Unterstützte teilweise durch R01NS064593 und R21ES016636 (KV). Mikroskopie wurde an der VCU durchgeführt - Department für Neurobiologie und Anatomie Microscopy Facility, unterstützt, zum Teil mit Mitteln aus NIH-NINDS zentralen Kern Gewährung 5P30NS047463. Das Spinning Disc konfokalen Mikroskop wurde mit einem NIH-NCRR award (1S10RR027957) erworben.

A. Cell Preparation <ol><li> Normale menschliche Fibroblasten (GM02270) wurden aus Coriell Zelle Repository, Camden, New Jersey, erhalten und verewigte mit hTERT 6. Die Zellen wurden gezüchtet und in CellStar expandiert 6-cm-Schalen in Medien (4 ml) bestehend aus MEM mit 20% fötalem Rinderserum (GIBCO), non-essential/essential Aminosäuren, Vitamine, Natriumpyruvat, und Penicillin / Streptomycin (HyClone ergänzt ). </li><li> Menschliche embryonale Nieren-293 (HEK293) Zellen wurden von American Type Culture Collection erhalten und gezüchtet und in CellStar 6-cm-Schalen erweitert. Die Zellen wurden in Medien (4 ml) bestehend aus DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, nicht-essentielle Aminosäuren, L-Glutamin und Penicillin / Streptomycin gehalten. </li><li> 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene Plasmid 19.836) und H2B-GFP (PCLNR-H2BG; Addgene Plasmid 17.735) Fusionsgen Konstrukte auch exprimieren Puromycin oder G418-Resistenz-Gene wurden jeweils transduziert (fibroblaM.) oder transfizierten (HEK293) mit SuperFect (Qiagene) in Zellen und gepflegt unter Drogen Auswahl. Wartung der Fluoreszenz wurde periodisch überprüft. </li><li> 24-48 Std. vor Bildaufnahme, wurden Zellen in eine Einzelzell-Suspension trypsiniert und ausgesät in einer niedrigen Dichte auf 3,5-cm FluroDish Glasbodenplatten. </li></ol> B. Mikroskop Setup und Image Acquisition Dieses Protokoll wurde entwickelt, mit dem Zeiss Cell Observer SD Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop mit einem AxioObserver Z1 Stand, ein Dual-Channel-Yokagawa CSU-X1A 5000 Spinning-Disk-Einheit, 2 Photometrics QuantEM 512SC emCCD Kameras, ein HXP 120C Faser-basierten Illuminator, 4 ausgestattet Laser (a Lasos 100mW mehrzeiligen Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm Diode, 40 mW 561 nm Diode und 30 mW 635 nm Diode), AOTF ein Pecon XL multiS1 Stufe Inkubationssystem, Zeiss Inkubation Module (O 2-Modul S, CO 2-Modul S, TempModul S, Heating Unit XL S) und einer Vor mozed XY Bühne mit einer NanoScanZ Piezo Z-Einsatz. Um sphärische Aberrationen zu minimieren, während Bildgebung lebende Zellen in einem wässrigen Medium, einem C-Apochromat 63x/1.20 Wasser / Corr Objektivlinse und Zeiss Immersol W Immersionsflüssigkeit (mit einem Brechungsindex n = 1,334) gelagert wurden verwendet. Für 2-Kanal konfokale Abbildung, eine RQFT 405/488/568/647 dichroitischen Spiegel und BP525/50 (grün) und BP629/62 (rot) Emissionsfilter wurden verwendet. Die System-Software verwendet wurde, war Zeiss Axiovision (Version 4.8.2.0) mit AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Physiologie, MosaiX, Mark &amp; ​​Find, Dual-Kamera, Inside 4D, Autofokus und 3-D Dekonvolution Module. <ol><li> Sicherzustellen, dass CO 2-Gas mit dem CO 2-Modul der Inkubation System läuft. Wenn das Mikroskop durch einen Anti-Vibrations Lufttisch unterstützt wird, auf der Luftzufuhr (oder N 2-Gas) für das Lufttisch einzuschalten. </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung für das Stativ, Spinning-Disk-Einheit, Kameras, Inkubation Module, HXP Illuminator, motorisierten Bühne, ArgonLaser und Computer. </li><li> Nach 1 min Aufheizzeit, drehen Sie den Zündschlüssel für den Argon-Laser auf &quot;On&quot;. </li><li> Auf dem Zeiss Laser Bedienfeld auf den Schalter für die Laser-Linien genutzt werden kann. </li><li> Schalten Sie den Schalter für die Lasos Argon-Laser-Controller von &quot;Standby&quot; auf &quot;Laser run&quot; und stellen Sie die Licht-Controller auf das optimale Niveau (dh knapp unterhalb der Stelle, wo die grüne Anzeige leuchtet rot). </li><li> Starten Sie die Software AxioVision. Hinweis: die Benutzeroberfläche für AxioVision kann mit Fenstern und Pull-Down-Menüs, die spezifisch für die jeweilige Mikroskop und Komponenten, die es steuert sich den Kundenwünschen angepasst werden. Als solche hat jedes System eine potenziell einzigartige Schnittstelle. Daher sind allgemeine Anweisungen für die Software-Manipulation in den nachfolgenden Schritten vorgesehen, anstatt Richtungen für spezifische Software-Fenster, Tabs und / oder Pull-down-Menüs. </li><li> Ungefähr 1 Stunde vor der Bildgebung in der Software, Finden die Bedienelemente für den Inkubator undEinschalten der Heizung für die obere Kammer und der Tischplatte. Stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Schalten Sie den CO 2-Steuerung und den Pegel bei 5%. </li><li> Wählen der Objektivlinse zum Abbilden. In dieser Studie wurde ein 63x/1.20 NA C-Apochromat Wasser / Corr Objektivs verwendet. Hinweis: Für dieses Objektiv, ein Immersionsmedium mit einem ähnlichen Brechungsindex Wasser (Zeiss Immersol W Immersionsflüssigkeit) benötigt. </li><li> Wenn mehrere getrennte Positionen über einen langen Zeitraum hinweg abgetastet werden, sicher sein, um eine ausreichende Menge an Immersionsmedium anwenden, um sicherzustellen, dass sie von einer Position zu einer anderen durchgeführt wird. </li><li> Setzen Sie die Schüssel auf der Bühne und bringen das Objektiv bis in Kontakt mit dem Boden. </li><li> Verwenden Sie entweder das Mikroskop Kontrollen oder die Software, leiten das emittierte Licht zu den Okularen und wählen Sie die entsprechende Weitfeld Filter für das Fluoreszenz-Signal von Interesse (für diese Studie, &quot;Red&quot;-Filter für 53BP1 und einem &quot;GFP&quot;-Filter gesetzt für H2B gesetzt ). &lt;/ Li&gt; <li> Blick durch die Augenlinsen, das Bild scharf, und suchen Sie einen geeigneten Bereich der Zellen. </li><li> Verwenden Sie entweder die Software oder das Mikroskop Kontrollen richten das emittierte Licht von der Okulare in den Hafen mit dem konfokalen Spinning Disc Einheit. </li><li> In der Software auf den entsprechenden Laser (für diese Studie, die 561 nm Laser für 53BP1 und der 488 nm-Linie des Argon-Laser für H2B) drehen. </li><li> Für jeden Kanal, um die Intensität des Lasers durch Einstellen der akustooptische abstimmbare Filter (AOTF)-Steuerung auf einen geeigneten Pegel. </li><li> Wählen Sie den entsprechenden dichroitischen Spiegel (RQFT 405/488/568/647) und Emissionsfilter (BP 629/62 für 53BP1 und BP 525/50 für die H2B). Öffnen Sie den Rollladen in die sich drehende Scheibe Einheit. </li><li> Wählen Sie die &quot;Live&quot;-Fenster, um das aktuelle Sichtfeld angezeigt. </li><li> In der Software, öffnen Sie die &quot;Kamera&quot;-Steuerung, wählen Sie die Kamera verwendet werden (wenn ein Dual-Kamera-System) und die Belichtung der Zeit auf etwa 100 ms. Passen Sie die% und EM zu gewinnen, wie ang. Essary Hinweis: Die 53BP1-mCherry Konstrukt erscheint etwas dunkler. Wir fanden es hilfreich, die EM gewinnen zu erhöhen. </li><li> In der Software, öffnen Sie die Steuerung für die konfokale Spinning Disc-Einheit und stellen Sie den drehenden Scheibe Geschwindigkeit durch Eingabe der Kamera-Belichtungszeit, die auf ein geeignetes Bild (zB ~ 100 ms) zu erfassen war. Klicken Sie auf &quot;Set&quot; in der Änderung zu sperren. </li><li> Öffnen Sie &quot;multi-dimensionale Erfassung&quot;. Wählen Sie den Kanal Registerkarte und laden / Auswahl geeigneter Kanäle. Für diese Studie verwenden wir Kanäle für dsRed (561 nm Laser-Anregung und BP 629/62 Filter für Emission) und GFP (488 nm Laserlinie für die Anregung und BP525/50 Filter für Emission) definiert. </li><li> Um Bildregistrierung zu gewährleisten, wurde eine gemeinsame dichroitischen Spiegel (RQFT 405/488/568/647) für beide Kanäle verwendet. Stellen Sie die Software auf &quot;Autofokus&quot;. Hinweis: Gehen Sie zu Extras → Einstellungen Editor, um die MDA-Einstellungen anpassen. Stellen Sie sicher, dass eine angemessene Laserleistung eingestellt wird (&quot;Adequate Laserleistung&quot; bezieht sich auf eine Einstellung, die es Ihnen ermöglichtdie entsprechende Fluorophor erregt bei gleichzeitiger Minimierung Fotobleichen). </li><li> Im MDA-Fenster, wählen Sie die z-Stapel Registerkarte. Wählen Sie &quot;Z-Stapel an der aktuellen Fokus Position&quot;. Stellen Sie den Bereich für ~ 10 um Z-Stapel und wählen Sie &quot;optimal&quot; für die Anzahl der Schritte zur Nyquist bis Z. Hinweis zu gewährleisten: Die genaue Größe des z-Stack wird von der Höhe Ihrer Zellen ab. Entsprechend anpassen. </li><li> 23. Klicken Sie auf &quot;Start&quot; und analysieren die resultierende z-Stapel-Aufnahme zu gewährleisten, die Einstellungen entsprechend für das, was Sie untersuchen (z. B. in dieser Studie war es wichtig, zur Abbildung des gesamten Kern). </li><li> Wählen Sie die &quot;T&quot; (Zeit)-Registerkarte. Für unser Experiment mit Camptothecin, setzen wir das Intervall zwischen Bildgebung Zeitpunkten bis 5 min und die gesamte Dauer der Sitzung für 1 h bei einer Kontrolle (unbehandelte Zellen) Video. Hinweis: zu minimieren Fotobleichen der Zellen, das Experiment sollten so konfiguriert sein, dass der AOTF Zuschnitte den Laser zwischen Bildgebung Zeitpunkten. </li><li> Foder Multi-Punkt-Darstellung von mehreren Zellen in der Schale, im MDA-Fenster, wählen Sie die Registerkarte Position. Stellen Sie sicher, &quot;Apply&quot;-Einstellung vor / nach dem Zeitpunkt &quot;pro Position&quot; aktiviert ist. Wählen Sie &quot;Mark_Find&quot;. Mit der &quot;Live&quot;-Ansicht, bewegen Sie den Teller um und wählen Sie die entsprechenden Sichtfelder. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start&quot; in der multi-dimensionalen-Akquisition Menü, um das Experiment zu beginnen und aufzuzeichnen eine Steuerung Video (von unbehandelten Zellen). </li><li> Nach der Kontrolle Video, fügt die entsprechende Behandlung (in diesem Fall 10 uM Camptothecin). Wir nahmen die experimentelle (drug-behandelten Zellen) Video bei 5-10 min Intervalle für 2-4 Std. Hinweis: Eine wichtige Frage zu prüfen, ist die Geschwindigkeit, mit der ein bestimmter Effekt tritt nach der Behandlung. Wie im Video zu sehen, beginnen 53BP1 Herde von ~ 5 min nach Zugabe von CPT. Obwohl ein relativ einfacher Vorgang, indem Arzneimittels für die Spiegel manuell und wieder Kalibrierung des Mikroskops braucht Zeit. Dabei müssen diese angegeben werden bei der Gestaltung Experimente. </li><li> Für die Überwachung mitosis setzen wir den Abstand zu 7,5 min und aufgezeichnet für 4-5 h (die spezifischen Einstellungen hängen von der verwendeten Zelllinie und der Länge seiner Zellzyklus). Anpassungen müssen vorgenommen werden, um Fotobleichen bei längeren Aufnahmen zu verhindern. </li></ol> C. Bildverarbeitung und-analyse Dieses Protokoll wurde entwickelt, mit Volocity Software (PerkinElmer). Die Software verwendet werden, um diese Daten (AxioVision) erwerben hat auch die Fähigkeit, Bilder zu verarbeiten und zu analysieren. Benutzer werden aufgefordert, die Software zur Verfügung, um sie zu nutzen, und wenden Sie sich entsprechende Literatur im Hinblick auf ihre Anwendung. <ol><li> Öffnen Volocity Software. Erstellen und benennen Sie eine neue Bibliothek, und importieren Sie Ihre Video-Dateien. </li><li> Zum Öffnen der Dateien haben wir in der Regel finden es sehr hilfreich, um die &quot;Extended Focus&quot;-Einstellung verwenden. Dies überlagert die Z-Stapel Scheiben und, für dieses Protokoll, ermöglicht es uns, 53BP1 Foci in verschiedenen Bereichen des Kerns zu visualisieren. </li><li> Passen Sie Videos wie nötig. Volocity wird mit einer Reihe von Tools, um die Qualität der aufgenommenen Bilder zu verbessern ausgestattet. Durch die Sicherstellung der Einstellungen am Mikroskop angemessen waren, kann viel Zeit bei der Bearbeitung später gespeichert werden. Oft ist es hilfreich, Ihre Bilder deconvolve, und passen Sie die Helligkeit / Kontrast. Ihre spezifische Bearbeitung Bedürfnisse werden auf der Grundlage des Experiments variieren. </li><li> Fügen Sie einen relativen Zeitstempel und Maßstab. </li><li> Um Zellen in 3-D zu sehen, die &quot;3-D Deckkraft&quot; Einstellung. Dies erlaubt eine Drehung der 3-D gerendert Zellen im Raum, wodurch mehrere Perspektiven von Strukturen von Interesse in den Zellen. Hinweis: Es ist hilfreich, um Zellen in unterschiedlichen Ebenen visualisieren zu bestimmen, wo Strukturen von Interesse anzeigen. Zum Beispiel wird in dem &quot;Extended Focus&quot;-Einstellung ist es schwierig zu erkennen, dass die 53BP1 bedeutet in der Tat von der DNA dissoziiert während der Mitose. Dies ist jedoch ohne weiteres ersichtlich in 3-D. </li><li> Filme und Standbilder können in einer Vielzahl von Dateitypen auf Benutzer Präferenz exportiert werden. </l<html> i&gt; </ol> D. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für 53BP1 Foci-Bildung in Abhängigkeit von CPT wird in Abbildung 1 gezeigt. Cells CPT Form Brennpunkte innerhalb von 5-10 min ausgesetzt, und pflegen diese Schwerpunkte während der gesamten Dauer der Aufnahme. Wie in 2, 53BP1 dissoziiert von Chromatin zu Beginn der Mitose gezeigt, Bilden einer dünnen Dunst um den kondensierenden Chromosomen. Als Telophase auftritt und Mitose zu einem Ende kommt, 53BP1 wieder Aggregate in verschiedene Schwerpunkte. Während die HEK293-Zellen wurden nicht CPT ausgesetzt, sie dennoch gebildet reichlich, spontane 53BP1 Reparatur Brennpunkte durch endogene DNA-Schäden erzeugt. Diese Beobachtung erlaubt uns zu dem Schluss, dass 53BP1 nicht bilden Schwerpunkte in der frühen Mitose, im Einklang mit einem früheren Bericht zeigt einen ähnlichen Effekt nach der Exposition von Zellen gegenüber ionisierender Strahlung und radiomimetische Drogen 5. Abbildung 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Camptothecin (10 uM) und bewirkt DSBs 53BP1 Foci-Bildung in Fibroblasten Rad innerhalb von 30 min der Zugabe des Arzneimittels an das Medium. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Abbildung 2. 53BP1 nicht bilden Schwerpunkte während der Mitose bis telophase/G1 in HEK293 Zellen.

<ol>
	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. 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F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Aufrechterhaltung der genomischen Integrität ist entscheidend für das Überleben der Zelle. Die Nichtbeachtung der Genom führt zu vorzeitigem Altern, Karzinogenese oder Tod 8 erhalten. Es gibt intensive Interesse an anspruchsvollen, wie die DDR-Funktionen, die sich aus ihrer Bedeutung sowohl Grundlagen-und klinischen Forschung. Viele Techniken wurden im Laufe der Jahre entwickelt, um bei der Untersuchung, wie Zellen erkennen und zu reparieren DNA-Schädigung zu unterstützen. Traditionelle Methoden wie Imm...

<table border="1"><tbody><tr><td> Produkt </td><td> Firma </td></tr><tr><td> CellStar Kulturschalen </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish Glasboden Gerichten </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> MEM-Medien </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminosäuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitamine </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Plasmid 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> PCLNR-H2BG; Plasmid 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss Cell Observer SD Imaging Systems </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (Release 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Oil </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity Software (Version 6,0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Doppelstrangbrüche (DSB) sind die meisten schädlichen DNA-Läsionen eine Zelle begegnen kann. Wenn links unrepariert, um DSBs Hafen ein großes Potenzial zu generieren Mutationen und chromosomalen Aberrationen 1. Um dieses Trauma Katalysieren genomische Instabilität zu verhindern, ist es von entscheidender Bedeutung, damit Zellen DSBs detektieren, die DNA-Schäden Reaktion (DDR) zu aktivieren, und die Reparatur der DNA. Wenn angeregt, arbeitet der DDR zur genomischen Integrität durch das Auslösen des Zellzyklus zu ermöglichen für die Reparatur stattfinden oder zwingen die Zelle zur Apoptose bewahren. Die vorherrschenden Mechanismen der DSB-Reparatur entstehen durch homologe end-joining (NHEJ) und homologe Rekombination Reparatur (HRR) (bewertet in 2). Es gibt viele Proteine, deren Tätigkeiten müssen genau orchestriert werden für die DDR, um richtig funktionieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren für 2 - und 3-dimensionale (D) Visualisierung von einem dieser Proteine, 53BP1. Das p53-bindendes Protein 1 (53BP1) lokalisiert BereichenDSBs durch Bindung an modifizierten Histonen 3,4 bilden Schwerpunkte innerhalb von 5-15 Minuten 5. Die Histon-Modifikationen und Rekrutierung von 53BP1 und andere DDR Proteine ​​DSB Seiten werden geglaubt, um die strukturelle Neuordnung der Chromatin um Bereiche des Schadens erleichtern und dazu beitragen, DNA-Reparatur 6. Über die direkte Beteiligung der Reparatur wurden zusätzliche Rollen für 53BP1 worden in der DDR beschrieben, wie die Regulierung eines Intra-S Kontrollpunkt, einen G2 / M Kontrollpunkt, und Aktivieren stromabwärts DDR Proteine ​​7-9. Vor kurzem wurde entdeckt, dass 53BP1 bildet keine Foci in Reaktion auf DNA-Schäden während der Mitose induziert, anstatt abzuwarten, bevor Zellen G1 Lokalisierung zu der Nähe DSBs 6 einzugeben. DDR Proteine ​​wie 53BP1 haben sich mit mitotischen Strukturen (wie Kinetochoren) während der Progression durch Mitose 10 zuzuordnen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von 2 - und 3-D Live Cell Imaging zu visualisierendie Bildung von 53BP1 Foci in Reaktion auf das DNA-schädigende Mittel Camptothecin (CPT) sowie das Verhalten 53BP1 während der Mitose. Camptothecin ist ein Topoisomerase-I-Inhibitor, der in erster Linie verursacht DSBs während der DNA-Replikation. Um dies zu erreichen, haben wir eine bisher beschriebenen 53BP1-mCherry fluoreszierende Fusionsprotein zu konstruieren, bestehend aus einem 53BP1 Proteindomäne können DSBs 11 binden. Darüber hinaus haben wir ein Histon H2B-GFP fluoreszierende Fusionsprotein zu konstruieren können Chromatin Dynamik während des Zellzyklus, insbesondere aber zu überwachen während der Mitose 12. Live Cell Imaging in mehreren Dimensionen ist ein hervorragendes Werkzeug, um unser Verständnis der Funktion der DDR Proteine ​​in eukaryotischen Zellen zu vertiefen.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung eines DNA Doppelstrangbruch Signalprotein als Reaktion auf DNA-Schäden sowie seine Lokalisierung während der Mitose aktiviert.

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Aufrufe.  Virginia Commonwealth University. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung eines DNA Doppelstrangbruch Signalprotein als Reaktion auf DNA-Schäden sowie seine Lokalisierung während der Mitose aktiviert.

Serie: Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication der Chip-Größe Gerüste für die dreidimensionale Kultivierung der Zellen

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Forschung

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

Färbung und hochauflösende Bildgebung von dreidimensionalen Organoid- und Sphäroidmodellen

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Live-Cell-Bildgebung der Transkriptionsaktivität an DNA-Doppelstrangbrüchen

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

<meta charset="utf8"></head><body>Bewertung der Proteininteraktion und -lokalisation bei DNA-Schäden

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Kombination von Proximity-Liganden-Assay mit Gamma-H2AX-Färbung zur Charakterisierung von Proteininteraktionen in der DNA-Schadensantwort

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

Proximity-Liganden-Assay zur Lokalisierung von Proteinen in DNA-Schadensstellen

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

Methods Article

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine