Da die Lunge ein sehr komplexes und einzigartiges Immunsystem beherbergt, wurden mehrere Gating-Strategien zur Identifizierung von Lungenimmunzellen entwickelt und berichtet. Die Existenz mehrerer verschiedener Ansätze macht es schwierig, die von verschiedenen Laboratorien generierten Ergebnisse zu vergleichen. Unsere Gating-Strategie bietet eine umfassende und reproduzierbare Möglichkeit, bis zu 12 verschiedene pulmonale myeloische und nicht-myeloische Immunpopulationen anhand von neun Markern zu identifizieren.
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Charakterisierung und Identifizierung von Lungenimmunpopulationen unter stationären Bedingungen. Dieses Protokoll kann jedoch verwendet werden, um Veränderungen dieser Zellpopulationen in verschiedenen Krankheitsmodellen zu identifizieren, wo es helfen kann, krankheitsspezifische Veränderungen der Lungenimmunlandschaft zu identifizieren. Forscher, die diese Technik zum ersten Mal durchführen, sollten auf die Verdauungsbedingungen und Reagenzien achten, da sie einen großen Unterschied bei der Freisetzung von Immunzellen aus dem Lungengewebe machen.
Beginnen Sie damit, das eingeschläferte Tier für die Operation vorzubereiten. Stabilisieren Sie die Maus dorsal, indem Sie Nadeln oder Klebeband an den vier Extremitäten verwenden, und verwenden Sie dann 70% Ethanol, um die Haut des ventralen Bereichs zu desinfizieren. Machen Sie einen Schnitt vom Hals bis zum Bauch.
Entfernen Sie die Haut aus dem Brustkorb, zusammen mit den Rippen und dem Brustbein. Spülen Sie die Lunge, indem Sie 10 Milliliter kaltes PBS mit einer 18- bis 21-Gauge-Nadel in den rechten Ventrikel injizieren, bis sie vollständig weiß werden. Entfernen Sie dann den Thymus und das Herz, ohne die Lunge zu berühren.
Lösen Sie die Lunge vom umgebenden Gewebe und übertragen Sie sie in eine Röhre mit kaltem BSA-Puffer. Übertragen Sie die Lunge in eine Petrischale, zerkleinern Sie sie mit zwei feinen Skalpellen und legen Sie sie dann in eine 50-Milliliter-Konusröhre. Fügen Sie fünf Milliliter Verdauungspuffer hinzu, um die Platte zu waschen.
Befestigen Sie den Deckel des Röhrchens und verdauen Sie die Lunge 30 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler mit einer Geschwindigkeit von 150 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 Milliliter kalten BSA-Puffer hinzufügen. Nach der Verdauung die Lungenstücke mit einer 18-Gauge-Nadel mischen und auflösen.
Legen Sie ein 70-Mikrometer-Filtersieb auf ein neues 50-Milliliter-Konusrohr und geben Sie das verdaute Lungengemisch in das Sieb über. Verwenden Sie die Gummiseite eines 10-Milliliter-Spritzenkolbens, um die verbleibenden Lungenstücke am Filter zu zertrümmern und mit BSA-Puffer zu waschen. Die Einzelzellsuspension bei 350 G acht Minuten bei sieben Grad Celsius zentrifugieren.
Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter ACK-Lysepuffer. Mischen Sie die Suspension mit einer Ein-Milliliter-Pipette und inkubieren Sie sie 90 Sekunden lang bei Raumtemperatur. Geben Sie 10 Milliliter kalten BSA-Puffer in das Reaktionsgemisch und zentrifugieren Sie es bei 350 G für sieben Minuten bei vier Grad Celsius.
Verwerfen Sie den Überstand, suspendieren Sie das Pellet im Färbepuffer und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 5 Millionen Zellen pro Milliliter für die Oberflächenfärbung. Übertragen Sie 1 Million Zellen in 200 Mikrolitern pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte und zentrifugieren Sie die Platte bei 350 G für sieben Minuten bei vier Grad Celsius.
Bereiten Sie eine Durchflusszytometrie-Blocklösung vor, indem Sie den Anti-1632-Antikörper im Färbepuffer verdünnen. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern der Durchflusszytometrie-Blocklösung. Die Suspension für 15 bis 20 Minuten bei vier Grad Celsius oder auf Eis ausbrüten.
Geben Sie dann 150 Mikroliter Färbepuffer in die Platte und zentrifugieren Sie sie 350 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie Oberflächenantikörperlösung vor, indem Sie die Oberflächenantikörper im Färbepuffer verdünnen. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern der Oberflächenantikörperlösung und inkubieren Sie die Platte bei vier Grad Celsius im Dunkeln.
Dann waschen Sie die Zellen zweimal mit Färbepuffer. Bereiten Sie den Fixations- und Permeabilisierungspuffer vor, indem Sie drei Teile Fixations- und Permeabilisierungsverdünnungsmittel und einen Teil Färbepuffer mischen. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern des vorgefertigten Puffers pro Vertiefung der 96-Well-Platte und inkubieren Sie sie für 20 bis 25 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.
Verdünnen Sie den Permeabilisierungspuffer mit gereinigtem deionisiertem Wasser, um einen einmaligen Permeabilisierungspuffer herzustellen und verwenden Sie ihn, um die Zellen zu waschen. Bereiten Sie eine intrazelluläre Antikörperlösung vor, indem Sie mit einem Milliliter Permeabilisierungspuffer verdünnen. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern der verdünnten intrazellulären Antikörperlösung pro Vertiefung der 96-Well-Platte und inkubieren Sie für 40 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.
Waschen Sie die Zellen mit Permeabilisierungspuffer, dann mit Färbepuffer. Nach der letzten Wäsche suspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern Färbepuffer. Erfassen Sie mindestens 1,5 Millionen Zellen pro Probe auf dem Durchflusszytometer.
Nach einer erfolgreichen Operation und einem entsprechenden postoperativen Eingriff wurden die Ablagerungen und Dubletten durch eine Gating-Strategie ausgeschlossen. Immunzellen wurden mit dem CD45+hämatopoetischen Marker mittels Durchflusszytometrie identifiziert. Die Zellen wurden als lebend oder tot unterschieden.
Die immunen Lungenzellen wurden mit Anti-GR-1- und Anti-CD68-Antikörpern in drei Gruppen eingeteilt. Neutrophile wurden mit Ly6G als eindeutigem Marker identifiziert und verifiziert. Die CD45+-Population enthält auch natürliche Killerzellen, T-Zellen und B-Zellen.
Diese Zellen wurden durch natürliche Killer-1.1-, CD3- und B220-Antikörper gefärbt und verifiziert. Die bronchoalveoläre Lavage identifizierte Eosinophile, die positiv für den CD11b-Marker waren, und alveoläre Makrophagen, die keine hohen CD11b-Spiegel exprimierten. CD45+dendritische Zellen wurden gefunden und durch CD24-Expression bestätigt.
Diese Zellen zeigten entweder eine positive oder negative Reaktion auf CD103- und CD11b-Marker. CD103-negative Zellen wurden basierend auf der CD64-Expression als konventionelle und von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen klassifiziert. Die von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen waren für den dendritischen CD24-Marker niedrig positiv und für den CD64-Panmakrophagenmarker positiv.
Interstitielle Makrophagen mit klassischen und nicht-klassischen Monozyten wurden anhand der CD64- und GR-1-Expression unterschieden. Diese Zellen zeigten eine positive Expression für CX3C-Chemokinrezeptor eins. Die wichtigsten Schritte in diesem Verfahren sind die richtige Gewebeentnahme, Verdauung und Vorbereitung der Einzelzellsuspension und das Gating auf lebenden Zellen und Singuletts.
Neben der Charakterisierung von Immunzellen der Lunge durch Durchflusszytometrie können Zellkultur- und Funktionsassays in isolierten Zellpopulationen durchgeführt werden. Diese Technik kann den Weg für Forscher ebnen, um neue Fragen bei Erkrankungen der Lunge wie Infektionen, Autoimmunerkrankungen und Krebs zu untersuchen.
