Arbeit im Labor von ES wird durch die Swiss National Science Foundation unterstützt. Wir danken Herrn Dr. Beat Kunz für die Unterstützung bei Dreharbeiten zu danken.

<ol>
	<li>Ch&#233;dotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li><li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21 (2009).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific,+traceable+gene+silencing+for+functional+gene+analysis+during+vertebrate+neural+development.">Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development.</a> Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).</li><li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li><li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo.">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li><li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers.">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li><li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats.">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo.">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).</li><li>Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices.">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li><li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract.">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li><li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li><li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate,+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III.">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li><li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos.">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments.">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese einfache, vektorbasierten künstlichen miRNA Expressionsstrategie kann Knockdown endogenen Genexpression in dem Neuralrohr Huhn verwendet werden. Diese funktionale Tools bieten mehrere Gen-Silencing, zeitliche Steuerung und Zelltyp-Spezifität, die Aufklärung komplexer Entwicklungsverläufe zu erleichtern. Insbesondere haben wir die Brauchbarkeit dieser Plasmide in kommissuralen Axon Führung gezeigt, da die Plasmide können zur Knockdown verschiedenen Genen in kommissuralen Neuronen oder in ihren Zwischenziel, d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 0,5 mm Glaskapillaren </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Glasnadel puller </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard Silikonelastomer </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Wolframdraht, 0,075 mm </td><td> World Precision Instruments </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Insect Pins, 0,20 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Insect Pins, 0,10 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Frühling Schere </td><td> Fine Science Umols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Zangen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 55 Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Schnelle DiI </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskopen </td><td> Olymp </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations

Kommissuralen dI1 Neuronen wurden ausführlich untersucht, um die zugrunde liegenden Mechanismen Axon Führung während der Entwicklung 1,2 aufzuklären. Diese Neuronen sind im dorsalen Rückenmark und schicken ihre Axone entlang stereotype Bahnen. Kommissuralen Axone zunächst ventral projizieren Richtung und dann über der Bodenplatte. Nach dem Überqueren der Mittellinie, machen diese Axone eine scharfe rostral Turn und Projekt längs zum Gehirn. Jeder dieser Schritte wird durch die koordinierte Tätigkeit der anziehenden und abstoßenden Signalmoleküle reguliert. Die richtige Interpretation dieser Signale ist entscheidend für die Führung von Axonen entlang ihrer abgegrenzten Weg. Somit wird die physiologische Beitrag eines bestimmten Moleküls zu kommissuralen Axon Führung idealerweise im Rahmen des lebenden Embryo untersucht. Dementsprechend müssen Gen knockdown in vivo exakt gesteuert werden, um sorgfältig zu unterscheiden Axon Führung Aktivitäten von Genen, die spielen möglicherweise mehrereRollen während der Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Knockdown Genexpression im Huhn Neuralrohr in einem Zelltyp-spezifische, nachvollziehbar. Wir verwenden neuartige Plasmidvektoren 3 beherbergen zelltypspezifischen Promotoren / Enhancer, die die Expression eines Fluoreszenzprotein-Marker anzutreiben, direkt gefolgt von einer miR30-RNAi-Transkript 4 (die sich in dem 3&#39;-UTR von der cDNA, die das fluoreszierende Protein) ( Abbildung 1). Wenn in den Entwicklungsbehälter Neuralrohr elektroporiert, hervorzurufen diese Vektoren effiziente Herunterregulation der Genexpression und exprimieren hell fluoreszierenden Marker Proteine ​​ermöglichen die direkte Verfolgung der Zellen erleben Knockdown 3. Mischen verschiedener RNAi-Vektoren vor der Elektroporation erlaubt die gleichzeitige Knockdown von zwei oder mehreren Genen in unabhängigen Bereichen des Rückenmarks. Dies erlaubt komplexen zellulären und molekularen Wechselwirkungen während der Entwicklung untersucht werden, in einer Weise, die schnell, sUmsetzung, präzise und kostengünstig. In Kombination mit DiI Tracing von commissural Axon Trajektorien in Open-book-Präparate 5, ist diese Methode ein nützliches Werkzeug für die in-vivo-Studien der zellulären und molekularen Mechanismen der commissural Axonwachstum und Führung. Im Prinzip könnte jede Promotor / Enhancer verwendet werden, möglicherweise macht die Technik breiter anwendbar für in vivo Studien der Genfunktion während der Entwicklung 6. Dieses Video zeigt, wie zu handhaben und Fenster Eier, die Injektion von DNA-Plasmiden in das Neuralrohr und die Elektroporation Verfahren. Um commissural Axon Führung zu untersuchen, wird das Rückenmark aus dem Embryo als Open-book-Präparation entfernt, fixiert und injiziert mit DiI zu ermöglichen Axon Wege zu verfolgen. Das Rückenmark wird zwischen Deckgläsern montiert und visualisiert mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie.

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Ein Verfahren, durch welches die Genexpression in der Neuralrohr sein herunterreguliert kann in einem Zelltyp-spezifische, nachvollziehbar beschrieben. Wir zeigen, wie<em&gt; In ovo</em&gt; Elektroporation von microRNA-basierte Plasmide, raumzeitlich kontrollierten RNA-Interferenz auslösen kann verwendet werden, um commissural Axon Führung in der Entwicklung von Neuralrohrdefekten zu untersuchen.

In ovo Elektroporation von miRNA-basierte Plasmide in der Entwicklung von Neuralrohr und Beurteilung der Phänotypen von DiI Injection in Open-book Vorbereitungen

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

in-ovo-electroporation-mirna-based-plasmids-developing-neural-tube

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

16.4K Aufrufe.  University of Zurich. Ein Verfahren, durch welches die Genexpression in der Neuralrohr sein herunterreguliert kann in einem Zelltyp-spezifische, nachvollziehbar beschrieben. Wir zeigen, wie In ovo Elektroporation von microRNA-basierte Plasmide, raumzeitlich kontrollierten RNA-Interferenz auslösen kann verwendet werden, um commissural Axon Führung in der Entwicklung von Neuralrohrdefekten zu untersuchen.

Serie: In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations