Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Blutgefäße im Gehirn und Hypophyse von Teleostfischen zu kennzeichnen, und wir verwenden Herzperfusion mit einem fixativen DiI in der Modellart medaka. So wird diese Technik, die einfach und effizient ist, helfen, wichtige Fragen bezüglich der vaskulären Anatomie im Gehirn und der Hypophyse von Teleostfischen sowie die Beziehung zwischen Neuronen oder endokrinen Zellen und Blutgefäßen zu beantworten. Einige Vorteile dieser Technik sind eine schnelle und einfache einfache Zubereitung und ihre Anpassungsfähigkeit an die Teleostfischarten.
Um einen Fischhalter vorzubereiten, schneiden Sie ein Stück Polystyrol auf eine Länge von fünf Zentimetern, eine Breite von drei Zentimetern und eine Dicke von zwei Zentimetern und kleben Sie das Polystyrol auf eine Kunststoffschale mit einem Durchmesser von neun Zentimetern. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um ein drei Zentimeter langes Boot-förmiges Loch im Polystyrol zu machen. Um das Perfusionssystem vorzubereiten, fügen Sie eine 30 bis 50 Zentimeter lange Kunststoffkanüle an der Extremität der Nadel des Perfusionssystems hinzu.
Um fünf Zentimeter Glaspipetten vorzubereiten, verwenden Sie einen Pipettenzieher, um einzelne Glaskapillaren gemäß den Anweisungen des Herstellers zu dehnen. Vor Beginn der Zerlegung eine 10 Milliliter Spritze mit der vorbereiteten DiI-Fixierlösung aufladen und eine Nadel mit einer Kanüle an der Äußersten der Spritze platzieren. Verwenden Sie dann mehrere Klebebänder, die in verschiedenen Ausrichtungen platziert sind, um die Spritze an der Bank zu befestigen, und passen Sie die Position des Mikroskops und des Sitzes an, um eine gute Position für die Zerlegung und zum Drücken des Spritzenkolbens mit dem Ellenbogen zu erhalten.
Als nächstes legen Sie einen eingeschläferten Fisch in den Bauch des Fischhalters und sichern Sie Kopf und Schwanz mit Stiften. Verwenden Sie eine Schere, um die oberflächliche Hautschicht horizontal zu schneiden, um den vorderen Bauch zu öffnen, und verwenden Sie Zangen, um die Haut über dem Herzen zu entfernen, bis ein klarer Zugang zum Ventrikel und dem Bulbus arteriosus erreicht ist. Fügen Sie ein Glasrohr an der Äußersten der Kapillare hinzu und brechen Sie die Spitze der Pipette.
Bringen Sie das Glasrohr in die Nähe des Ventrikels und fügen Sie dem Spritzenkolben Ellenbogendruck hinzu, um die Flüssigkeit herauszudrücken, während Sie den Herzschlitz mit der Pipette anheften. Dann sofort perforieren Sie den Sinus venosus mit Zangen, um das Blut aus dem Kreislauf zu befreien. Passen Sie von der Herzkammer aus den Winkel der Glaspipette an, um den Eingang des bulbus arteriosus zu lokalisieren, und bewegen Sie die Pipettenöffnung innerhalb des Bulbus arteriosus.
Dann drucke die Spritze für weitere 30 bis 60 Sekunden unter Druck, während die Pipette im Bulbus arteriosus gehalten wird. Für eine optimale Kennzeichnung aller Blutgefäße ist es wichtig, lange genug in den Bulbus arteriosus zu eindringen, um das gesamte Blut durch die DiI-fixative Lösung zu ersetzen. Nach etwa 60 Sekunden Perfusion, wenn keine Blutlecks mehr beobachtet wird, entfernen Sie die Glaspipette und Nadeln aus dem Fisch, und ernten Sie das Gehirn und Hypophyse in frische 4%Paraformaldehyd für zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Spülen Sie dann das Gewebe zweimal in frischem PBS für 10 Minuten pro Wäsche, bevor Sie die Proben für die Bildgebung vorbereiten. Nach der kardialen Injektion einer fixativen Lösung, die DiI enthält, wie gezeigt, können die markierten Blutgefäße auf Gewebescheiben durch fluoreszierende Stereomikroskopie oder auf ganzem Gewebe durch konfokale Mikroskopie beobachtet werden. Beachten Sie, dass, wenn die Lösung in den Herzventrikel anstelle des Bulbus arteriosus injiziert wird oder wenn die Lösung mit einem zu niedrigen Druck und/oder für einen zu kurzen Zeitraum injiziert wird, eine unzureichende Kennzeichnung der Gefäße beobachtet wird.
Darüber hinaus kann bei der Abbildung desselben Gewebes mit den gleichen bildgebenden Parametern eine Abnahme der Etikettierungsintensität nach mehreren Tagen beobachtet werden, wobei das Signal in der Gewebeprobe stärker verbreitet erscheint. Gewebescheiben aus transgenen Linien, in denen die interessensspezifischen Zellen fluoreszierende Reporterproteine ausdrücken, können weiter für bestimmte Proteine von Interesse mit Standard-Immunfluoreszenzprotokollen gekennzeichnet werden, die die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Blutgefäßen und anderen Zelltypen ermöglichen. Es ist wichtig, den bulbus arteriosus zu erreichen.
Wenn dies erreicht ist, sollte die Zugabe von Druck auf den Spritzenkolben eine Ausdehnung des Bulbus induzieren, was ein erfolgreiches Verfahren bestätigt. Diese Technik kann verwendet werden, um die Wechselwirkung zwischen endokrinen Zellen und Blutgefäßen in der Teleosthypophyse im Allgemeinen zu untersuchen, aber vielleicht genauer, um mögliche Unterschiede oder Ähnlichkeiten zwischen den Portalsystemen in Teleost und Säugetieren zu untersuchen. Da diese politische Verwendung toxische und flüchtige Verbindungen Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung einer Gasmaske und einem belüfteten Raum sollte immer bei der Durchführung dieser Verfahren getroffen werden.
