El trabajo en el laboratorio de ES con el apoyo de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Beat Kunz para obtener ayuda con el rodaje.

<ol>
	<li>Ch&#233;dotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li><li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21 (2009).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. 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No hay conflictos de interés declarado.

Esta simple, basado en vectores de expresión de miARN estrategia artificial puede ser utilizado para la expresión del gen endógeno caída en el tubo neural de pollo. Estas herramientas funcionales ofrecer silenciamiento de genes múltiples, control temporal y la especificidad de tipo celular, para facilitar la dilucidación de complejas vías de desarrollo. En particular, se ha demostrado la utilidad de estos plásmidos en guía de axones comisurales, ya que los plásmidos se pueden utilizar para distintos genes desm...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 0,5 mm capilares de vidrio </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Vidrio aguja extractor </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporador </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard de elastómero de silicona </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Alambre de tungsteno, 0,075 mm </td><td> World Precision Instruments </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Los alfileres entomológicos, 0,20 mm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Los alfileres entomológicos, 0,10 mm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Tijeras de primavera </td><td> Ciencia Para Fineoles </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 fórceps </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 pinzas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Fast Dil </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Microscopios de fluorescencia </td><td> Olimpo </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations

Comisurales ED1 neuronas han sido ampliamente estudiados para elucidar los mecanismos que subyacen guía de axones durante el desarrollo 1,2. Estas neuronas se localizan en la médula espinal dorsal y envían sus axones a lo largo de trayectorias estereotipados. Axones de la comisura ventral inicialmente proyectar hacia y luego a través de la placa del piso. Después de cruzar la línea media, estos axones hacer un giro brusco rostral y proyecto longitudinalmente hacia el cerebro. Cada uno de estos pasos está regulado por las actividades coordinadas de señales de orientación de atracción y repulsión. La correcta interpretación de estas señales es crucial para la orientación de los axones a lo largo de su ruta demarcada. Por lo tanto, la contribución fisiológica de una molécula particular para guía de axones de la comisura está idealmente investigado en el contexto de la embrión vivo. Por consiguiente, desmontables de genes in vivo deben ser controlados con precisión con el fin de distinguir cuidadosamente las actividades de orientación axón de genes que pueden jugar múltiplesfunciones durante el desarrollo. Aquí se describe un método para la expresión de gen desmontables en el tubo neural de pollo en un tipo de células específicas, de manera rastreable. Usamos nuevos vectores plasmídicos 3 albergar celulares específicos de tipo promotores / potenciadores que dirigen la expresión de un marcador de la proteína fluorescente, seguido directamente por un transcrito de miR30-RNAi 4 (localizado dentro de la UTR 3 &#39;del ADNc que codifica la proteína fluorescente) ( Figura 1). Cuando electroporación en el tubo neural en desarrollo, estos vectores provocar downregulation eficiente de la expresión génica y expresar proteínas marcadoras fluorescentes brillantes para permitir el rastreo directo de las células que experimentan desmontables 3. Mezclando diferentes vectores de RNAi antes de la electroporación permite la caída simultánea de dos o más genes en regiones independientes de la médula espinal. Esto permite complejas interacciones celulares y moleculares que se examinaron durante el desarrollo, de una manera que es rápida, simple, preciso y barato. En combinación con Dil trazado de trayectorias de axones comisurales en preparaciones de libro abierto 5, este método es una herramienta útil para estudios in vivo de los mecanismos celulares y moleculares de crecimiento de los axones de la comisura y orientación. En principio, cualquier promotor / potenciador se podría utilizar, lo que podría hacer la técnica más ampliamente aplicable para estudios in vivo de la función de genes durante el desarrollo 6. Este primer video muestra cómo controlar y huevos de ventana, la inyección de los plásmidos de ADN en el tubo neural y el procedimiento de electroporación. Para investigar guía de axones comisurales, la médula espinal se retira del embrión como una preparación a libro abierto, fijado, e inyectados con Dil, para permitir que las vías axonales a ser rastreado. La médula espinal está montado entre cubreobjetos y se visualizaron mediante microscopía confocal.

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In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Un método por el cual la expresión de genes en el tubo neural puede ser regulada hacia abajo en un tipo de células específicas, de manera detectable se describe. Demostramos cómo<em&gt; In ovo</emElectroporación&gt; de base microRNA-plásmidos que provocan interferencia de ARN espaciotemporalmente controlada puede ser usada para investigar guiado de los axones de la comisura en el tubo neural en desarrollo.

En electroporación in ovo de base miARN plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de Dil en los preparativos libro abierto

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

16.4K vistas.  University of Zurich. Un método por el cual la expresión de genes en el tubo neural puede ser regulada hacia abajo en un tipo de células específicas, de manera detectable se describe. Demostramos cómo In ovo de base microRNA-plásmidos que provocan interferencia de ARN espaciotemporalmente controlada puede ser usada para investigar guiado de los axones de la comisura en el tubo neural en desarrollo.

Video: In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations