Die Autoren danken den NIH (AI074224 und GM085323) und NSF (0.712.019 und 0.924.699) für die Finanzierung von Projekten gewidmet heterologen Biosynthese zu unterstützen.

Der Text ist spezifisch für das Antibiotikum Erythromycin A, aber die Schritte ausgebildet sind allgemein anwendbar auf andere natürliche Produkte als Kandidaten für heterologe Biosynthese. Ein. Erythromycin A Genetic Cluster Übertragung <ol><li> PCR-Primer-Design zu amplifizieren alle Gene mit dem Erythromycin A Cluster innerhalb des zugeordneten S. erythraea Chromosom. Dieser Schritt ist speziell auf diese Naturprodukt Kandidaten, deren genetische Sequenzen bestimmt wurden. Alternativ können die gewünschten Gene synthetisiert (durch mehrere kommerzielle Herstelleroptionen) mit dem Vorteil, dass die neu synthetisierte Gene für optimalen Codonverwendung würde innerhalb der neuen E. ausgebildet sein -coli-Wirt. Wenn die DNA-Synthese verfolgt wird, wird ein Strom Herausforderung Erzeugen megasynthase Gene, die 10 kb in der Länge überschreiten darf. Technisch kann Synthese bewerkstelligt werden, aber es ist schwierig und kostspielig. Es wird erwartet, dass kontinuierliche improvemEltern in Gensynthese-Technologie wird sich aktuellen Nachteile und weiter zu validieren diesen Ansatz für die Bereitstellung von heterologen genetischen Materials. </li><li> Führen Sie die PCR mit frisch zubereiteten S. erythraea genomische DNA als Matrize. Die chromosomale DNA kann aus Kulturen von S. hergestellt werden erythraea oder aus gefrorenen Beständen des Bakteriums (Abbildung 3) 25. PCR-Reaktionen können von der Zugabe von DMSO (4 pl in 50 ul Reaktionen) zur Berücksichtigung hohen G+ C-Gehalt im Target profitieren S. erythraea Gene. Jede amplifizierte Gen sollte sequenziert, um zu bestätigen, dass die vollständige Gen abgerufen wurde und dass keine Mutationen in den PCR-Prozess eingeführt werden. </li><li> Durch Restriktionsverdau und Ligation, legen jedes der isolierten Gene in Expressionsvektoren für E. konzipiert coli (Abbildung 3). Dies wird durch die Gestaltung Restriktionsstellen innerhalb der PCR-Primer, um die Verdauung und Ligation in geeignete Ex erlauben initiiertpression Vektoren (ein Beispiel ist in Abbildung 3 wurde im Lieferumfang enthalten). Wir haben sowohl pET21 und pET28 Vektoren verwendet. Die pET28 Vektor erlaubt die Einbeziehung eines 5&#39;-Leader-Sequenz, die Genexpression in dem Fall Erythromycin A unterstützt. Bestätigen einzelnen Genexpression durch RT-PCR, SDS-PAGE-Analyse (unter Verwendung von löslichen Proteinfraktionen) oder bequemer phänotypischen Assays (Abbildung 4). </li><li> Konstruieren Operons auf Gene erfolgreich von einzelnen Expressionsplasmide (Abbildung 3) ausgedrückt. Wir haben traditionell Kombinationen kompatible kohäsive-Restriktionsenzymen (z. B. Xba I und Spe I) 24 verwendet, um sequentiell umzuwandeln Gene Operons, jedoch werden die Restriktionsschnittstellen für Operon Konstruktion gewählt darf innerhalb befinden (oder müssen aus entfernt werden) das isolierte Gensequenzen (ein Problem, das vermieden werden, wenn Gen-Synthese verwendet werden kann). Dieser Schritt festigt die 20 Erythromycin A Gene vor der E. coli traformationen. Derzeit haben wir diese Methode verwendet, um bis zu 20 kb fremder DNA in einem Standard-pET-Vektor (zwei Gene von ~ 10 kb jeweils). Darüber hinaus haben wir diesen Ansatz verwendet, um Operons enthält neun Gene zu erzeugen. Es ist nicht bekannt, wie viel oder wie viele DNA Gene können in pET-Typ Plasmide zu integrieren, wobei jedoch die oben genannten Metriken eine Referenz für komplizierte Systeme wie das Erythromycin Biosyntheseweg bereitzustellen. Schließlich Standard-in vitro-Ligation Schritte und anschließende erfolgreiche Transformation Schritte zunehmend schwieriger als Operon und Plasmid Größe zunimmt. Ligation Temperatur (12-22 ° C) und die Zeit (3-24 Stunden) sind vielfältig und elektro-Transformation wird verwendet, um den Prozess der Herstellung der fertigen Plasmidkonstrukte unterstützen. </li><li> Verwandeln Sie die neu gestaltete biosynthetischen Plasmide in E. coli-Stamm BAP1 mit elektro-Transformation (Abbildung 5). Das Verfahren kann mit Plasmiden eingeführt versucht werden entweder nacheinander oder in Zusammenarbeitmbination. Bei der Umwandlung size-Lage oder zahlreiche Plasmide, haben wir traditionell elektro-Transformation (im Gegensatz zu chemischen Umwandlung Gegensatz) verwendet. Sobald transformiert, Platte die Zellen auf festem LB-Medium mit Tetrazyklin (5 mg / l), Carbenicillin (100 mg / l), Kanamycin (50 mg / l), Streptomycin (50 mg / l) und Apramycin (50 mg / l ) für Plasmids wählen. Es ist höchst ungewöhnlich, dass sechs verschiedene Selektionsantibiotika post-Transformation eines E. verwenden coli-Zelle, aber dies einfach gibt die Gesamtzahl von Plasmiden erforderlich, damit endgültige Erythromycin A-Biosynthese. Während möglich ist, wird der Ansatz begrenzen die Produktionsmöglichkeiten der Verbindung einmal Kultivierung begonnen hat (siehe unten). </li></ol> 2. E. coli Biosynthetische Rekonstitution <ol><li> Belastung BAP1 wurde entwickelt, um die erforderlichen Substrate für die Biosynthese geben und posttranslational modifizieren Desoxyerythronolid B megasynthase. Einzelne Gene des Erythromycin Ein Weg haben für die Genexpression getestet und konsolidiert Operons in Expressionsplasmide. Dieser Abschnitt ist Kulturbedingungen für konzertierte Aktionen der vollen Erythromycin Ein Weg testen gewidmet. </li><li> Take 3 separaten Kolonien des frisch transformierten BAP1 und 1,5 ml LB beimpft Kulturen, das die erforderlichen Antibiotika Plasmidselektion (bei den gleichen oben angegebenen Konzentrationen, um auf Transformanten auf festem Medium auszuwählen), Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG; 100 uM ) und Arabinose (2 mg / ml), um die Genexpression und 20 mM Natriumpropionat um intrazelluläre Biosynthesevorstufe Bildung unterstützt induzieren. Sobald die Produktion bestätigt wurde, können größere Kulturen in einem Versuch zu skalieren und zu maximieren Produkt Titer durchgeführt werden. </li><li> Kultur der Zellen bei 22 ° C und 250 rpm für 24-48 Std. In diesem Fall sorgt Antibiotikaselektion dass die erforderlichen Plasmide in den frühen Stadien der Zellkultur gehalten werden. Jedoch Plasmidss kann leicht verloren werden Selektionsantibiotikum Ebenen im Laufe der Anzucht ändern. Dies kann zu Plasmidinstabilität (dh, der Verlust von einem oder mehreren Plasmiden während der Kultivierung), die dann begrenzen würde Produktionskapazität führen. Das Problem wird verschlimmert, wenn inkompatible Plasmide verwendet werden, um eine vollständige heterologe Gencluster einzuführen. Dies ist der Fall für die Erythromycin A Verbindung (Abbildung 5) und müssten beseitigt werden, um wirklich Überproduktion der Verbindung aus E. coli. Für die Zwecke der Demonstration anfänglichen Produktion werden solche Konstruktionsfehler Gründen der zügig Gründung der Durchführbarkeit des heterologen Ansatz toleriert. </li><li> Klärung der Kulturen durch Zentrifugation bei 10.000 rpm in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und bei 4 ° C für die Analyse. </li><li> Im Fall von Erythromycin A, fehlende Verbindung Produktion wurde durch den Einschluss des GroES / EL Chaperonin (unter Verwendung pGro7 gerichtetspeziell ansprechen mangelnde Aktivität der Enzyme post-Expression) und die Aufnahme zusätzlicher Genkopien (für jene Gene schwache Expression / Aktivität vermutet). Ähnliche Strategien können mit anderen heterologen Naturprodukt Produktion Anstrengungen erforderlich werden. </li></ol> 3. Product Analysis <ol><li> Um zu bestätigen und zu quantifizieren Erythromycin A Formation, Injektion des Kulturüberstandes auf einem LC-MS-Systems (Abb. 6). Kommerziell erhältliche Erythromycin A wurde verwendet, um die Produktion zu bestätigen und als ein Standard bei der Quantifizierung. Für die Fälle, ohne kommerziell verfügbaren Standards würde LC-MS-Analyse erfordern zusätzliche chemische Charakterisierung durch NMR-und hochauflösender Massenspektrometrie. </li><li> Vergleichen Produktion zwischen den 3 Kolonien / Kulturen aus dem BAP1 Transformation. Wählen Sie die höchste Produzent und bereiten eine Glycerin Lager aus der Kolonie Quelle. Dieser Schritt kann gleichzeitig mit den Produktionskulturen Abschnitt des Protokolls erfolgen2 durch Verwendung eines kleinen Teils der Kulturen, um Glycerinstammkulturen vorzubereiten. Bewahren Sie das Glycerin Lager in einem -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> Mit der Bestätigung höchsten produzierenden Zelle Lager, beginnt eine getrennte Produktion Kultur und extrahieren die endgültige Überstand mit 2x Volumen Ethylacetat. Verwenden Sie einen Staubsauger Verdunstungskontrollsystem um den Extrakt trocknen und resuspendieren in 100 ul Methanol. Übertragen des Extrakts auf einen Sterilfilter Scheibe (~ 1/4 Zoll Durchmesser) und damit die Scheibe zu trocknen. Separat, Kultur B. subtillis in LB Flüssigkeit über Nacht. Fügen Sie 20 ul der B. subtilis Kultur zu je 20 ml LB-Agar bei 45 ° C. Platte der Agar und lassen sich zu verfestigen. Setzen Sie den Filter Scheibe auf der Platte und bei 37 ° C (Abbildung 7). Alternativ kann der Extrakt die Flüssigkulturen in einer 96-Well-Platte zugesetzt werden, um die Aktivität unter Verwendung eines Plattenlesegeräts (Abbildung 7) zu quantifizieren. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

2) biosynthetischen Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse 1) Gentransfer: Critical Schritte in heterologen Biosynthese sind an jedem der drei Verfahrenssprachen Punkten im Prozess auftreten. Ein Problem in jedem Stadium wird entgleisen das ultimative Ziel der Schaffung heterologen Biosynthese. Vielleicht das schwierigste Aspekt des Verfahrens wird zur Festlegung rekonstituierten Biosynthese, da dies absolut notwendig ist, um erfolgreiche Analyse zu ermöglichen. Jedoch ist die Rekonstitution abhängig sorgfältige Plan...

Erythromycin A ist ein Antibiotikum Polyketid durch die Gram-positive Bodenbakterium Saccharopolyspora erythraea produziert und die laufende Produktion wurde schrittweise auf ~ 10 g / L durch jahrzehntelange traditionellen Mutagenese und Screening-Protokolle und neuerdings durch Prozessoptimierung Systeme 1-6 verbessert. Mutagenese und Screening-Strategien sind in antibiotischen Naturstoffen Produktentwicklung gemeinsame als Folge der Schwierigkeiten bei der Kultivierung und / oder genetisch manipuliert einheimische Produktion Hosts und wegen der leicht verfügbar antibiotische Aktivität oder verbesserte Wachstumsphänotypen zur Auswahl zu helfen. Im Fall von Erythromycin A, S. erythraea wird durch ein langsames Wachstum Profil und das Fehlen von mehr direkte genetische Manipulationsverfahren (bezogen auf Organismen wie E. coli) begrenzt somit behindern rasche Verbesserung der Produktionseffizienz und der Biosynthese von neuen Derivaten. Nachdem erkannte die Fragen der Produktion und entriegelt diversificatiüber die Möglichkeiten mit Verbindungen wie Erythromycin A, begann die Forschung, um die Idee von heterologen Biosynthese (Abbildung 1) 7 verfolgen. Diese Bemühungen fiel mit verfügbaren Sequenz für das Erythromycin A-Gencluster 8-11. Es sollte betont werden, dass die Zahl der sequenzierten komplexen Naturstoff Gencluster hat stark 12-16 erweitert werden und bietet den Anstoß für weitere Anstrengungen in heterologen Biosynthese kodiert medizinisches Potenzial zugreifen. Um dies zu tun, erfordert heterologen Rekonstitution, dass die neuen Host die Bedürfnisse der spezifischen Biosyntheseweg zu erfüllen. E. coli bietet technischen Komfort, eine breite umspannenden Reihe von Techniken der Molekularbiologie und Stoffwechsel-und Prozess-Engineering-Strategien für die Produktentwicklung. Doch wenn die einheimische Produktion Gastgeber, E. Vergleich coli zeigt nicht das gleiche Maß an komplexen Naturstoff Produktion. Es war daher nicht bekannt, ob E. coli konnte als eine tragfähige heterologen Option für komplexe Naturstoff-Biosynthese dienen. Es wurde jedoch angenommen, dass E. coli wäre eine ideale Wirtsorganismus sein, wenn heterologe Biosynthese erreicht werden könnte. Mit diesem Ziel im Hinterkopf, begann anfänglichen Bemühungen um die Polyketid-Aglykon 6-Desoxyerythronolid B (6dEB) durch E. produzieren coli. Allerdings, native E. coli Stoffwechsel konnten keine nennenswerte Ebenen der Propionyl-CoA und (2S)-Methylmalonyl-CoA benötigt, um Vorstufen 6dEB Biosynthese unterstützt noch konnte der neue Host posttranslational modifizieren Desoxyerythronolid-B-Synthase (DEBS) Enzyme. Um diese Probleme zu beheben, wurde ein Stoffwechselweg von nativen und heterologen Enzymen bestehen, in E. gebaut coli, so dass exogen zugeführten propionat intrazellulär wurde zu Propionyl-CoA überführt und anschließend (2S)-Methylmalonyl-CoA; im Engineering, um dieses Weges zu vervollständigen, wurde ein Gen in sfp th platzierte Chromosom von E. coli BL21 (DE3), um einen neuen Stamm zu produzieren genannt BAP1. Die Sfp Enzym ist ein Phosphopantetheinyl Transferase Lage der Befestigung der 4&#39;-Phosphopantethein Cofaktor den DEBS Enzyme 17,18. Die drei DEBS Gene (jeweils ~ 10 kb) wurden dann auf zwei separat wählbar Expressionsvektoren, induzierbare T7 Promotoren gestellt. Nach einer Einstellung des Schlüssels nach Induktion Temperatur (bis 22 ° C) wurden die DEBS Gene koordinativ innerhalb BAP1 in einem aktiven Zustand erzeugen kann 6dEB 19 exprimiert. Das Streben nach voller Erythromycin A-Biosynthese begann dann mit einem analogen Gencluster aus Micromonospora megalomicea oder ein hybrides Weg der Gene von S. zusammen erythraea, S. fradiae und S. venezuelae die Zwischenprodukte Erythromycin C und 6-deoxyerythromycin D, jeweils 20-22 produziert. Kürzlich hat unsere Fraktion diese Bemühungen durch die Herstellung erythrom verlängertycin A (die meisten klinisch relevanten Form von Erythromycin) durch E. coli. Im Gegensatz zu früheren Arbeiten, unsere Strategie koordiniert äußerte die 20 original S. erythraea Gene für Polyketidbiosynthese, Desoxyzucker-Biosynthese und Befestigung, zusätzliche Anpassung und Selbst-Widerstand (Abbildung 2) benötigt. Insgesamt wurden 26 (native und heterolog) Gene entwickelt, damit E. coli zu Erythromycin A mit 4 mg / l 23,24 erzeugen. Dieses Ergebnis gegründet komplette Produktion eines komplexen Polyketid natürliches Produkt mit E. coli und dient als Grundlage zu nutzen, diese neue Produktion Option oder verfolgen neue.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> PCR-Maschine </td><td> Eppendorf </td><td> Mastercycler personal </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Fischer </td><td> BP231 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BioRad </td><td> Micropulser </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Fischer </td><td> BP1620 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumpropionat </td><td> Sigma </td><td> P1880 </td><td></td></tr><tr><td> L-Arabinose </td><td> Sigma </td><td> A3256 </td><td></td></tr><tr><td> Gekühlte Shaker </td><td> Thermo Scientific </td><td> MaxQ 4000 </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf </td><td> Zentrifuge 5415D </td><td></td></tr><tr><td> pGro7 </td><td> Takara </td><td> Chaperone Plasmid Set (3340) </td><td></td></tr><tr><td> pET21, pET28, pCDF-Duet-1 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 69742-3, 69864, 71340 </td><td></td></tr><tr><td> LC-MS </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3200 Q-Trap </td><td></td></tr><tr><td> Ethylacetat </td><td> Sigma </td><td> 270989 </td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Sigma </td><td> 322415 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumzentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> Concentrator 5301 </td><td></td></tr><tr><td> Rotationsverdampfer </td><td> Buchi </td><td> R-200 </td><td></td></tr></tbody></table>

the logic, experimental steps, and potential of heterologous natural product biosynthesis featuring the complex antibiotic erythromycin a produced through e. coli

Die heterologe Produktion von komplexen Naturstoffen ist ein Ansatz entwickelt, um die jeweiligen Einschränkungen und zukünftigen Möglichkeiten anzugehen. Es ist besonders nützlich für solche Verbindungen, welche therapeutischen Wert besitzen, kann aber nicht ausreichend hergestellt waren oder aus einer verbesserten Form der Produktion profitieren. , 2) heterologe Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse 1) Gentransfer: Die experimentellen Verfahren beteiligt kann in drei Komponenten unterteilt werden. Jede experimentelle Komponente ist unter ständige Optimierung, um die Herausforderungen zu meistern und antizipieren die Chancen, die mit diesem neuen Ansatz verbunden. Heterologen Biosynthese beginnt mit der Identifikation einer genetischen Sequenz, die für wertvolle Naturprodukt. Übertragen dieser Sequenz mit einer heterologen Host wird durch den Biosyntheseweg Komplexität verantwortlich für die Produktentwicklung Bildung kompliziert. Das Antibiotikum Erythromycin A ist ein gutes Beispiel. Zwanzig Gene (in Höhe von&gt; 50 kb) sind für eventuelle Biosynthese erforderlich. Zusätzlich codieren drei dieser Gene Megasynthasen, Multi-Domain Enzyme jeweils ~ 300 kDa groß. Dieses genetische Material müssen so ausgelegt und übertragen werden E. coli für rekonstituierte Biosynthese. Die Verwendung der PCR Isolierung, Konstruktion Operon, Multi-cystronic Plasmiden und elektrooptischen Umwandlung wird bei der Übertragung der Erythromycin A bis E. genetischen Cluster beschrieben coli. Einmal übertragen, das E. coli Zelle muss unterstützt eventuelle Biosynthese. Dieser Prozess wird auch gegen die wesentlichen Unterschiede zwischen E. gegeben coli und originellsten Hosts verantwortlich komplexen Naturstoff Bildung. Die Zelle muss erforderlichen Substrate, um die Biosynthese unterstützen und koordinativ Ausdruck der übertragenen genetischen Cluster aktive Enzyme zu produzieren. Im Fall von Erythromycin A, das E. coli-Zelle musste entwickelt, um die beiden Vorstufen (pr liefernopionyl-CoA und (2S)-Methylmalonyl-CoA) für die Biosynthese erforderlich. Zusätzlich wurden Gensequenz Modifikationen Plasmidkopienzahl, Chaperonin Koexpression, posttranslationale enzymatische Modifikation und Prozesstemperatur auch erforderlich, damit endgültige Erythromycin A Formation. Schließlich muss eine erfolgreiche Produktion beurteilt werden. Für die Erythromycin Ein Fall, präsentieren wir zwei Methoden. Die erste ist Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), um zu bestätigen und zu quantifizieren Produktion. Die Bioaktivität von Erythromycin A wird auch durch die Verwendung eines Bioassays, in dem der antibiotische Aktivität gegen Bacillus subtilis getestet wird bestätigt werden. Die Bewertungskriterien Assays etablieren Erythromycin A-Biosynthese aus E. coli und die Bühne für die zukünftige technische Anstrengungen zur Verbesserung oder Diversifizierung der Produktion und für die Herstellung neuer, komplexer Naturstoffe mit diesem Ansatz.

Das gewünschte Ergebnis dieses Ansatzes ist die Produktion eines vollständig bioaktiven Naturprodukt aus dem E. coli heterologe Wirt. Dies wird am besten durch die LC-MS-Ergebnisse verwendet, um zu bestätigen und zu quantifizieren Produktion (Abbildung 6) und die antibakterielle Bioassay zur endgültigen Aktivität zu bestätigen (Abbildung 7) dargestellt. In die allgemeine Systematik der heterologen Biosynthese, legt dieses Ergebnis Erfolg. Einmal erreicht, Forschungsanstre...

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The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Das heterologe Biosynthese von Erythromycin A durch<em&gt; E. coli</em&gt; Enthält die folgenden experimentellen Schritte: 1) Übertragung genetischer Information, 2) heterologe Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse. Jeder Schritt wird im Rahmen der Motivation, Potential und Herausforderungen bei der Herstellung von therapeutischen Naturprodukten mittels erläutert<em&gt; E. coli</em&gt; Als Surrogat-Host.

Die Logik, Experimental Steps, und Potenziale Heterologe Naturstoffbiosynthese Ausgestattet mit dem Complex Antibiotikum Erythromycin A Through Produziert<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

the-logic-experimental-steps-potential-heterologous-natural-product

Research

JoVE Journal

Biology

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

18.4K Aufrufe.  State University of New York at Buffalo. Das heterologe Biosynthese von Erythromycin A durch E. coli Enthält die folgenden experimentellen Schritte: 1) Übertragung genetischer Information, 2) heterologe Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse. Jeder Schritt wird im Rahmen der Motivation, Potential und Herausforderungen bei der Herstellung von therapeutischen Naturprodukten mittels erläutert E. coli Als Surrogat-Host.

Serie: The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit dem Hitzeschock-Methode

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Forschung

Biologie

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

Gross Dissection der Magen der Lobster, Homarus americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress<em&gt; In-vitro-</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. The S domain forms a contiguous scaffold around the viral RNA, whereas the P domain forms viral spikes on the S domain and contains determinants for antigenicity and host-cell interactions. The P domain binds carbohydrate structures, i.e., histo-blood group antigens, which are thought to be important for norovirus infections. In this protocol, we describe a method for producing high quality norovirus P domains in high yields. These proteins can then be used for X-ray crystallography and ELISA in order to study antigenicity and host-cell interactions.
The P domain is firstly cloned into an expression vector and then expressed in bacteria. The protein is purified using three steps that involve immobilized metal-ion affinity chromatography and size exclusion chromatography. In principle, it is possible to clone, express, purify, and crystallize proteins in less than four weeks, which makes this protocol a rapid system for analyzing newly emerging norovirus strains.

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Here, we describe a method to express and purify high quality norovirus protruding (P) domains in E. coli for use in X-ray crystallography studies. This method can be applied to other calicivirus P domains, as well as non-structural proteins, i.e., viral protein genome-linked (VPg), protease, and RNA dependent RNA polymerase (RdRp).

Herstellung von humanen Noroviren hervorstehendem Domains in<em&gt; E. coli</em&gt; Für Röntgenkristallographie

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication machinery. The stalling of a replisome can lead to its dissociation from the chromosome, either in part or its entirety, leading to the collapse of the replication fork. The recovery from this collapse is a necessity for the cell to accurately complete chromosomal duplication and subsequently divide. Therefore, when the collapse occurs, the cell has evolved diverse mechanisms that take place to restore the DNA fork and allow replication to be completed with high fidelity. Previously, these replication repair pathways in bacteria have been studied using UV damage, which has the disadvantage of not being localized to a known site. This manuscript describes a system utilizing a Fluorescence Repressor Operator System (FROS) to create a site-specific protein block that can induce the stalling and collapse of replication forks in Escherichia coli. Protocols detail how the status of replication can be visualized in single living cells using fluorescence microscopy and DNA replication intermediates can be analyzed by 2-dimensional agarose gel electrophoresis. Temperature sensitive mutants of replisome components (e.g. DnaBts) can be incorporated into the system to induce a synchronous collapse of the replication forks. Furthermore, the roles of the recombination proteins and helicases that are involved in these processes can be studied using genetic knockouts within this system.

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in<i&gt; E. coli</i&gt; Ein fluoreszierendes Repressor Operator System verwenden

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

Visualisierung und Quantifizierung von mesenchymalen Zellen adipogenen Differenzierung Potenzial mit einer Linie spezifische Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...