Unser Protokoll beschreibt ein zuverlässiges System zur Messung der Kontraktilität in adulten humanen primären Kardiomyozyten. Bei unserem System handelt es sich um eine nicht-invasive optische Aufzeichnungsmethode mit mittlerem Durchsatz, die kontinuierlich die Kontraktilität mehrerer Zellen parallel misst und die Verfolgung von Arzneimittelwirkungen in Echtzeit ermöglicht. Unsere Methoden unterstützen die Entdeckung neuartiger Moleküle mit dem gewünschten Profil für die Korrektur von Herzinsuffizienz.
Es bietet auch einen präklinischen Ansatz zur Vorhersage von arzneimittelinduzierten Kontraktilitätsrisiken. Legen Sie zunächst ein einzelnes Deckglas in jede Vertiefung einer Acht-Well-Kulturplatte. Bereiten Sie fünf Mikrogramm pro Milliliter Laminin vor, indem Sie 800 Mikroliter des humanen rekombinanten Laminin 521 zu 7,2 Millilitern Lösung B hinzufügen und gut mischen.
Geben Sie 200 Mikroliter der verdünnten Lamininlösung in die Mitte des Deckglases. Den Teller abdecken und in einem vier Grad Celsius warmen Kühlschrank stapeln. Dimethylsulfoxid oder DMSO 1000-fach in Lösung C verdünnen, um eine 0,1%ige DMSO-Vehikellösung herzustellen.
Um die Verbindung mit dem Ein-, 10-, 100- und 1000-fachen ihrer therapeutischen Exposition von 0,001 Mikromolaren zu testen, lösen Sie die Verbindung in DMSO bei einer Konzentration von einem Millimolar auf. Verdünnen Sie die DMSO-Testverbindungslösung nacheinander mit DMSO, um drei weitere Stammstoffe herzustellen. Zum Schluss wird jede 1000 Jahre alte Testverbindung in 50 Milliliter Lösung C verdünnt, um die endgültigen Testkonzentrationen zu erhalten.
Die Vehikellösung und die Lösungen der mikromolaren Endkonzentrationen der Verbindung werden in 50-Milliliter-Spritzen gegeben. Schließen Sie die Spritzen an das Schwerkraftflusssystem an und bereiten Sie dann das Schwerkraftflusssystem vor. Nehmen Sie eine Acht-Well-Platte mit einem laminatbeschichteten Deckglas aus dem Kühlschrank und legen Sie ein Deckglas in eine saubere Aufnahmekammer.
Stellen Sie den Teller bis zum nächsten Anrichten wieder in den Kühlschrank. Saugen Sie Lösung B aus der eskalierten Durchstechflasche an, um das kleinste Volumen zu erreichen, ohne Zellen zu verlieren. Geben Sie dann 200 Mikroliter der Zelllösung in die Aufzeichnungsmikroskopkammer, die auf dem Tisch eines inversen Mikroskops montiert ist, und lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang auf dem Deckglas absetzen.
Öffnen Sie als Nächstes das Sichtfeld des Mikroskops und stellen Sie fest, ob die Zelldichte für den Beginn des Versuchslaufs ausreicht. Sobald die Beschichtung abgeschlossen ist, werden die Zellen fünf Minuten lang ins Gleichgewicht gebracht, indem sie unter Verwendung des Schwerkraftfluss-Perfusionssystems kontinuierlich mit Lösung C perfundiert werden. Stellen Sie die Absaugung richtig ein, schalten Sie den Temperaturregler und eine Heizplatte ein und stellen Sie sie auf 35 Grad Celsius ein.
Stimulieren Sie dann die Zellen an einem Feldstimulator mit einem Paar Platindrähte, die auf gegenüberliegenden Seiten der Kammer platziert sind, mit einer überschwelligen Spannung mit einer Schrittfrequenz von einem Hertz. Stellen Sie die Amplitude des stimulierenden Impulses auf ein Volt ein und erhöhen Sie sie, bis die Kardiomyozyten beginnen, Kontraktions-Entspannungs-Zyklen zu erzeugen. Wählen Sie gesunde Zellen mit stäbchenförmiger Morphologie und deutlichen Streifen aus, passen Sie dann das Sichtfeld an und konzentrieren Sie sich darauf, so viele kontrahierende Zellen wie möglich ins Blickfeld zu bringen.
Als nächstes werden die digitalisierten Bilder der Zellen in der Erfassungssoftware des optischen Kontraktilitätsaufzeichnungssystems angezeigt. Vermeiden Sie bei der Auswahl des Bereichs of Interest oder der ROIs unscharfe Bereiche und Bereiche in der Nähe des Zellenrands. Starten Sie das Experiment, um die Wirkung der Verbindung zu bewerten.
Die Erfassungssoftware verwaltet die Datenerfassung. Automatische Anzeige und Beschriftung von Testkonzentrationen und Behandlungszeit. Die Prüfkonzentrationen sind anzuwenden, wenn die Kontraktion während des gesamten Bezugszeitraums des Fahrzeugs in einer stabilen Amplitude bleibt.
Disqualifizieren Sie Zellen, die entweder einen Anlauf oder einen Rundlauf anzeigen. Führen Sie eine Offline-Analyse mit der Analysesoftware und einem benutzerdefinierten Makro durch, um den Durchschnitt der Daten zu bilden. Die Software berechnet und meldet verschiedene Metriken aus den von der Erfassungssoftware erzeugten Sarkomerdynamikdaten.
Quantifizierung der Auswirkungen der Testverbindung auf die durchschnittliche Kontraktilitätsamplitude im Verhältnis zu den spezifischen Ausgangsbedingungen der Fahrzeugkontrolle jedes Kardiomyozyten. Drücken Sie die durchschnittlichen Ergebnisse als mittleres Plus/Minus-REM aus und erstellen Sie ein Diagramm, das den Konzentrationseffekt der Testverbindung auf die Kontraktilitätsamplitude darstellt. Passen Sie dann die Konzentrationsantwortkurve an die Hügelgleichung an, um IC50- und EC50-Werte abzuleiten.
Als nächstes wird die Nachkontraktion als spontane sekundäre Kontraktionstransiente des Kardiomyozyten identifiziert, die vor der nächsten regulären Kontraktion auftritt und eine abnormale und unsynchronisierte Kontraktion hervorruft. Identifizieren Sie Kontraktionsversagen als die Unfähigkeit des elektrischen Stimulus, eine Kontraktion zu induzieren. Visualisieren Sie die kurzfristige Variabilität (STV) und Alternans in Poincaré-Diagrammen der Kontraktionsamplitudenvariabilität.
Berechnen Sie den STV mit den letzten 20 Transienten jeder Kontroll- und Prüflingskonzentrationsperiode. Identifizieren Sie dann Alternane als repetitive, abwechselnd kurze und lange Kontraktilitätsamplitudentransienten. Um die Inzidenzen von Pro-Arrhythmien zu berechnen, normalisieren Sie die STV-Werte auf den Vehikelkontrollwert jeder Zelle, zeichnen Sie Nachkontraktion, Kontraktionsversagen, STV und Alternans auf und drücken Sie sie als Prozentsatz der Inzidenz von Zellen aus, die jedes der Signale aufweisen.
Ergänzen Sie die multiparametrische mechanistische Profilierung mit der Berechnung der Zeit bis zum Peak, des Zerfalls auf 30 %, dann 90 % der Relaxation, der Zeit bis 90 % der Relaxation, der Basislänge des Sarkomers, der Zeit bis zum 50 %Peak, der Peakhöhe, der Sarkomerlänge bei maximaler Kontraktilität, der maximalen Kontraktionsgeschwindigkeit und der maximalen Relaxationsgeschwindigkeit. Drücken Sie dann diese Parameter relativ zu den spezifischen Ausgangskontrollbedingungen jedes Kardiomyozyten aus und stellen Sie sie in Konzentrations-Reaktions-Diagrammen dar. Diese Studie zeigt die Validierung der Messung der Kontraktilität menschlicher Kardiomyozyten und die Wirkung der beta-adrenergen Stimulation.
Es gab keine spontanen Kontraktilitätstransienten in menschlichen Kardiomyozyten, und die Kardiomyozyten reagieren auf externe elektrische Stimulation mit Kontraktilitäts-Relaxations-Zyklen sowie auf Isoproterenol, einen beta-adrenergen Agonisten. Das Isoproterenol bewirkt eine konzentrationsabhängige Erhöhung der Kontraktilität, und seine Auswirkungen auf die Kinetik der transienten Kontraktilität wurden ebenfalls charakterisiert. Nach der Messung der Kontraktilität können wir die Messung des transienten Kalziums mit einem Fluoreszenzindikator durchführen.
Solche Daten helfen zu bestimmen, ob eine Änderung der Kontraktilität eine Änderung der Kalziumdynamik erfordert. Unsere Methode ebnet der Herzforschung den Weg, um ein besseres Verständnis der Physiologie und Pharmakologie menschlicher Kardiomyozyten zu entwickeln, Struktur, Aktivität und Beziehungen neuartiger Medikamente zu etablieren und ihren Wirkmechanismus zu erforschen.
