Wir möchten M. Höxter für die technische Unterstützung bedanken Sortieren primären murinen AECII vom Sicherheitsstufe 2 Proben. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) an die DB (SFB587, TP B12 und BR2221/1-1) und einem Stipendium der Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108), AA unterstützt. DB wird durch die Initiative des Präsidenten und Vernetzungsfonds der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren (HGF) unter Vertrag Anzahl W2/W3-029 unterstützt.

Details bezüglich erforderlichen Reagenzien und Materialien sind in der Tabelle am Ende des Protokolls unten aufgeführt. Vor Beginn der Arbeiten, bereiten 15 ml Röhrchen (eine pro Maus) mit 4 ml Dispase und Vorwärmen sie 37 ° C in einem Wasserbad. In einem Heizblock, kurz erhitzen kleinen Aliquots von 1% Low-Melt-Agarose (in Wasser) auf 95 ° C bis verflüssigt und anschließend kühlen bis 45 ° C bis zur Verwendung. Ein. Vorbereitung der Maus Lung <ol><li> Sacrifice der Maus durch CO 2 Ersticken. Anmerkung: Führen Genickbruch da dies die Trachea verletzen wird, so dass im Anschluss Schritte des Protokolls, wie Installation der Lunge mit Flüssigkeit kann nicht erfolgreich durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, Verlust von nozizeptiven Reflexen. </li><li> Sprühen Sie die Maus mit Ethanol und einen langen Schnitt entlang der ventralen Mittellinie des Körpers. Ziehen Sie das ventrale Fell und Haut und später auch sorgfältig geschnitten und entfernen Sie das Bauchfell. </li><li> Exsanguinate dieMaus, indem Sie die linke und rechte Halsschlagader (Vena jugularis) sowie die Nierenarterie (Arteria renalis). Entfernen fließt Blut mit Gewebe. </li><li> Sorgfältig Punktion und entfernen Sie dann die Membran, die Herz und Lunge durch Wegschneiden die Rippen aussetzen. Achten Sie besonders darauf, um die Lunge zu verletzen. </li><li> Mit einer 26G Kanüle und einer 10 ml-Spritze mit kalter Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS), Punktion der rechte Ventrikel des Herzens und der Lunge perfundieren mit PBS bis sie frei von Blut. </li><li> Schneiden und entfernen Sie die Speicheldrüsen die Luftröhre aussetzen. Auch sorgfältig schneiden die Muskeln rund um die Luftröhre. </li><li> Legen Sie eine 22G Verweilkanüle in die Luftröhre, entfernen Sie die Nadel und drücken Sie die Kunststoff-Katheter in Richtung der Lunge. Befestigen Sie den Katheter durch die Kopplung ein kleines Stück Garn um Luftröhre und Katheter. </li></ol> 2. Enzymatische Verdauung des Lungengewebes Falls gewünscht, kann eine bronchoalveoläre Lavage Fluidprobe seinhergestellt durch Spülen der Lunge durch den Katheter in die Trachea mit PBS oder Medium eingeführt, bevor der nächste Schritt. <ol><li> Verwendung einer 2 ml Spritze, sorgfältig instill ein maximales Volumen von 2 ml Dispase (aus 4 ml Aliquot) in die Lunge durch den Katheter, so dass alle Lappen vollständig expandiert werden. Tauschen Sie die Spritze mit einer 1 ml Spritze mit 0,5 ml des verflüssigten Agarose und auch in der Lunge zu vermitteln. </li><li> Lassen Sie die Spritze auf dem Katheter zum Rückfluss der Agarose zu verhindern und sofort in die Lunge mit Labor Seidenpapier und Eis. Lassen Sie das Agarosegel für ein paar Minuten. </li><li> Entfernen Sie das Seidenpapier, Eis, Spritze und Katheter, schneiden die Luftröhre und Verbrauchsteuern die Lunge, Herz und Thymus aus der Brust. Dann spülen die Lunge in einer Schüssel mit PBS und entfernen Sie das Herz, Thymus und die verbleibenden Luftröhre. </li><li> Setz die Lunge in den verbleibenden 2 ml Dispase und Inkubieren bei Raumtemperatur für 45 min. </li></ol> 3. Vorbereitung der LungeZellsuspension <ol><li> Entfernen Sie die Lunge aus dem Dispase und übertragen sie in eine Schale mit 7 ml anti-CD16/32 Antikörper (1 ug / ml Endkonzentration) in DMEM-Medium und 100 ul DNase. </li><li> Mit Pinzette vollständig zerfallen das Lungengewebe durch Auseinanderziehen und inkubiere für 10 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln auf einer Wippe auf 200 Umdrehungen pro Minute. Falls gewünscht, kann die Zellsuspension dann bei 4 ° C bis zum nächsten Schritt gespeichert werden. </li><li> Filtern Sie die Zellsuspension durch Nylon Maschen zunächst mit 100 um und anschließend mit 70 um, 48 um und 30 um Poren. Kümmern, jeden Mesh sowie den Rohren und Geschirr gründlich mit DMEM spülen, um Verlust von Zellen zu minimieren und Ausbeute. Wenn Sie Pooling Proben werden, kann dies hier durch anschließendes Hindurchführen Zellen Suspensionen aus Mäusen der einen Gruppe durch das gleiche Filter erreicht werden. Erneuern Sie den Filter im Falle von Verstopfung. </li><li> Abhängig von dem Volumen, das Filtrat zu übertragen, um einen oder mehrere 50 ml-Tuben undzentrifugieren für 15 min bei 160 × g und 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 2 ml Erythrocyten Lysepuffer (0,15 M NH 4 Cl, 0,01 M KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) und schnell beenden Lyse durch Zugabe von 13 ml DMEM-Medium. Die Lösung wird in einem 15 ml Röhrchen und Zentrifuge für 12 min bei 160 × g und 4 ° C. </li></ol> 4. Antikörperfärbung für die durchflusszytometrische Cell-Sortierung <ol><li> Die Zellen in 3 ml primäre Antikörper-Cocktail, in DMEM-Medium in Verdünnungen für Durchflusszytometrie hergestellt. (Antikörper wurden bisher für optimale Arbeitsbedingungen Verdünnungen durch Färben 1 x 10 6 Splenozyten in einem Volumen von 100 ul titriert. Formate 3 ml der primäre Antikörper-Cocktail mit den optimalen Konzentrationen für jede der verwendeten Antikörper für Zellen aus bis zu fünf Mäusen gepoolt. Wenn mehr Mäusen zu einer Probe vereinigt werden, die Lautstärke einstellen). </li><li> Zum Färben, inkubiere die Zellen für 10 min im Dunkelnbei 4 ° C. </li><li> Waschen der Zellen durch Füllen des Rohres mit 15 ml DMEM-Medium und Zentrifugation für 12 min bei 160 × g und 4 ° C. </li><li> Bei ungekoppelten oder biotinyliert Antikörper wurden in 4,1 verwendet: Entfernen Sie den Überstand und die Zellen in 2 - 3 ml sekundären Antikörper-Cocktail. Färbemittel für 10 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Waschen der Zellen durch Füllen des Rohrs mit DMEM und Zentrifugation für 12 min bei 160 × g und 4 ° C. </li><li> Die Zellen in 1 ml DMEM und Vorfilter durch einen 50 um Filter in ein Rohr für die Zell-Sortierung. Optional: Zählen Sie die Zellen, um die gesamte Zellzahl in der Lunge Zellsuspension zu erhalten. </li></ol> 5. Zellsortierung <ol><li> Mischen Sie die Zellen durch Vortexen vor Sortierung. Verwenden Sie ein 100 &amp;mgr; m Düse für Zell-Sortierung AECII. Umhüllungsfluid Druck sowie Laseremission und Detektionswellenlängen hängen vom Instrument zum flusszytometrischen Zellsortierung sowie den Fluorochromen im antib verwendetody Färbung. </li><li> Gate auf den SSC hohen Zellen, die negativ sind für den Fluorochromen zum Färben und Sortieren in ein Röhrchen mit DMEM verwendet. Verwenden Vorwärtsstreuung Höhe (FSC-H) vs Bereich (FSC-A) und seitwärts Streuung Höhe (SSC-H) vs Bereich (SSC-A) Fenster, um alle Dubletten oder Zellverbände auszuschließen (siehe Einzelheiten der Gating-Strategie Abbildung 1 a). </li><li> Um die sortierten Zellen Zentrifuge für 20 min bei 280 × g und 4 ° C gesammelt </li><li> Resuspendieren der Zellen in Kultur-Medium oder Puffer wie für die spätere Analyse erforderlich. </li></ol>

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	<li>Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+type+II+cell:+defender+of+the+alveolus+revisited.">Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited.</a> Respir. Res. 2, 33-46 (2001).</li><li>Folkerts, G., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+epithelium:+more+than+just+a+barrier.">Airway epithelium: more than just a barrier.</a> Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).</li><li>Gereke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+alterations+in+type+II+alveolar+epithelial+cells+in+CD4++T+cell+mediated+lung+inflammation.">Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation.</a> Respir. Res. 8, 47 (2007).</li><li>Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+type+II+epithelial+cells+present+antigen+to+CD4(+)+T+cells+and+induce+Foxp3(+)+regulatory+T+cells.">Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells.</a> Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).</li><li>Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+longer+an+innocent+bystander:+epithelial+toll-like+receptor+signaling+in+the+development+of+mucosal+inflammation.">No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation.</a> Mol. Med. 14, 645-659 (2008).</li><li>Herold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+epithelial+cells+direct+monocyte+transepithelial+migration+upon+influenza+virus+infection:+impact+of+chemokines+and+adhesion+molecules.">Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules.</a> J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).</li><li>Knight, D. A., Holgate, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+structural+and+functional+properties+in+health+and+disease.">The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease.</a> Respirology. 8, 432-446 (2003).</li><li>Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+distribution+in+lung+parenchyma+early+after+pulmonary+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa.">Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).</li><li>Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-+and+Strain-Specific+Host+MicroRNA+Molecular+Signatures+Associated+with+Swine-Origin+H1N1+and+Avian-Origin+H7N7+Influenza+A+Virus+Infection.">Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection.</a> J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).</li><li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae,+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages.">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).</li><li>Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetyl-L-cysteine+(NAC)+inhibit+mucin+synthesis+and+pro-inflammatory+mediators+in+alveolar+type+II+epithelial+cells+infected+with+influenza+virus+A+and+B+and+with+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV).</a> Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).</li><li>Zarbock, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surfactant+protein+C+mutation+A116D+alters+cellular+processing,+stress+tolerance,+surfactant+lipid+composition,+and+immune+cell+activation.">The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation.</a> BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).</li><li>Taubenberger, J. K., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+influenza+virus+infections.">The pathology of influenza virus infections.</a> Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).</li><li>Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+alveolar+type+II+cells.">Isolation and culture of alveolar type II cells.</a> Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).</li><li>Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+primary+culture+of+murine+alveolar+type+II+cells.">Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).</li><li>Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization,+synthesis,+and+processing+of+surfactant+protein+SP-C+in+rat+lung+analyzed+by+epitope-specific+antipeptide+antibodies.">Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies.</a> J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).</li><li>Phelps, D. S., Floros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+pulmonary+surfactant+proteins+using+immunohistochemistry+and+tissue+in+situ+hybridization.">Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization.</a> Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiated+human+alveolar+type+II+cells+secrete+antiviral+IL-29+(IFN-lambda+1)+in+response+to+influenza+A+infection.">Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection.</a> J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+to+influenza+A+virus+in+differentiated+human+alveolar+type+II+cells.">Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Unser Protokoll für die Isolierung von murinen AECII durchflusszytometrisch bietet einen schnellen Weg für den Zugriff primären Zellen aus der Maus Lunge für eine ganze Reihe von funktionellen und molekulare Studien. Das beschriebene Verfahren liefert sehr überlebensfähig und reine Populationen AECII, die in ausreichender Zahl zur direkten nachfolgenden Analysen, wie RNA-Isolierung (siehe Bild 2b) und Transkriptom Studien sind. Für funktionelle Anwendungen ist es auch möglich, die Kultur isolier...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Verweilkanüle Introcan 22G </td><td> Braun </td><td> REF 4252098B </td><td></td></tr><tr><td> Dispase, 100 ml (5000 caseinolytische Einheiten) </td><td> BD Biosciences </td><td> 354235 </td><td> Aliquot bis 4 ml in 15 ml Tuben, bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Biozym Plaque Agarose </td><td> Biozym </td><td> 840101 </td><td> 1% w / v in H 2 O </td></tr><tr><td> Desoxyribonuclease I aus Rinderpankreas, 2000 Kunitz-Einheiten / Fläschchen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4263 </td><td> frisch aufzulösen Gehalt von 1 Ampulle in 300 ul DMEM </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 22320-022 </td><td> verwendet wie vom Hersteller (Low G vorgesehenlucose, Pyruvat, HEPES) </td></tr><tr><td> Zelle Siebe (100 um, 75 um) </td><td> BD Falcon </td><td> 352360, 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Nylon-Mesh (48 um, 30 um) </td><td> Bückmann GmbH </td><td> 03-48/26-1020, 03-30/18-108 </td><td></td></tr><tr><td> CellTrics 50 um-Filter </td><td> PARTEC </td><td> 04-0042-2317 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD16/CD32 </td><td> BioLegend </td><td> 101302 </td><td> Klon 93; gereinigten </td></tr><tr><td> Anti-Maus-F4/80 </td><td> BioLegend </td><td> 123116 </td><td> Klon BM8; APC gekoppelten </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD11b </td><td> BioLegend </td><td> 101208 </td><td> Klon M1/70; PE gekoppelten </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD11c </td><td> BioLegend </td><td> 117310 </td><td> Klon N418; APC gekoppelten </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD45 </td><td> BioLegend </td><td> 103102 </td><td> Klon 30-F11; gereinigten </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD19 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0193-83 </td><td> eBio 1D3; PE gekoppelten </td></tr><tr><td> polyklonalen Ziegen-Anti-Ratten-IgG </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550767 </td><td> polyklonale, PE gekoppelten </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antikörper gekoppelt alternative Fluorochromen verwendet werden, abhängig von dem Durchflusszytometer und Lasern zur Verfügung. </td></tr></tbody></table>

flow cytometric isolation of primary murine type ii alveolar epithelial cells for functional and molecular studies

In den letzten Jahren hat sich der Beitrag des alveolären Typ II Epithelzellen (AECII), um verschiedene Aspekte der Immunregulation in der Lunge zunehmend anerkannt. AECII Es wurde gezeigt, der Zytokinproduktion in entzündeten Atemwegen teilzunehmen und sogar als Antigen-präsentierende Zellen sowohl Infektion und T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen 1-8. Daher sind sie besonders interessant auch in klinischen Kontexten wie Atemwegs-Hyperreaktivität der Außen-und Selbst-Antigene sowie Infektionen, die direkt oder indirekt abzielen AECII. Allerdings bleibt unser Verständnis der detaillierten immunologische Funktionen durch alveolare Typ II Epithelzellen in der gesunden Lunge sowie bei Entzündungen serviert fragmentarisch. Viele Studien zur AECII Funktion erfolgt über Maus oder Mensch Alveolarepithelzellen Zelllinien 9-12. Arbeiten mit Zelllinien bietet sicherlich eine Reihe von Vorteilen, wie zum Beispiel die Verfügbarkeit von großen Zahlen of Zellen für umfangreiche Analysen. Wir glauben jedoch, die Verwendung von primären murinen AECII ermöglicht ein besseres Verständnis der Rolle dieses Zelltyps in komplexen Prozessen wie Infektionen oder Autoimmunerkrankungen Entzündungen. Primäre murine AECII können direkt von Tieren, die an solchen Atemwegserkrankungen, das heißt, sie galten alle weiteren äußeren Faktoren eine Rolle spielen, in der analysierten Einstellung isoliert werden. Als ein Beispiel können lebensfähige AECII aus Mäusen intranasal mit Influenza A-Virus, das in erster Linie an diese Zellen zur Replikation 13 infiziert isoliert werden. Wichtig ist, dass durch die ex vivo Infektion AECII von gesunden Mäusen isoliert, können Untersuchungen der zellulären Reaktionen auf die Infektion montiert werden weiter ausgebaut. Unser Protokoll für die Isolierung von primären murinen AECII auf enzymatische Verdauung des Mauslunge durch Markieren des resultierenden Zellsuspension mit Antikörpern, die für CD11c, CD11b, gefolgt F4/80 basiert,CD19, CD45 und CD16/CD32. Körnigen AECII werden dann als unmarkiertem und seitliche Streuung hoch (SSC hoch) Zellpopulation identifiziert und durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung 3 getrennt. Im Vergleich zu alternativen Methoden zur Isolierung von primären Epithelzellen aus Mauslungen ergibt unserem Protokoll für die durchflusszytometrische Isolierung AECII durch negative Selektion unberührt, sehr überlebensfähig und pure AECII in relativ kurzer Zeit. Zusätzlich und im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren zur Isolierung durch Schwenken und Depletion von Lymphozyten durch Bindung von Antikörper-gekoppelten Magnetkügelchen 14, 15, ermöglicht flusszytometrischen Zellsortierung Diskriminierung mittels Zellgröße und Granularität. Da Instrumentation für die durchflusszytometrische Zellsortierung zur Verfügung steht, kann das beschriebene Verfahren bei relativ niedrigen Kosten angewendet werden. Neben Standard-Antikörpern und Enzymen für Lungen-Zerfall, keine zusätzlichen Reagenzien wie z. B. magnetischeKügelchen benötigt. Die isolierten Zellen eignen sich für eine breite Palette von funktionellen und molekularen Studien, die in vitro Kultur und T-Zell-Stimulation Assays sowie Transkriptom-, Proteom oder Sekretom Analysen 3, 4 enthalten.

Beim Sortieren Lunge Zellsuspensionen aus gesunden Mäusen isoliert, wird die Gate-AECII typischerweise für etwa 42 ± 10% ausmachen aller Ereignisse. Dieser Prozentsatz kann merklich niedriger, wenn Mäuse mit Atemwegserkrankungen wie eine virale Infektion verwendet werden, wie die anfängliche Zellsuspension wird ein erheblich höherer Anteil von Lymphozyten und anderen Immunzellen rekrutiert zu den Atemwegen enthalten. Für AECII der IAV infizierten Lunge am Tag 3 nach der Infektion isoliert konnte eine Verringerung...

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Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Wir beschreiben die schnelle Isolierung von primären murinen Typ II Alveolarepithelzellen (AECII) mittels Durchflusszytometrie negative Selektion. Diese AECII zeigen eine hohe Rentabilität und Reinheit und sind für ein breites Spektrum von funktionellen und molekularen Untersuchungen hinsichtlich ihrer Rolle bei der respiratorischen Erkrankungen wie Autoimmun-und Infektionskrankheiten geeignet.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

flow-cytometric-isolation-primary-murine-type-ii-alveolar-epithelial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

26.1K Aufrufe.  Helmholtz Centre for Infection Research. Wir beschreiben die schnelle Isolierung von primären murinen Typ II Alveolarepithelzellen (AECII) mittels Durchflusszytometrie negative Selektion. Diese AECII zeigen eine hohe Rentabilität und Reinheit und sind für ein breites Spektrum von funktionellen und molekularen Untersuchungen hinsichtlich ihrer Rolle bei der respiratorischen Erkrankungen wie Autoimmun-und Infektionskrankheiten geeignet.

Serie: Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Die Analyse der epithelialen Schäden Produziert von<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Verdauung der murinen Leber für eine durchflusszytometrischen Analyse der lymphatische Endothelial Zellen

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...