Trabalho no laboratório do ES é apoiado pela National Science Foundation suíço. Gostaríamos de agradecer ao Dr. batida Kunz para a assistência com as filmagens.

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Esta simples, baseado em vectores de expressão artificial miRNA estratégia pode ser usada para knockdown expressão do gene endógeno no tubo neural frango. Estas ferramentas funcionais oferecer silenciamento de genes múltiplos, o controlo temporal e especificidade do tipo de célula, a fim de facilitar a elucidação das complexas vias de desenvolvimento. Em particular, foi demonstrado a utilidade destes plasmídeos em orientação axon comissural, uma vez que os plasmídeos podem ser usados ​​para genes distint...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 0,5 milímetros capilares de vidro </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Vidro agulha extrator </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard elastómero de silicone </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Fio de tungstênio, 0,075 milímetros </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Pinos de insetos, 0,20 milímetro </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Pinos de insetos, 0,10 milímetro </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Tesoura Primavera </td><td> Ciência Fineols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont n º 5 fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Rápido DiI </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Microscópios fluorescentes </td><td> Olimpo </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations

Comissurais ED1 neurônios têm sido extensivamente estudadas para elucidar os mecanismos subjacentes a orientação axônio durante 1,2 desenvolvimento. Esses neurônios estão localizados na medula espinhal dorsal e enviar seus axônios ao longo de trajetórias estereotipados. Axônios comissurais inicialmente projetar ventralmente para e, em seguida, do outro lado da placa ventral. Depois de cruzar a linha média, esses axônios fazer uma curva acentuada rostral e projeto longitudinalmente para o cérebro. Cada uma dessas etapas é regulado pelas atividades coordenadas de pistas de orientação atrativas e repulsivas. A correta interpretação dessas pistas é fundamental para a orientação dos axônios ao longo de seu percurso demarcado. Assim, a contribuição fisiológica de uma molécula particular de orientação encontra-se idealmente axônio comissural investigado no contexto do embrião vivo. Por conseguinte, knockdown gene in vivo devem ser controlados com precisão, a fim de distinguir cuidadosamente actividades de orientação de axónios de genes que podem desempenhar múltiplaspapéis durante o desenvolvimento. Aqui, nós descrevemos um método para a expressão do gene knockdown no tubo neural galinha em uma célula de tipo específico forma rastreável. Usamos novos vectores plasmídicos 3 abrigar células específicas do tipo promotores / intensificadores que dirigem a expressão de um marcador de proteína fluorescente, seguido directamente por uma transcrição miR30 RNAi-4 (localizado dentro da 3&#39;-UTR do ADNc que codifica para a proteína fluorescente) ( Figura 1). Quando electroporado para dentro do tubo neural em desenvolvimento, estes vectores de eliciar downregulation eficaz da expressão do gene e expressar proteínas marcadoras fluorescentes brilhantes para permitir o rastreio directo das células experimentam knockdown 3. Misturando diferentes vetores de RNAi antes da electroporação permite que o knockdown simultânea de dois ou mais genes de regiões independentes da medula espinhal. Isto permite complexas interacções celulares e moleculares a serem examinados durante o desenvolvimento, de um modo que é rápido, sim, preciso e de baixo custo. Em combinação com Dil rastreamento de trajetórias axônios comissurais em livro aberto preparações 5, este método é uma ferramenta útil para estudos in vivo dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio comissural e orientação. Em princípio, qualquer promotor / intensif icador poderiam ser utilizados, o que poderia tornar a técnica mais extensamente aplicável para estudos in vivo da função do gene durante o desenvolvimento 6. Este primeiro vídeo demonstra como manipular e ovos de janela, a injecção de plasmídeos de ADN para dentro do tubo neural e do procedimento de electroporação. Para investigar orientação axônio comissural, a medula espinhal é retirado do embrião como uma preparação de livro aberto, fixo, e injetado com Dil para permitir percursos de axónios a ser traçada. A medula espinal é montado entre lamelas e visualizadas por microscopia confocal.

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In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Um método através do qual a expressão do gene no tubo neural pode ser downregulated em um tipo de célula específico forma rastreável é descrito. Demonstramos como<em&gt; In ovo</em&gt; Electroporação de microRNA baseados em plasmídeos que eliciam espaço-temporalmente controlada RNA de interferência pode ser utilizada para investigar a orientação do axónio comissural no tubo neural em desenvolvimento.

Em Eletroporação ovo de miRNA-base de plasmídeos no Tubo Neural Desenvolvimento e Avaliação de Fenótipos por Dil Injeção em livro aberto Preparações

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

16.4K visualizações.  University of Zurich. Um método através do qual a expressão do gene no tubo neural pode ser downregulated em um tipo de célula específico forma rastreável é descrito. Demonstramos como In ovo Electroporação de microRNA baseados em plasmídeos que eliciam espaço-temporalmente controlada RNA de interferência pode ser utilizada para investigar a orientação do axónio comissural no tubo neural em desenvolvimento.

Vídeo: In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations