Wir haben eine einfache Langendorff-freie Methode entwickelt, um einzelne Mausherzzellen durch eine antegrade Verpackungstechnik zu isolieren. Diese Methode ermöglicht die Isolierung von Herzzellen von juvenilen zu älteren Mäusen. Die retrograde Perfusion auf Langendorff-Basis gilt als Goldstandard für die Isolierung von Herzmyozyten bei verschiedenen Versuchstieren.
Die Kannulation des LTA ist bei Mäusen aufgrund ihrer geringen Größe jedoch technisch schwierig. Für die Mausherzernte öffnen Sie nach bestätigung der Euthanasie und Rasur des Bauches die Brusthöhle schnell, um das Herz freizulegen, und verwenden Sie eine Kunststofftransferpipette, wobei die Spitze auf ungefähr die Größe des Herzens zugeschnitten ist, um das Herz in die Pipette zu saugen. Heben Sie die Pipette an, um genügend Platz zum Einsetzen einer gekrümmten Schere zu schaffen, und verwenden Sie die Schere, um das Herz von der Rückenseite zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die Vorhöfe nicht zu beschädigen.
Legen Sie das Herz sofort für etwa eine Minute in ein 30-Milliliter-Glasbecherglas, das eiskaltes CIB-EGTA enthält. Wenn die Kontraktionen aufgehört haben, legen Sie das Herz in eine 35-Milliliter-Kulturschale mit eiskaltem CIB-EGTA und entfernen Sie die Lunge und anderes sichtbares Gewebe. Legen Sie das grob gereinigte Herz auf einen Herzständer, der mit gekühlter CIB-EGTA-Spitze gefüllt ist, mit der Seite nach unten und stellen Sie den Ständer unter ein stereoskopisches Mikroskop.
Entfernen Sie das Fett und das Bindegewebe um die Aorta herum. Wenn die Länge der geschnittenen Aorta zu lang ist, schneiden Sie die Aorta direkt unter der Brachiocephalusarterie ab und richten Sie das Herz so aus, dass die vordere Oberfläche nach vorne zeigt. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Ende der Aorta anzuheben, und verwenden Sie eine kleine Gefäßklemme, um die Aorta in der Nähe der Vorhöfe zu klemmen, während Sie sanft auf die Vorhöfe drücken.
Dann legen Sie das eingeklemmte Herz auf eine Perfusionsplatte mit der vorderen Seite nach oben und hydratisieren Sie das Herz mit ein paar Tropfen CIB-EGTA. Für eine antegrade Perfusion laden Sie eine 20-Milliliter-Spritze mit vorgewärmtem CIB-EGTA, die mit einem flexiblen Verlängerungsrohr und einer markierten Injektionsnadel verbunden ist, auf die Infusionspumpe und starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 0,5 Milliliter pro Minute. Wenn die Nadel und die Pumpe gefüllt sind, legen Sie die Injektionsnadel auf die Perfusionsplatte mit der kürzeren Seite der diagonalen Form nach vorne und schieben Sie die Nadel, bis sie nur noch die Spitze des Herzens berührt.
Führen Sie die Nadel vorsichtig in der Nähe der Spitze des linken Ventrikels in die Kammer ein, ohne die Nadel von der Platte zu verdrehen oder zu lösen, und beobachten Sie die Markierung, um die Tiefe des Nadeleinführungs zu schätzen. Wenn die Nadeleinführung abgeschlossen ist, sollte Blut aus der Koronararterie fließen. Verwenden Sie Klebeband, um die Injektionsnadel an der Platte zu befestigen und die Pumpendrehzahl auf einen Milliliter pro Minute zu erhöhen.
Wenn das Herz erfolgreich durchblutet wird, sollte der Fluss des Puffers in der Kapillare direkt unter dem Epikard sichtbar sein. Nach zwei bis drei Millilitern CIB-EGTA-Perfusion ersetzen Sie den Perfusionspuffer durch eine Enzymmischung. Nachdem ein bis zwei Milliliter durchblutet wurden, erhöhen Sie die Pumpendrehzahl auf 1,5 Milliliter pro Minute.
Verwenden Sie eine Pipette, um das angesammelte bluthaltige Perfusat, das aus dem Herzen fließt, bei Bedarf zu entfernen und die Perfusion zu stoppen, wenn das Gesamtvolumen des perfundierten Enzyms 10 Milliliter erreicht. Am Ende der Perfusion 10 Milliliter Enzymmischung von der Spritze in eine 60-Millimeter-Kulturschale auf einer Heizmatte übertragen und 20 Milligramm BSA in die Schüssel geben. Schwenken Sie die Schüssel vorsichtig, um das Pulver aufzulösen und entfernen Sie die Injektionsnadel und die Klemme vom Herzen.
Entfernen Sie die Ventrikel und Vorhöfe aus dem Herzen und legen Sie das Gewebe in die BSA-ergänzte Enzymmischung. Um die ventrikulären Myozyten zu isolieren, verwenden Sie zwei Pinzettenpaare, um das Epikard zu greifen und ziehen Sie die Ventrikel vorsichtig in kleine Stücke. Wenn alle Ventrikelfragmente erzeugt wurden, dispergieren Sie die Zellen etwa 30 Mal mit sanftem Pipettieren und filtern Sie die unverdauten Trümmer durch ein 100 Mikrometer-Netzzellsieb in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Nach der Zentrifugation das Kardiomyozytenpellet in vorgewärmter CIB, ergänzt mit Kalzium und BSA, wieder aufsetzen und die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren die gefällten Kardiomyozyten in einem geeigneten Volumen zellresuspensionslösung für ihre Erhaltung bei 37 Grad Celsius bis zur nachgeschalteten Analyse. Um die Vorhoffyrozyten zu isolieren, übertragen Sie die Vorhöfe in einen Behälter mit vorgewarmter CIB, der mit Kalzium und BSA ergänzt wird, und zerreißen Sie die Vorhöfe in Stücke, wie gezeigt.
Verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Pipette, die auf 10 Mikroliter eingestellt ist, um das Gewebe durch Pipettieren zu stören und die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Dann resuspendieren Sie die Vorhoffnungszelle in einem geeigneten Volumen der Zellresuspensionslösung. In diesem Bild können frisch isolierte ventrikuläre Myozyten beobachtet werden.
Dieses Isolationsverfahren führt zu einer Ausbeute von 70 bis 80% stäbchenförmiger ruheventrikulärer Myozyten von acht bis 10 Wochen alten Mäusen innerhalb von etwa fünf Stunden nach der Isolierung. Das Verhältnis von frisch isolierten lebensfähigen Zellen ist bei Mäusen, die älter als zwei Jahre sind, niedriger. Die in den ventrikulären und vorhoflichen Myozyten aufgezeichneten Aktionspotentiale ähneln denen, die in Zellen gemessen wurden, die mit der Langendorff-basierten Methode gewonnen wurden.
Die immunanreichernde Analyse kann verwendet werden, um die Organisation der sarkomerischen Struktur der ventrikulären Myozyten und die Umwandlung der kardialen Fibroblasten in Myofibroblasten nach Subkultur zu beurteilen. Die Western-Blot-Analyse wird empfohlen, um die spezifische Expression von Proteinen von Interesse in den Vorhöfen und Ventrikeln nach der Verarbeitung zu bestimmen. Nach der Perfusion mit Enzymen können Proteine aus den Vorhöfen und Ventrikeln leicht im Lysepuffer mit leichter Kraft zur Proteinextraktion homogenisiert werden.
Es ist wichtig, die Richtung und die Tiefe des Nadeleinführungs zu kontrollieren. Achten Sie beim Einführen der Nadel in den linken Ventrikel darauf, das Ventrikelseptum nicht zu durchbohren oder in die Klappe einzudringen. Sie können die Zusammensetzung des Perfusats je nach Zweck des Experiments ändern.
Zum Beispiel kann ein EGTA-ergänztes Reinigungsmittel verwendet werden, um ein zellfreies Gerüst des Herzens herzustellen.
