammeln des Durchflusses durch in einem 15 ml Röhrchen und den pH auf 7,3 mit 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0. </li><li> Um die Säule zu regenerieren, Mit 3 Plasmavolumen Glycin-HCl waschen. Nach einer letzten Waschung mit 2 Volumina 0,9% NaCl, kann die Säule für die nächste Plasmaprobe verwendet werden. Alternativ kann die Säule mit Konservierungslösung gefüllt werden und bei 4 - 8 ° C für bis zu 4 Wochen. </li><li> Für den Einsatz auf Kardiomyozyten hat die gesammelten IgG-Fraktion gegen experimentelle Puffer (EB) dialysiert werden. Für die Herstellung von EB, fügen Sie 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl 2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES und 20 mM Glucose in 1 L destilliertem Wasser auf einem Magnetrührer und pH-Wert bis 7,3. </li><li> Füllen die IgG-Fraktion zu einem Celluloseester Dialysemembran Rohr mit einem Molekulargewichtsausschluß von 100 kDa geschnitten. Legen Sie den Schlauch in 1 L EB und rühren langsam mit einem Magnetrührer bei 4 ° C. Nach 8 Stunden, übertragen Sie den Dialyseschlauch in 3 L von frischem EB und Dialyse für weitere 20 h bei 4 ° C. </li><li> Nach Dialyse, Hitze die Probe 30 min bei 57 ° C in einem Wasserbad auf inaktivierte Komplementfaktoren. Bestimmen Gesamt-IgG-Konzentration und bereiten Aliquots mit 330 ug IgG jeder. Beim Hinzufügen der Probe auf Kardiomyozyten für die Messung (Schritt 4,3), füllen die Aliquots zu 1 ml mit EB. Das unverwässerte Aliquots bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden. </li></ol> 2. Isolierung von Rattenkardiomyozyten <ol><li> Zur Herstellung von Ca 2 +-freiem Puffer Isolierung (IB), add 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES und 11 mM Glucose zu 1 l destilliertem Wasser mit Hilfe eines Magnetrührers Rührer. Der pH-Wert auf 7,4 bei Raumtemperatur und durch ein 0,2 um Flasche Top-Filter für die Sterilisation. </li><li> Füllen Sie 80 ml des IB in der oberen Reservoir einer thermostatisierten Langendorff-Perfusion System. Passen Thermostateinstellungen, um einen Puffer von 37 ° C zu halten und zu belüften Puffer mit 95% O 2/5% CO 2 für 30 min. </li><li> Wiegen etwa 10.000 - 12.000 U collagenase Typ II, 175 mg fettsäurefrei BSA und in 20 ml IB mit 22,5 ul einer 100 mM CaCl 2 Stammlösung aufzulösen. Steuerung des pH-Wertes des Puffers Isolierung in das obere Reservoir und bei Bedarf justieren. </li><li> Betäuben eine Wistarratten von 175 - 200 g mit 375 ug / kg Körpergewicht Thiopental. Fügen 2500 IU Heparin Thiopental Lösung. Nach Thorakotomie, Verbrauchssteuern Herzen vorsichtig mit einer intakten Aortenbogen und übertragen sie in eiskalter 0,9% NaCl. Reinigen des Herzens aus Blut und umgebendem Gewebe und Transfer zum frischen 0,9% NaCl. Setzen Sie die Aorta, öffnen Sie das Flow Reduzierer des Langendorff System ein Fallenlassen Geschwindigkeit 2-3/sec zu erhalten und befestigen Sie das Herz der Kanüle. </li><li> Perfundieren das Herz für bis zu 3 Minuten mit einer Flussrate von 1 Tropfen / sec auszuwaschen restlichen Blut. Start, um die IB in der Langendorff System zirkulieren. Entfernen 20 ml Puffer vom oberen Reservoir, in dem Kollagenaselösung und Nachfüllung soviel Puffer als erforderlich, um 80 ml zu erreichen füllen. Circulate die c<html> ollagenase Lösung für weitere 27 min. Durchfluss sollte regelmäßig kontrolliert werden und bei 1 Tropfen / sec mit dem Flow Reduzierer gepflegt. </li><li> Lösen Sie das Herz aus der Kanüle, sauber von Atrien und Aorta und hacken in kleine Stücke schneiden. Lassen Sie die Kollagenaselösung in das untere Reservoir laufen, verringern Sie die Lautstärke auf ein Maximum von 40 ml und weitere verdauen die gehackten Ventrikel für 10 - 15 min unter ständiger Belüftung mit 95% O 2/5% CO 2. Anschließend filtern die Zellsuspension durch ein 200 um Maschenweite Gaze in ein 50 ml-Röhrchen. </li><li> Wiederherstellen der Ca 2 +-Gehalt der Zellen in 3 Schritten: zentrifugieren Zellsuspension bei 43 xg für 2 min bei Raumtemperatur und resuspendieren Zellen in 10 ml IB mit 200 uM CaCl 2. Zentrifugieren und resuspendieren Zellen in 10 ml IB mit 500 uM CaCl 2. Nach einer letzten Zentrifugation resuspendieren Kardiomyozyten in sterilfiltriert EB (siehe 1.8) bis zu einer Dichte von 50.000 Zellen / ml. </li></ol>e_title &quot;&gt; 3. Fura-2 Färbung von Kardiomyozyten <ol><li> Coat a 4 gut gekammert Deckglas mit 10 ug Laminin pro Vertiefung und warten, bis sie vollständig getrocknet ist. </li><li> Füllen 1 ml der Suspension in Kardiomyozyten jeder Vertiefung unter Verwendung einer Mikropipette mit einem Schnitt Spitze. Damit die Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur zu halten. </li><li> Verdünnen Sie 10 ul der 1 mg / ml Fura-2 AM Stammlösung in 5 ml EB. Halten Sie die Färbelösung im Dunkeln. </li><li> Take off Puffer und ungebundene Zellen aus dem Deckglas und Pipette 0,5 ml der Färbelösung in jedes Well. Inkubieren Sie die Zellen für 10 min unter mäßigem Schütteln. Anschließend nehmen Sie die Färbelösung, waschen Sie die Zellen einmal mit 1 ml EB und schließlich füllen 0,5 ml EB in jedes Well. Vermeiden Sie direktes Licht während der Färbung und immer die gefärbten Zellen im Dunkeln. </li></ol> 4. Recording of Cell Verkürzung und Ca 2 + Transienten <ol><li> Setzen Sie den Kammern Deckglas auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop microscope einem Myozyten Calcium und Kontraktilität Aufzeichnungssystem verbunden. Positionieren Sie eine maßgeschneiderte Elektrode mit einem Zustrom und Abfluss Rohr in die erste Vertiefung. Superfuse Kardiomyozyten mit 1 ml / min EB und starten Sie die elektrische Stimulation (20 V, 1 Hz, 5 ms Dauer). Damit die Zellen auf die Stimulation für ca. 2 min anzupassen. </li><li> Wählen Sie eine intakte stabförmigen Kardiomyozyten mit klaren Streifenbildung und ständige Kontraktion. Positionieren Sie die Zelle in der Mitte des Gesichtsfeldes und öffnen Sie die Kamera-Kanal. Orientieren Sie die Zelle horizontal im Video-Bereich durch Drehen der Zelle Framing-Adapter und das Bewegen des Mikroskops. </li><li> Passen Sie die Kantenerkennung Bedienelemente des Video-Bereich (Abbildung 2), öffnen Sie das fluoreszierende Kanal und Aufnahme von 10 bis 15 Kontraktionen, um die anfängliche Zellverkürzung und Ca 2 + transiente erhalten. </li><li> Schließen Sie das Mikroskop Lichtkanal zu vermeiden Bleichen der Fluoreszenz Fleck. Schalten Sie den Strom durch von EB auf die ProbeBypass mit einem 3-Wege-Ventil und superfuse Kardiomyozyten mit 1 ml Patienten IgG. Stoppen Sie die Pumpe kurz vor Luft die auch erreicht. </li><li> Öffnen Sie den Lichtkanal und aufzeichnen weitere 10 bis 15 Kontraktionen der akuten Zell-Antwort zu erhalten. Die Aufnahme zu unterbrechen und schließen Sie den Lichtkanal wieder. Wiederholen Sie die Aufnahme nach 2 und 5 min. </li><li> Nehmen Sie die Elektrode aus dem Brunnen. Reinigen Sie die Rohre gründlich mit EB und fahren Sie mit der nächsten Vertiefung der Kammern Deckglas. </li><li> Analysieren Sie die Zellverkürzung und Ca 2 + transient mit dem IonWizard Software mit dem &quot;Edge-Length/Length&quot; und die &quot;Fura 2-Numeric abgezogen / Ratio&quot;-Fenster sind. Berechnen der prozentualen Änderung von dem anfänglichen Zellverkürzung und Ca 2 + Transienten der Peakhöhe bezogen auf den Ausgangswert (bl% Spitze h) für die akute, die 2 min und 5 min der Reaktion. </li></ol>

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	<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (4), e18 (2011).</li><li>Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-heart+autoantibodies+in+familial+dilated+cardiomyopathy.">Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy.</a> Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).</li><li>Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+mechanisms+underlying+dilated+cardiomyopathy.">Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy.</a> Circ. J. 73 (4), 602 (2009).</li><li>Felix, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+effects+of+immunoadsorption+and+subsequent+immunoglobulin+substitution+in+dilated+cardiomyopathy:+Three-month+results+from+a+randomized+study.">Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).</li><li>Staudt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+immunoglobulin+G3+subclass+in+dilated+cardiomyopathy:+results+from+protein+A+immunoadsorption.">Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption.</a> Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).</li><li>Nikolaev, V. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fluorescence+method+for+the+rapid+detection+of+functional+beta1-adrenergic+receptor+autoantibodies+in+heart+failure.">A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+activating+human+beta1-adrenergic+receptors+are+associated+with+reduced+cardiac+function+in+chronic+heart+failure.">Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure.</a> Circulation. 99 (5), 649 (1999).</li><li>Gocayne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+of+rat+cardiac+beta-adrenergic+and+muscarinic+cholinergic+receptors+obtained+by+automated+DNA+sequence+analysis:+further+evidence+for+a+multigene+family.">Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).</li><li>Jaenicke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+human+beta-myosin+heavy+chain+gene+and+a+comparative+analysis+of+its+product.">The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product.</a> Genomics. 8 (2), 194 (1990).</li><li>Piper, H. M., Volz, A., Schwartz, P., Piper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , (1990).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+endothelial+cells+remodel+cultured+adult+cardiomyocytes+and+increase+their+survival.">Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival.</a> Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).</li><li>Magnusson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.+Characterization+of+antibodies+against+the+beta+1-adrenoceptor+with+positive+chronotropic+effect.">Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect.</a> Circulation. 89 (6), 2760 (1994).</li><li>Wakefield, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+in+vitro+methods+to+safety+pharmacology.">The application of in vitro methods to safety pharmacology.</a> Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).</li><li>Kajzar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+physiological+conditions+for+cell+analyses:+forces+of+heart+muscle+cells+suspended+between+elastic+micropillars.">Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars.</a> Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die vorgestellte Methode bietet einen geeigneten Weg, um funktionell wirksame kardiale Autoantikörper bei Patienten mit DCM unklarer Herkunft zu erkennen. Im Vergleich zu anderen Methoden, wie zB die Erfassung von funktionell aktiven Antikörper gegen den β1-Adrenozeptor durch ihre Auswirkungen auf die cAMP-Spiegel 6, ist unsere Methode unabhängig von einem bestimmten Epitop. Selbstverständlich gibt es andere Epitop unabhängigen Assays in der Literatur beschrieben, dh Zählen der Schlag...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Immunosorba Konservierungslösung </td><td> Fresenius Medical Care </td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase Typ 2 </td><td> Cell System </td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, fettsäurefrei </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0888 </td><td> 1 mg / ml in DMSO </td></tr><tr><td> Econo Pac Chromatographiesäulen </td><td> BioRad </td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td> Spectra / Por Biotech Cellulose Ester Dialyse Membrane </td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 4 gut Chambered Deckglas </td><td> Nunc </td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td> Myozyten Calcium und Kontraktilität Recording System </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IonWizard 6,0-Analyse-Software </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes

Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine der Hauptursachen für Herzinsuffizienz bei jüngeren Erwachsenen 1. Obwohl genetische Disposition und Exposition gegenüber toxischen Substanzen Ursachen für diese Erkrankung in etwa einem Drittel der Patienten bekannt sind, bleibt der Ursprung der DCM weitgehend unklar. In einer beträchtlichen Anzahl dieser Patienten haben Autoantikörper gegen kardiale Epitope erkannt und stehen im Verdacht, eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und Progression der Erkrankung 2,3 spielen. Die Bedeutung der kardialen Autoantikörper wird durch eine hämodynamische Verbesserung DCM-Patienten nach der Eliminierung von Autoantikörpern durch Immunadsorption 3-5 beobachtet unterstrichen. Eine Vielzahl von spezifischen Antigenen wurden bereits identifiziert und 2,3 Antikörper gegen diese Ziele können durch Immunoassays nachgewiesen werden. Allerdings können diese Assays nicht zwischen Stimulierung (und daher funktionell wirksame) und Blockieren Autoantikörpern diskriminieren. Es gibt immer mehr evidence, dass diese Unterscheidung wichtig 6,7 ist. Es kann auch angenommen werden, dass die Ziele für eine Reihe von Antikörpern kardiotropen noch unidentifizierten und daher nicht durch Immunoassays nachgewiesen werden können. Daher haben wir ein Verfahren zum Nachweis von funktionell aktiven Antikörpern kardiotropen, unabhängig von ihrer jeweiligen Antigen. Der Hintergrund für das Verfahren ist die hohe Homologie der Regel für funktionelle Bereiche der kardialen Proteinen in Säugern zwischen 8,9 beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass Antikörper gegen menschliches Herz-Antigene gerichtet wird mit nicht-humanen Zielzellen, die Prüfung von IgG aus DCM ermöglicht Patienten an adulten Rattenkardiomyozyten kreuzreagieren. Unsere Methode besteht aus 3 Schritten: Zunächst IgG aus Patientenplasma mit Sepharose gekoppelten anti-IgG-Antikörper aus Immunadsorption Spalten (PlasmaSelect, Teterow, Deutschland) isoliert. Zweitens adulten Kardiomyozyten durch Kollagenase Perfusion in einem Langendorff Perfusionsapparatur mit ap isoliertROTOKOLLS aus früheren Werken 10,11 modifiziert. Die erhaltenen Kardiomyozyten an Laminin beschichteten Deckgläsern gekammerten befestigt und gefärbt mit Fura-2, ein Calcium-selektiven Fluoreszenzfarbstoff, der leicht in die Zelle gebracht werden kann, um die intrazelluläre Calcium beobachten (Ca 2 +)-Inhalt 12. Im letzten Schritt wird die Wirkung der Patient auf dem IgG Zellverkürzung und Ca 2 + Transienten Feld stimuliert Kardiomyozyten wird online unter Verwendung eines kommerziellen Myozyten Calcium und Kontraktilität Überwachungssystem (IonOptix, Milton, MA, USA), die mit einer Standard-inversen fluoreszierenden überwachten Mikroskop.

Zwei Beispiele für die Messung der zellulären Inotropie im Feld stimuliert adulten Kardiomyozyten (Abbildung 2) unter Verwendung eines Ca 2 +-Myozyten und Kontraktilität Aufzeichnungssystem sind unten angegeben. Abbildung 3 gibt einen Eindruck einer Kontrollmessung, während in Figur 4 die Wirkung von Antikörpern kardiodepressiven eines Patienten mit DCM dargestellt. In beiden Beispielen ersten Zellverkürzung und Ca 2 +<...

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Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Die vorgestellte Methode bietet eine Möglichkeit, funktionelle wirksame kardiotropen Autoantikörpern im Plasma von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie erfassen, unabhängig von dem spezifischen Antigen, durch Analyse der Auswirkung der isolierten Immunglobulin Patienten auf zelluläre Backfett und intrazellulärem Calcium in isolierter Transienten Rattenkardiomyozyten.

Die Messung der Antikörper Auswirkungen auf zelluläre Funktion von isolierten Kardiomyozyten

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

measurement-antibody-effects-on-cellular-function-isolated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.8K Aufrufe.  University Medicine Greifswald. Die vorgestellte Methode bietet eine Möglichkeit, funktionelle wirksame kardiotropen Autoantikörpern im Plasma von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie erfassen, unabhängig von dem spezifischen Antigen, durch Analyse der Auswirkung der isolierten Immunglobulin Patienten auf zelluläre Backfett und intrazellulärem Calcium in isolierter Transienten Rattenkardiomyozyten.

Serie: Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

Die Messung der cytosolischen Ca 2 + In Isolated Kontraktile Lymphgefäße

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver (extravascular hemolysis) or leading to intravascular lysis of RBCs. Alloantibodies (e.g. ABO) or autoantibodies to RBC antigens (as seen in autoimmune hemolytic anemia, AIHA) leading to complement activation are potentially harmful and can be - especially when leading to intravascular lysis - fatal1. Currently, complement activation due to (auto)-antibodies on RBCs is assessed in vitro by using the Coombs test reflecting complement deposition on RBC or by a nonquantitative hemolytic assay reflecting RBC lysis1-4. However, to assess the efficacy of complement inhibitors, it is mandatory to have quantitative techniques. Here we describe two such techniques. First, an assay to detect C3 and C4 deposition on red blood cells that is induced by antibodies in patient serum is presented. For this, FACS analysis is used with fluorescently labeled anti-C3 or anti-C4 antibodies. Next, a quantitative hemolytic assay is described. In this assay, complement-mediated hemolysis induced by patient serum is measured making use of spectrophotometric&#160;detection of the released hemoglobin. Both of these assays are very reproducible and quantitative, facilitating studies of antibody-induced complement activation.

Here we describe two assays for measuring complement activation induced by antibodies against red blood cells. The major advantage over the current assays is their quantitative and easy-to-interpret nature.

Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that may facilitate the development of vaccines and peptide drugs. Peptide scanning is a simple and efficient method that straightforwardly maps the linear epitope recognized by a monoclonal antibody (mAb). Here, the authors present an epitope determination methodology involving serially truncated recombinant proteins, synthetic peptide design, and dot-blot hybridization for the antigenic recognition of nervous necrosis virus coat protein using a neutralizing mAb. This technique relies on the dot-blot hybridization of synthetic peptides and mAbs on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. The minimum antigenic region of a viral coat protein recognized by the RG-M56 mAb can be narrowed down by step-by-step trimmed peptide mapping onto a 6-mer peptide epitope. In addition, alanine scanning mutagenesis and residue substitution can be performed to characterize the binding significance of each amino acid residue making up the epitope. The residues flanking the epitope site were found to play critical roles in peptide conformation regulation. The identified epitope peptide may be used to form crystals of epitope peptide-antibody complexes for an x-ray diffraction study and functional competition, or for therapeutics.

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

Intraperitoneale Glucose-Toleranz-Test, Messung der Lungenfunktion und Fixierung der Lunge, um die Auswirkungen von Übergewicht und beeinträchtigter Stoffwechsel auf pulmonale Ergebnisse studieren

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

Bewertung der Antikörper-basierte Medikamente Auswirkungen auf murinen Knochenmark und peritonealen Makrophagen Aktivierung

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

Eine Methode zur Messung der Speicheldrüse Funktion bei Mäusen

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb development since its first report in 1975. As an alternative technology, phage display methods for mAb development are increasingly attractive since Humira, the first phage-derived antibody and one of the best-selling mAbs, was approved for clinical treatment of rheumatoid arthritis in 2002. As a non-animal based mAb development technology, phage display bypasses antigen immunogenicity, humanization, and animal maintenance that are required from traditional hybridoma technology based antibody development. In this protocol, we describe a method for construction of synthetic phage-displayed Fab libraries with diversities of 109-1010 obtainable with a single electroporation. This protocol consists of: 1) high-efficiency electro-competent cell preparation; 2) extraction of uracil-containing single-stranded DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkel&#39;s method based oligonucleotide-directed mutagenesis; 4) electroporation and calculation of library size; 5) protein A/L-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for folding and functional diversity evaluation; and 6) DNA sequence analysis of diversity.

This protocol describes a detailed procedure for the construction of a phage-displayed synthetic antibody library with tailored diversity. Synthetic antibodies have broad applications from basic research to disease diagnostics and therapeutics.

Bau von synthetischen Phagen Fab Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt angezeigt

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...