Dieses Protokoll ist bedeutsam, da es Forschern ermöglicht, kommerzielle oder intern hergestellte hiPSC-CMs zu einem erwachsenenähnlichen Phänotyp heranreifen zu lassen, der den prädiktiven Wert von hiPSC-CMs im Kardiotoxizitätsscreening signifikant verbessert. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es ausgereifte hiPSC-CMs in einem Hochdurchsatzformat für die optische Abbildung von Kalzium oder Spannungsänderungen liefert. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Krankheitsmechanismen zu untersuchen oder Medikamente auf Kardiotoxizität zu untersuchen.
Das Verfahren wird von Jeffrey Creech, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie damit, die reifungsinduzierende extrazelluläre Matrix (MECM) zweimal mit 200 Mikrolitern Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 1 Stunde vor der Kardiomyozytenbeschichtung zu waschen. Halten Sie die Brunnen hydratisiert.
Übertragen Sie die Kardiomyozytenröhrchen aus dem Flüssigstickstofftank in Trockeneis und lassen Sie den Druck ab, indem Sie die Röhrchenkappen leicht öffnen. Als nächstes verschließen Sie die Tubenkappen wieder und tauen Sie sie 4 Minuten lang im Wasserbad auf. Nach dem Auftauen der Zellen besprühen Sie die Röhrchen mit 70%igem Ethanol, bevor Sie sie öffnen.
Übertragen Sie die Zellen mit einer 1-Milliliter-Pipette in konische 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 1 Milliliter Beschichtungsmedium in das Kryopapier und füllen Sie die Wäsche in das konische 15-Milliliter-Röhrchen. Anschließend langsam 1 Milliliter Beschichtungsmedium abtropfen lassen und das Röhrchen umrühren.
Wiederholen Sie dies bis zum Umfüllen von 8 Millilitern Beschichtungsmedium. Zentrifugieren Sie das 15-Milliliter-Röhrchen bei 300 x g für 5 Minuten und resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter des Beschichtungsmediums. Entfernen Sie ein Aliquot und führen Sie die Lebendzellzählung mit einem Hämozytometer durch, bevor Sie ein Beschichtungsmedium hinzufügen, um 7,5 x 10 bis 5 Zellen pro Milliliter zu erhalten.
Geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension pro Well einer MECM-beschichteten 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette ab und inkubieren Sie die Zellen 2 Tage lang. Ersetzen Sie als Nächstes das Medium durch 200 Mikroliter Pflegemedium und pflegen Sie die Platten 7 Tage lang, wobei das Medium am 5. Tag gewechselt wird. Führen Sie an Tag 7 einen EP-Test durch, wie im Text beschrieben.
Achten Sie darauf, das Medium jeden zweiten Tag zu wechseln, wenn Sie sich für die Erweiterung der Zellkultur entscheiden. Um hiPSC-CM durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) zu reinigen, saugen Sie das Zellkulturmedium an und waschen Sie die Zellen mit 1 Milliliter HBSS-Methyls-Tetraessigsäure (EDTA). Inaktivieren Sie dann das Trypsin/EDTA, indem Sie die Zellen erneut senden und mit 2 Millilitern Beschichtungsmedium vereinzeln.
Aus den sechs Vertiefungen werden die Zellen mit einem 70-Mikrometer-Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Nachdem Sie das Sieb mit 3 Millilitern Beschichtungsmedium gewaschen haben, zählen Sie die Zellen. Nach dem Zählen zentrifugieren und waschen Sie das Zellpellet mit 2 Millilitern eiskaltem MACS-Trennpuffer, bevor Sie es pelletieren und die Zellen in 80 Mikrolitern kaltem MACS-Trennpuffer pro 5 x 10 an die 6. Zellen erneut senden.
Fügen Sie 20 Mikroliter kalten Cocktail zur Depletion von Nicht-Kardiomyozyten hinzu und mischen Sie die Suspension, bevor Sie sie 10 Minuten lang auf Eis inkubieren. Nachdem Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 4 Millilitern kaltem MACS-Trennpuffer bei 300 x g gewaschen haben, resuspendieren Sie das Pellet in 80 Mikrolitern kaltem MACS-Trennpuffer. Fügen Sie 20 Mikroliter kalte Antibiotin-Mikrokügelchen pro 5 x 10 zu den 6. Zellen hinzu und mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig, bevor Sie sie 10 Minuten lang auf Eis inkubieren.
Platzieren Sie während der Inkubation der Proben die mit den 30-Mikrometer-Vorabscheidungsfiltern ausgestatteten Säulen mit positiver Abreicherung auf dem MACS-Separator und platzieren Sie die beschrifteten 15-Milliliter-Sammelröhrchen unter den Säulen. Als nächstes wird jede Säule mit 3 Millilitern kaltem MACS-Trennpuffer befüllt. Mischen Sie die mit Antikörpern behandelte Zellsuspension mit 2 Millilitern MACS-Trennpuffer und geben Sie sie in die Säule.
Geben Sie 2 Milliliter MACS-Trennpuffer in jede Säule und sammeln Sie 12 Milliliter Durchfluss-Kardiomyozyten-Suspension. Zentrifugieren Sie die Kardiomyozyten und verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie die Kardiomyozyten in einem 1-Milliliter-Beschichtungsmedium resuspendieren. Um die Konzentration zu bestimmen, zählen Sie die Zellen und stellen Sie das Volumen auf die gewünschte Seeding-Dichte ein, bevor Sie die gereinigten Kardiomyozytenzellen auf die MECM 96-Well-Platten plattieren.
Aspirieren und ersetzen Sie das Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium durch 100 Mikroliter spannungsempfindliche Farbstoffe (VSD) oder kalziumempfindliche Fluorophore (CSF) pro Vertiefung einer 96-Well-Platte. Ersetzen Sie die Farbstoffe nach 30 Minuten Inkubation durch ein Assaymedium oder HBSS. Gleichen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius aus, bevor Sie mit einem optischen Kartierungsgerät mit hohem Durchsatz eine optische Kartierung der Basisdaten erfassen.
Um die Zellen mit Medikamenten für akute Expositionstests zu behandeln oder die Zellen zu kartieren, die chronisch den interessierenden Medikamenten ausgesetzt sind, verdünnen Sie die Medikamente in Dimethylsulfoxid oder DMSO und lagern Sie sie als Stammlösungen bei 20 Grad Celsius, bevor Sie sie in HBSS auf die gewünschten Konzentrationen verdünnen. Für Kardiotoxizitätstests in 96-Well-Platten werden vier Dosen einer Verbindung mit mindestens acht Wells pro Dosis hinzugefügt. Verwenden Sie Dosen, die von unterhalb bis oberhalb der klinisch wirksamen therapeutischen Plasmakonzentration reichen, einschließlich der effektiven Dosis.
Ähnlich wie bei den elektrophysiologischen Basismessungen vor der Anwendung des Medikaments sollten elektrophysiologische Aufzeichnungen mindestens 30 Minuten nach der medikamentösen Behandlung für chronische Studien erfasst werden. Nach der Baseline-Aufzeichnung werden mindestens vier Dosen jedes Medikaments auf reife hiPSC-CMs-Monolagen, die GCaMP6m exprimieren, mit mindestens acht Vertiefungen pro Dosis appliziert. Bringen Sie die Medikamente 30 Minuten lang auf die Zellen und erwärmen Sie die Zellen vor und während der Datenerfassung auf 37 Grad Celsius.
Nach Baseline-Aufnahmen einer ganzen Platte werden 500 nanomolare Isoproterenol in jede Vertiefung gegeben, um robuste Daten zum Ansprechen auf das Arzneimittel zu erhalten und die Auswirkungen von Isoproterenol auf die Monolagenschlagrate, die Kontraktionsamplitude und die vorübergehende Dauer von Kalzium zu quantifizieren. Um optische Mapping-Daten zu erfassen, öffnen Sie die vordere Schublade und positionieren Sie die Platte auf der Plattenheizung. Nachdem Sie die Erfassungssoftware geöffnet und den Speicherort für die Datei in der Software festgelegt haben, wählen Sie die Dauer von 10 bis 30 Sekunden und die Bildrate der Erfassung, um eine höhere zeitliche Auflösung zu erzielen, und klicken Sie auf Erfassung starten.
Öffnen Sie die Analysesoftware, und wählen Sie auf der Registerkarte Importfilter entweder Nach einer einzelnen Datei suchen oder Mehrere kacheln, um eine Platte zu rekonstruieren. Wählen Sie die Dateien aus, geben Sie eine Anzahl von Zeilen und Spalten ein und wählen Sie Automatisch aus. Wählen Sie als Nächstes Pixelgröße aktualisieren, geben Sie den Abstand pro Pixel ein und verwenden Sie den Well-Assistenten, um die Position der Wells im Bild zu bestimmen, bevor Sie auf "Speichern verarbeiten" klicken und zur nächsten Registerkarte wechseln.
Öffnen Sie die Registerkarte ROIs oder Regions of Interest und wählen Sie, ob Sie die ROIs manuell, automatisch oder gar nicht für ROIs zeichnen möchten, die für die Analyse der gesamten Platte berücksichtigt werden. Nachdem Sie die Region im Feld ausgewählt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Speichern", um mit dem nächsten Schritt fortzufahren. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Vertiefungen ausblenden und Nur gefilterte anzeigen, um die ROIs zu visualisieren.
Öffnen Sie die Registerkarte "Analyse" und wählen Sie jedes Well oder jeden ROI aus, um die Genauigkeit der automatischen Beat-Erkennung zu bestätigen. Fügen Sie Beats zu den Spuren hinzu oder entfernen Sie sie, indem Sie einen einzelnen Beat auswählen und die Entf-Taste auf der Tastatur drücken. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Speichern.
Klicken Sie anschließend auf der Registerkarte Analyse auf die Schaltfläche Zeit-Raum-Diagramm und fügen Sie die Linie hinzu, um das Zeit-Raum-Diagramm zu bestimmen, um die Daten für jedes Well oder den ROI zu visualisieren. Nachdem Sie eine horizontale oder vertikale Linie ausgewählt haben, klicken Sie auf Plot generieren. Nachdem Sie die genaue Beat-Erkennung sichergestellt haben, fahren Sie mit der Registerkarte Exportieren fort und wählen Sie Dateiformat, geben Sie die Option Beat-Statistik ein, bevor Sie auf Exportieren klicken.
Öffnen Sie nach dem Export die Datendateien und führen Sie die ausgewählte statistische Analyseroutine aus. Die Phasenkontrast-Bildgebung zeigte, dass die hiPSC-CMs, die auf dem MECM plattiert wurden, reiften und sich strukturell von der gleichen Charge von hiPSC-CMs unterschieden, die auf dem Maus-ECM neu plattiert wurden. Reife Zellen wurden stäbchenförmig, während unreife Zellen eine kreisförmige Form behielten.
Kardiomyozyten, die mit Alpha-Aktinin-Antikörpern gefärbt wurden, zeigten die typische Form der Zellen, die bei jeder EZM-Erkrankung kultiviert wurden. In Übereinstimmung mit der TnI-Färbung deutete die alpha-Aktinin-Färbung darauf hin, dass die auf dem MECM gereiften hiPSC-CMs einen stäbchenförmigen, reifen Phänotyp förderten und eine größere Sarkomerorganisation induzierten. Der mitochondriale Inhalt und die Aktivität unterschieden sich zwischen den Zellen, die auf der Maus-ECM und dem MECM kultiviert wurden.
Die elektrophysiologischen Daten für Aktionspotentiale, die mit VSDs und dem optischen Mapping-System aufgezeichnet wurden, zeigten, dass die atrial-spezifischen Zellen eine signifikant schnellere spontane Schlagrate und eine kürzere Aktionspotentialdauer (APD80) aufweisen als die ventrikulären spezifischen Zellen. Heatmaps für die gesamte Platte für Parameter wie APD80 zeigten die Reproduzierbarkeit eines bestimmten Parameters innerhalb einer Platte. Typische Aktionspotentiale reifer hiPSC-CM-Monolagen zeigten die Aktionspotentialmorphologie isolierter und getesteter adulter Kardiomyozyten an.
Ein typischer Aktionspotential, ein spontaner Rhythmus, zeigte sich ebenfalls. Als Reaktion auf Isoproterenol führte die Aktivierung der beta-1-adrenergen Rezeptoren zu einer positiven Chronotropie, einer positiven Inotropie und einer positiven Lusitropie. Die HiPSC-CM-Antwort auf humane Ether-a-go-go-related gene (hERG)-Kanalblocker, einschließlich E-4031, Domperidon, Vandetanib und Sotalol, wurde mit GCaMP6m-Kalziumfluoreszenz untersucht, um den Rhythmus zu überwachen.
Die Studie zeigte die Detektion von frühen Nachdepolarisationen, die durch die Blockade des E-4031 hERG-Kanals verursacht werden. Arbeiten Sie schnell mit den Zellen in Suspension und vermeiden Sie Scherspannungen, indem Sie die Zellen schonend pipettieren. Führen Sie außerdem den Medienwechsel sorgfältig durch, um eine Schädigung der hiPS-Synzytie zu vermeiden.
Nach diesem Verfahren können die Zellen Proteine, RNA, DNA und Lipide sammeln, um sie mit der von den Forschern bevorzugten Technik zu analysieren. Die Technik ermöglicht es Forschern, Krankheiten zu untersuchen und die Kardiotoxizität neuer Medikamente mit adulten Kardiomyozyten zu testen.
