Die Autoren bedanken sich bei UC Riverside Center for Neuronal Gliazellen-Interaktionen für wertvolle Diskussion der Skalierung Protokolle und Daten zu bestätigen. Die Autoren möchten auch ein aufrichtiges Dankeschön an Abcam für das Sponsoring der Veröffentlichung ihrer Arbeit zu geben.

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	<li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2++elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices.">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li><li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication.">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li><li>Bekar, L. 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Die Autoren möchten sich offenbaren, dass die Tetrodotoxin in diesen Studien verwendet wurde aus Abcam gekauft. Abcam nicht im Bereich der Hypothesen, Design, oder eine Sammlung von Daten. Die gesamte Kommunikation über das Sponsoring der Arbeit von Abcam trat nach dem Peer-Review-Prozess abgeschlossen war.

Die beschriebenen Skalierung Modelle stellen praktische Methoden für die Erforschung von Langzeitplastizität von Astrozyten Gruppe I mGluRs. Imaging spontane und evozierte Ca 2 +-Ereignisse können empfindlicher Test für die Messung von Veränderungen in Astrozyten Gq GPCR-Aktivität, als feste Beweise wurde festgestellt, dass Astrozyten Ca 2 +-Erhöhungen treten nach der Entlassung von IP 3 R empfindlichen Läden hinter der Gq GPCR-Aktivierung 10, 12, 17, 18. Der Anteil der Astrozyten in der Bevölkerung reagiert auf Gruppe I mGluR-Agonisten und dem Muster solcher Ca 2 +-Antworten berichten Veränderungen in der Gruppe I mGluRs von Astrozyten. Die spezifische Technik zur Astrozyten mit Ca 2 +-Indikator zu laden ist eine wichtige Überlegung bei der Gestaltung von Experimenten, um Änderungen in Astrozyten Gq GPCR-Aktivität zu suchen. Bolus-loading-oder Masse-Laden mehrerer Astrozyten oder pATCH-Clamp-Belastung der einzelnen Astrozyten, um die Bild Ca 2 +-Transienten in Astrozyten verwendet werden. Jeder Ansatz bietet gewisse Vorteile und Nachteile. Direktes Füllen Astrozyten mit Ca 2 +-Indikator durch Patch-Clamp ermöglicht eine eindeutige Identifikation der Zelle als Astrozyten ohne Notwendigkeit eines sekundären Marker, wie SR-101. Patch-Clamp Lieferung der Anzeige ermöglicht auch die Aufnahme von Ca 2 +-Aktivität von Astrozyten kleine Fächer mit den buschigen feinen Prozesse, möglicherweise tiefer in der Scheibe, wo Zellen sind gesünder und mit mehr intakt Interaktionen mit Synapsen (abhängig von der Laserleistung verfügbar). Jedoch leidet Patch-Clamp-Beladung von geringem Durchsatz, da die Daten zu einem Zeitpunkt einer Zelle gesammelt. Massenlade hingegen ermöglicht eine große Anzahl von Astrozyten mit Ca 2 +-Indikator beladen und gleichzeitig abgebildet werden. Jedoch nur Astrozyten in der Nähe der Oberfläche (&lt;20 &amp;mgr; m) der Scheibe geladen sind, zugeordnet Anliegens über die Zellgesundheit und intakte Synapsen. Die hier vorgestellte Gegendruck Bolus-loading-Protokoll bietet einen Mittelweg, mit relativ hohen Durchsatz und die Fähigkeit, Ca 2 +-Aktivität zu überwachen tiefer innerhalb der Scheibe (40-75 um). Im Vergleich zu Massenbeladung Ein signifikanter Anstieg im Prozentsatz der spontan aktiven Astrozyten mit der Bolus-Beladungstechnik beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Verbindungen zwischen neuronalen Synapsen und die Astrozyten Prozesse voll 15. Mit guten Laden, kann man oft beobachten Ca 2 +-Aktivität in Hauptprozesse von Astrozyten (Daten nicht gezeigt) oder möglicherweise sogar kleinere Fächer mit 2-Photonen-Mikroskopie. Allerdings wäre Pflege brauchen, um bei der Zuordnung der kleinere Prozesse zu einem bestimmten Astrozyten ausgeübt werden, da die Grenzen in die unspezifische Hintergrundfärbung mischen. Eine weitere Sorge mit der Verwendung von Großlade-oder Bolus-Ladeverfahren ist die Notwendigkeit für eine sekundäre marker für Astrozyten Identifikation. Während es schon seit vielen Jahren bekannt, dass Astrozyten bevorzugt nehmen AM Ester Ca 2 +-Indikatoren wird die Sekundär Marker SR-101 häufig verwendet, um die geladenen Zellen als Astrozyten zu überprüfen. SR-101 kann in sich selbst verändern die innere Erregbarkeit von Neuronen 29. Verwendung von SR-101 bestätigt die Notwendigkeit, alle Astrozyten Ca 2 +-Messungen in TTX durchführen, um mögliche SR-101 Effekte auf die neuronale Erregbarkeit zu begrenzen. Unter der Annahme, dass sowohl Kontroll-und Versuchsgruppen schließen SR-101, sollte der Marker an sich nicht für die in Astrozyten-Ca 2 +-Signal beobachteten Effekte nach der Langzeitmanipulation neuronaler Aktionspotentiale zu berücksichtigen. SR-101 kann mehr ein Anliegen sein, in hohen K + Experimente aber, wie kann es den Unterschied zwischen 2,5 mM K + vs reduzieren 5,0 mM K +, wenn die basale Feuerrate ist nicht proportional geändert. Ein sehr vielversprechender Ansatz für die Ca 2 + liefern </sup&gt; Anzeige Astrozyten hat vor kurzem entstanden, die eine attraktive Alternative zu den traditionellen Ansätzen bietet mit Ca 2 +-Farbstoffe. Bedeutende Fortschritte wurden in den letzten Jahren mit genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) Astrozyten 30-32 gezielt gemacht worden. GeCIS können Astrozyten durch in vivo-Mikroinjektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in einer Hirnregion von Interesse, wie dem Hippocampus geliefert. Die Expression von GeCIS nach etwa zwei Wochen nach Virusinfektion 32 erreicht. Es gibt zahlreiche Vorteile durch die Verwendung von GeCIS in Astrozyten gekennzeichnet. Zuerst werden die Vektoren in Astrozyten mit einem Astrozyten-spezifischen Promotor richtet, so dass die markierten Zellen Astrozyten 32. Zweitens, das Signal-zu-Rausch scheint nun vergleichbar zu dem, was mit Patch-Clamp-Lieferung von Farbstoff erhalten werden, jedoch ohne die Invasivität, die eine Patchpipette auf die Zelle 32 hatte. Drittens können die Indikatoren sein delivered und in der Erwachsenengewebe, das mit Bulk-Loading-Versandmethoden problematisch ist, ausgedrückt. Weiterhin ist der Ausdruck Mosaik, bietet die Möglichkeit, unter mehreren Astrozyten differenzieren. So können mehrere Astrozyten potenziell gleichzeitig abgebildet werden, während die Aufnahme auch im Soma und feine Ästchen in der gleichen Zeit. Daher könnte eine einzige Technik, die in Platz drei separate Verfahren (bulk-loading, Bolus-Laden und Patch-Clamp-Belastung) verwendet werden, um die Skalierung Aktivität der Astrozyten Gq GPCRs aufzeichnen, Effizienz deutlich erhöht werden. Ein möglicher Nachteil der Verwendung von viral-vermittelte Abgabe von Ca 2 +-Indikatoren Astrozyten die möglichen Auswirkungen auf die Gesundheit Scheibe 32. Die Adeno-assoziierte virale Vektoren verwendet, um die GeCIS liefern haben bereits gezeigt worden, um reaktive Gliose der Astrozyten 33 verursachen. Herstellung von Hirnschnitten im Allgemeinen wahrscheinlich initiiert frühen Stadien der Pathologie einschließlich der Freisetzung von inflammatory 10 Moleküle. Daher kombiniert mit den langen Inkubationszeiten erforderlich, um die Skalierung der Astrozyten-Rezeptoren induzieren, die Verwendung von GeCIS Verwendung viraler Vektoren geliefert müssten zusätzliche Gegenleistung im Rahmen von Schicht Gesundheit in dieser Art von Experimenten zu erhalten. Bei der Verwendung dieses Protokoll, ist es wichtig zu beachten, dass der Antrag für die Zeit, um eine Antwort Agonisten produzieren wird als Funktion des Rezeptors Verfügbarkeit variieren. Für eine gegebene Konzentration des Agonisten wird die Anwendungszeit muss länger sein, wenn Rezeptoren unten skaliert kürzer, und wenn Rezeptoren haben, skaliert für das Medikament, eine angemessene Konzentration im Gewebe an Rezeptoren ausreichend zu aktivieren, um eine Ca 2 + zu erzeugen erreichen Antwort. Daher können Arzneimittel Anwendungszeiten und möglicherweise ihre Konzentrationen müssen in Abhängigkeit von der beabsichtigten Richtung der Skalierung eingestellt werden. Zum Beispiel muss die Agonistenkonzentration in der C abgesenktase von TTX zu vermeiden Sättigung Reaktionen und erhöhte nach Inkubation Scheiben in hohen K + noch eine Antwort finden. Insbesondere wurde die DHPG-Konzentration von 5 bis 15 uM nach TTX-Behandlung auf 30-50 uM nach 5,0 mM K + Behandlung, um die Ca 2 +-Antwort-Muster zu untersuchen, wie 5-15 uM war oft zu gering, um zuverlässige Antworten in verschobene Astrozyten nach Verkleinerung der Gruppe I mGluRs. Aufzeichnung von Astrozyten Ca 2 +-Aktivität bietet keinen direkten Beweis von Rezeptor Internalisierung Einsetzen oder zu oder von der Plasmamembran. Jedoch, bezogen auf die bemerkenswerte Ähnlichkeit der Daten mit Daten aus früheren Untersuchungen in vitro, die die direkte Beziehung zwischen Gq GPCR-Expressionsniveaus und spontane sucht und evozierte Ca 2 +-Transienten 21-24, die logische Interpretation der Änderungen der Ca 2 + Signalisierung, daß die Astrozyten-Oberflächenrezeptor-Expressionsniveaus habengeändert. Ein komplementärer Ansatz kann ein wichtiger Aspekt sein, wenn man will, um zusätzliche Erkenntnisse über den Ort der Wirkung auf die Ca 2 +-Aktivität liefern. Eine Strategie, die wir verwendet wurde, um die Wirkung von TTX Inkubation auf Hippocampus von Astrozyten MrgA1R Mäusen zu untersuchen. Diese transgenen Mäuse exprimieren einen Fremd Gq GPCR (die MrgA1R) nur in Astrozyten. Da dieser Rezeptor nicht heimisch an das Gehirn, gibt es keinen endogenen Neurotransmitter vorhanden, seine Aktivität zu ändern. Frühere Arbeiten vorgeschlagen, dass dieser Rezeptor die gleiche intrazelluläre Signalmoleküle als endogene Gruppe I mGluRs in den gleichen Astrozyten 34 greift. Nach Langzeit-Inkubation von Scheiben von MrgA1R Mäuse in TTX, keine Unterschiede in der Agonisten-evozierte MrgA1R Antworten im Vergleich zu Kontrolle inkubiert Wurfscheiben wäre nachzuweisen, dass die Wirkung auf Astrozyten aufgrund von Änderungen an der Oberfläche lokalisierten Rezeptor Ca 2 +-Aktivität, vor allem wenn Gruppe I mGluR Antworten sind immer noch significantly in den gleichen Astrozyten verbessert. Eine alternative, wenn auch komplizierter Strategie wäre, Astrozyten aus den Scheiben für die Western-Blot-Analyse zu isolieren, solange einer Membranfraktion kann für Änderungen der Oberflächenrezeptorexpressionsniveaus analysiert. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) oder Durchflusszytometrie kann hier hilfreich sein. Die möglichen Anwendungen dieser Technik auf die Untersuchung von Neuronen, Astrozyten und Astrozyten-neuronalen Interaktionen viele. In unseren Experimenten nur DHPG-evozierte Gruppe I mGluR Astrozyten Ca 2 +-Antworten untersucht wurden, in isolierten akuten Hippocampus von jungen Mäusen. Diese Vorbereitung hat nicht nur die intakten Afferenzen (Schaffer-Kollateralen), aber auch die Nervenzellen, die Anlass zu ihnen (CA3 Pyramidenzellen), so dass es möglich ist, die Feuerraten dieser glutamatergen Neuronen auf die postsynaptischen Zellen (CA1-Pyramidenzellen) zu manipulieren und die Astrozyten in Stratum radiatum deren Prozesse verbundee mit diesen Synapsen. Die akute Hippocampus-Scheibe ist vielleicht nicht die beste Vorbereitung für die Manipulation von Feuerraten von anderen Arten von Neuronen zu sein, aber, wie viele Afferenzen aus den Neuronen, die Anlass zu ihnen abgebrochen. Dennoch kann es in bestimmten Schnittpräparate sein, Plastizität der anderen Astrozyten Gq GPCR-Subtypen zu beobachten. Zum Beispiel könnte Scheiben mit cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns und ihre Projektionen hergestellt intakt Hippocampus. Inkubation dieser Scheiben in TTX oder erhöhter K + würde basalen Feuerraten von cholinergen Neuronen beeinflussen, was zu Skalierung mAChRs in Astrozyten des Stratum oriens, die einen wesentlichen Anteil des cholinergen Eingang 1 empfangen. Ein alternativer Ansatz für die noch nicht erprobt Astrozyten-Rezeptor-Skalierung in einem bestimmten Bereich des Gehirns, mit allen Verbindungen intakt studieren, während die Skalierung auftritt, könnte es sein, ein in vivo-Modell, bei dem eine anhaltende Freisetzung von TTX durch Implantation eines plast erreicht verwendenic Polymer Elvax 40W oberhalb der interessierenden Region 35. Dieser Ansatz wurde bereits in einer Studie von neuronalen Skalierung verwendet worden, aber sollte auch auf Astrozyten Skalierung sein. Schließlich, mit der richtigen Anzeige, zukünftige Studien könnten andere GPCR Familien, einschließlich der Änderungen in G s oder G i GPCRs zu untersuchen. Man könnte Astrozyten GABA B G vorherzusagen i GPCRs zu folgenden Hemmung der Brenn lokal vorstehende GABA Inter innerhalb einer Schnittpräparat betroffen sein. Entwicklung neuer Indikatoren, die gegen andere Signalmoleküle, wie eine Echtzeit-Anzeige der zweiten Botenstoffes cAMP, die Öffnung für ein völlig neues Gebiet der Forschung auf Neuron-zu-Astrozyten-Rezeptor-Kommunikation. Bidirektionale Skalierung der Astrozyten mGluRs durch Manipulation der basalen Neuronenfeuerraten liefert ein Maß für die Empfindlichkeit der Astrozyten auf AP-vermittelte Freisetzung von Neurotransmitter. Astrozyten kann offenbar spüren spontanen APs und glutamate Freisetzung bei Schaffer Sicherheiten-CA1-Pyramidenzellen Synapsen auch bei extrazellulären K + ist in einem physiologischen Bereich. Während akute Anwendung der TTX ist die Häufigkeit der spontanen Astrozyten Ca 2 +-Aktivität 18, 36, 37, die Ca 2 +-Aktivität unter den Astrozyten in der Bevölkerung wird entkorreliert 36, den Nachweis, dass Astrozyten Rezeptoren sind AP-Detektoren nicht zu reduzieren. Dies deutet darauf hin, dass Astrozyten spüren spontanen neuronalen APs mit auf ihre Gesamt Ca 2 +-Aktivität nicht beeinflussen. Es wird allgemein akzeptiert, dass die intrazelluläre Konzentration von IP 3 benötigen, um einen Schwellenwert zu IP 3 Rs stimulieren ausreichend, um eine nachweisbare Ca 2 +-Erhöhung führen zu erreichen. Könnte spontanen neuronalen APs aktivieren Astrozyten GPCRs, ohne messbare Ca 2 +-Erhöhungen? Zukünftige Studien könnten Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) oder eine ähnliche techn nutzen<html> ique (wie BRET), um die Beziehung zwischen G-Protein-Kopplung an den Rezeptor (ein Maß für die Rezeptoraktivierung) und Ca 2 +-Freisetzung aus internen Speichern zu prüfen. BRET wurde ausführlich in vitro verwendet werden, um G-Protein-zu-GPCR-Kupplung 38 zu erkennen, auch wenn es einige Zeit dauern, bis diese Technologie wird für die Verwendung in intakten Gewebepräparate zur Verfügung. Es ist möglich, dass Astrozyten Gq GPCRs ist viel häufiger als mit der aktuell verfügbaren Ca 2 +-Imaging Werkzeuge aufgezeichnet werden aktiviert. Neben der Erfassung von Aktionspotentialen, können Astrozyten Gq GPCRs auch in der Lage, Miniatur-Quanten Freisetzung von Neurotransmitter zu erfassen, wie in einer aktuellen Studie 39 gemeldet werden. Die hier beschriebene bidirektionale Skalierungsverfahren kann in zukünftigen Studien genutzt werden, um ein Maß für den Umfang, in dem Astrozyten Gq GPCRs erkennen Quanten vesikulären Freisetzung von Neurotransmitter, indem Bafilomycin A1 im Inkubationsprotokoll bieten. ntent &quot;&gt; So weit die Skalierungs Protokolle nur im Hippocampus von jungen Mäusen (p12-p18) verwendet worden. Daher ist es zur Zeit nicht bekannt, ob Astrozyten-Rezeptor-Skalierung könnte auch von erwachsenen Mäusen Gewebe induziert werden. Eine überzeugende neue Studie legt nahe, dass Gruppe I mGluR Expression in Astrozyten verringert erheblich nach der ersten Woche und weiter bis ins Erwachsenenalter zurückgehen, mit einem sehr niedrigen Niveau von Rezeptor-Expression in adulten Astrozyten 40. Es wäre daher interessant sein, festzustellen, ob Astrozyten mGluRs skalieren nach Lang tige Hemmung der neuronalen Erregung bei erwachsenen Hippocampus der Maus auf Werte, die denen in Astrozyten von jungen Mäusen gesehen. Dieser Befund legt nahe, dass Astrozyten-Rezeptor-Expression ist nicht statisch in einem bestimmten Alter, sondern kann schnell je nach Höhe des neuronalen Aktivität zu verändern. Im Gegensatz zu verminderte Expression von Gruppe I mGluRs in erwachsenen Mäusen, die Beweise ab, dass adrenergen Rezeptoren, einschließlich &amp; #945; 1A, 2A α und β 1-Subtypen, werden überwiegend durch Astrozyten im Gehirn von Erwachsenen 3, 4 ausgedrückt. Die α 1A-adrenergen Gq GPCR kann ein attraktives Ziel für zukünftige Studien der Neuron-zu-Astrozyten-Kommunikation, einschließlich, ob diese Rezeptoren empfindlich auf Veränderungen der adrenergen Neuronenfeuerraten sein.

Astrozyten reagieren innerhalb von Sekunden bis Stimulation von Neuronen oder neuronalen Axonen mit einem Anstieg der cytoplasmatischen Ca 2 + resultierenden fast ausschließlich aus der Aktivierung von Astrozyten Gq GPCRs. Zum Beispiel muskarinischen Acetylcholin-Rezeptoren 1, 2 Cannabinoid-Rezeptoren, α 1A adrenergen Rezeptoren 3, 4, und ich mGluRs Gruppe (siehe unten) sind alle Astrozyten Gq GPCR-Subtypen, die akut die neuronale Aktivität zu reagieren. Aktivierung von Astrozyten Gruppe I-mGluRs wurde sehr ausgiebig demonstriert, nach Stimulation des glutamatergen Nerven Afferenzen in situ (z. B. akute Hippocampus) 5-7 sowie in adulten Maus Kortex in vivo nach sensorischer Stimulation 8. Das Ergebnis der Aktivierung von Astrozyten Gq GPCR-Signal über die Biologie und Physiologie der Astrozyten, Neuronen oder Astrozyten-Neuron-Interaktionen ist eine Angelegenheit der Debatte 12.09. Es wird s seinome Zeit vor der Funktion von Neuronen zu Astrozyten-Rezeptor-Signal ist voll gewürdigt. Zwar ist klar, dass Neuronen Astrozyten Rezeptoren mit Versuchsprotokolle zu aktivieren, gibt es Aspekte der Neuron-zu-Astrozyten-Rezeptor-Kommunikation, die kaum verstanden zu bleiben. Zuerst wird die tatsächliche Menge der neuronalen Aktivität erforderlich Astrozyten Gq GPCRs aktivieren ist nicht gut definiert, und die zweite ist die Fähigkeit der Astrozyten Rezeptoren nutzungsabhängige Plastizität aufweisen wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Um zu beginnen, um diese Fragen zu beantworten, haben wir vor kurzem ein Protokoll zur bidirektionalen Skalierung der Astrozyten Gruppe I mGluRs in akuten Jugend Hippocampus in Reaktion auf langfristige Veränderungen in der neuronalen Aktionspotential (AP)-abhängige synaptische Aktivität zu induzieren. Ähnlich wie für bidirektionale homöostatische Plastizität neuronaler ionotropen Glutamat-Rezeptoren 13, 14, Astrozyten Gruppe I mGluRs Scale-up fo entdecktllowing Blockade neuronaler Aktionspotentiale und verkleinern, wenn neuronale Aktionspotentialfrequenz erhöht 15. Diese kompensatorischen Veränderungen in Astrozyten Rezeptoren können durch spontane Aufnahme gemessen werden und evozierte Astrozyten Ca 2 +-Transienten-und den Vergleich der Eigenschaften von diesen Ereignissen um die aus Astrozyten in Kontrollbedingungen. In diesem Manuskript, beschreiben wir die vollständige Methodik für den Einsatz dieses Protokolls, einschließlich der Vorbereitung der akuten Hippocampus, Inkubationsbedingungen zu Astrozyten-Rezeptor-Skalierung zu induzieren, Astrozyten Ca 2 +-Indikator-Farbstoff Laden, Ca 2 +-Imaging-Techniken mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie und erwarteten Auswirkungen auf Astrozyten Gq GPCR-Aktivität. Vorhersehbare Auswirkungen auf Astrozyten Ca 2 + Signaleigenschaften - was die zuvor in kultivierten Zellen mit unterschiedlichen Expressionsniveaus von Gq GPCRs transfiziert aufgezeichnet wurde - eine &quot;Roadmap&quot;, die in zukünftigen Studien genutzt werden kann, um Änderungen in wie Assaytrocytic GPCR Ausdruck. Die Auswirkungen und Anwendungsmöglichkeiten für den Einsatz dieser Technik wird zu unserem Verständnis der Astrozyten-neuronalen Interaktionen im gesunden und erkrankten Gehirn beitragen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Chamber Supplies</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:163px;">Brinkmann pipette storage container</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">03-491</td>
			<td style="width:159px;">Use the drawer portion as the incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:163px;">Electrical drill</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Flexible tubing</td>
			<td style="width:135px;">Tygon</td>
			<td style="width:131px;">R-3603</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Silicone seam sealant&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">Also called aquarium seam sealer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Gas tank</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">95% oxygen, 5% carbon dioxide</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Natural beveled pipette tip</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:131px;">1111-1000</td>
			<td style="width:159px;">Cut-to-fit to connect oxygenate lines</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">One-to-six lines manifold</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">64-0210 &#160;(MP-6)</td>
			<td style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="65" rowspan="2" style="height:65px;width:163px;">Eppendorf microloader</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">5242 956.003</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit</td>
		</tr>
		<tr height="6">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Floating Bubble Rack</td>
			<td style="width:135px;">Bel Art Scienceware</td>
			<td style="width:131px;">F18875-0400</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">600 micron Sefar Nitex nylon mesh</td>
			<td style="width:135px;">ELKO filtering Co.</td>
			<td style="width:131px;">&#160;06-600/51</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Krazy Glue</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:135px;">Baxter</td>
			<td style="width:131px;">1001936060</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">NaCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S271-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">P333-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">CaCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">C79-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">MgCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">M33-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S369-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S233-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">53188-07-1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">401471000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Tetrodotoxin citrate (TTX)</td>
			<td style="width:135px;">Ascent Scientific</td>
			<td style="width:131px;">Asc-055</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Sulforhodamine 101 (SR-101)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">284912</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D128-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pluronic Acid F-127</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">P6867</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">O6807</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td style="width:135px;">Ascent</td>
			<td style="width:131px;">Asc-020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Histamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H7125</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Carbamoylcholine chloride (Carbachol)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C4382</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Adenosine 5&#8217;-ATP disodium (Na-ATP)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7699</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Dissection Tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Single-edge razor blade&#160;</td>
			<td style="width:135px;">GEM</td>
			<td style="width:131px;">62-0161</td>
			<td style="width:159px;">For bisection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Double edge razor blade</td>
			<td style="width:135px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:131px;">121-6</td>
			<td style="width:159px;">For cutting slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Mayo Scissors, supercut</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">14010-15</td>
			<td style="width:159px;">For decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Fine iris scissors, straight</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">14094-11</td>
			<td style="width:159px;">For cutting the skull</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Iris forceps, curved</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">15915</td>
			<td style="width:159px;">To remove the skin and skull</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Small spatula</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">To remove/transfer the brain</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-10</td>
			<td style="width:159px;">For hippocampus dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Glass Pasteur pipette</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">13-678-20B</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pasteur pipette rubber bulb</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">03-448-22</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Polystyrene 100-mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">25020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Vibratome</td>
			<td style="width:135px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">VT 1200S</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="23" rowspan="2" style="height:23px;width:163px;">Water bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Fisher</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ISOTEMP 210</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For warm incubation</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:163px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:135px;">Narishige</td>
			<td style="width:131px;">PC-10</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:131px;">Olympus Fluoview 1000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">RC-26GLP</td>
			<td style="width:159px;">diamond bath with low profile</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Borosilicate glass pipette</td>
			<td style="width:135px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:131px;">TW150F-4</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="25" rowspan="2" style="height:25px;width:163px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Sutter instrument</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ROE-200</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:163px;">Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 &#181;m cellulose acetate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Costar</td>
			<td style="width:131px;">8161</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing plasticity of astrocytic receptors by manipulation of neuronal firing rates

Nähe von zwei Dekaden der Forschung hat festgestellt, dass Astrozyten in situ und in vivo exprimieren viele G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die von neuronal-Freigabe Sende angeregt werden können. Jedoch wurde die Fähigkeit von Astrozyten Rezeptoren Plastizität in Reaktion auf Veränderungen in der neuronalen Aktivität aufweisen, wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Hier beschreiben wir ein Modellsystem, die global nach oben oder unten skalieren Astrozyten Gruppe I metabotropen Glutamat-Rezeptoren (mGluRs) in akuten Hirnschnitten verwendet werden kann. Enthalten sind Methoden, wie man parasagittale Hippocampus vorbereiten, bauen Kammern geeignet für langfristige Scheibe Inkubation bidirektional manipulieren neuronalen Aktionspotential, Belastung Astrozyten und Astrozyten Prozesse mit fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator, und messen Veränderungen in Astrozyten Gq GPCR-Aktivität durch die Aufnahme spontane und evozierte Astrozyten Ca 2 +-Ereignisse mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Im wesentlichen ein &quot;Calcium roadmap &quot;ist, wie man Plastizität der Astrozyten Gq GPCRs zu messen. Anwendungen der Technik zur Untersuchung von Astrozyten diskutiert. Nachdem ein Verständnis dafür, wie Astrozyten-Rezeptor-Signal wird durch Veränderungen der neuronalen Aktivität beeinflusst hat wichtige Implikationen sowohl für die normale synaptische Funktion sowie Prozesse zugrunde liegenden neurologischen Störungen und neurodegenerative Erkrankungen.

Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 3 zeigen die Wirkung der Inkubation von akuten Maus Hippocampus in TTX für 4-6 h auf sr Astrozyten Ca 2 +-Aktivität. Die Daten umfassen sowohl spontane Ca 2 +-Transienten und DHPG-evozierte Gruppe I mGluR Ca 2 +-Antworten, von den Scheiben in Steuer ACSF vs ACSF zzgl. TTX inkubiert. Anders als Grund charakteristischen morphologischen Merkmale, sternförmigen Prozess der Montage und kleine Soma Größe (~ 10 um), sind Astrozyten im sr durch Überlagerung der Ca 2 +-Indikator-OGB 1.00 mit der selektiven Astrozyten-Marker SR-101 19, 20 (identifiziert Figur 3A). Die nummerierten Boxen über Astrozyten Zellkörper entsprechen den nummerierten Fluoreszenz über in 3B gezeigt Zeitspuren. Die Gruppe 1 mGluR Agonisten (RS)-3.5-DHPG wird angewandt, um die spezifischen Auswirkungen auf die Skalierung der Gruppe 1 mGluRs in Astrozyten zu bestimmen. Um zwischen phys. diskriminiereniology in der Spezifität von dem Skalierungseffekt Gruppe 1 mGluRs im Vergleich zu anderen GPCRs Gq wird ein Cocktail von Agonisten am Ende jedes Experiments angewandt. Hier haben wir jede der 10 uM Gq GPCR-Agonisten Histamin, Carbamylcholin Chlorid (Carbachol) und Adenosin-5&#39;-ATP-Dinatrium (Na-ATP). Der Agonist Cocktail dient auch als eine positive Kontrolle, um lebensfähige, reaktions Astrozyten in Fällen, in denen Zellen nicht auf DHPG reagieren identifizieren, vermutlich, weil diese insbesondere Astrozyten exprimieren keine ausreichenden Mengen des Rezeptors, eine Antwort zu entlocken DHPG. Wir verwendeten verschiedenen Konzentrationen von DHPG einschließlich 5 um und 15 um (Fig. 3B) sowie 30 und 50 &amp;mgr; m (4A) in offenbaren Veränderungen Astrozyten Gruppe I-mGluRs unterstützen. Die Beziehung zwischen zelluläres Ca 2 +-Antworten und Gq GPCR-Expressionsniveaus zuvor in vitro 21-24 untersucht worden. Erstens, dieSchwelle zu einer bestimmten Konzentration des Agonisten zu reagieren, hängt von der Dichte der Rezeptoren, die durch jede Zelle exprimiert. In einer Population von Zellen, mehr Zellen reagieren mit einem Ca 2 +-Erhebung in einer bestimmten Konzentration an Agonist, wenn die Zellen mit höherer Dichte von Rezeptoren transfiziert. Nach Inkubation Scheiben in TTX der Prozentsatz von Astrozyten in der Population reagieren, um eine feste Konzentration des Agonisten erhöht (Fig. 3B und 3C). Wir haben festgestellt, dass 5 um und 15 um DHPG zeigen deutliche Unterschiede im Anteil der reaktions Astrozyten zwischen der Steuerung und TTX behandelten Zellen, während 30 und 50 uM DHPG sind erforderlich, um der Gruppe I mGluR Antworten in 5,0 mM K + behandelt vs Kontrolle zu vergleichen Zellen (Fig. 4A). Die Beziehung zwischen Astrozyten Ca 2 +-Antwort-Muster und Agonistenkonzentration wurde auch in situ untersucht. Die Erhöhung der AgonistenKonzentration verschiebt sich das Muster der Ca 2 +-Antwort in Astrozyten aus einzelnen Peak Ca 2 +-Anstiege auf Multipeak und Plateau-Ca 2 +-Erhebungen 25-27. Auf der Grundlage dieser früheren Befunden, sagten wir voraus, dass die Antwort-Muster auf einer einzigen Konzentration des Agonisten wird zu verschieben, wenn es Veränderungen in der Höhe der Rezeptorexpression. Somit kann in Abhängigkeit davon, welche der beiden Skalierungsverfahren wird verwendet (Hemmung neuronale Aktivität oder Erhöhung it) wird die Konzentration des Agonisten erforderlich, um eine bestimmte Antwort-Muster erzeugen zu erhöhen oder zu verringern. Zum Beispiel, Astrozyten in TTX inkubiert verlagern ihre DHPG-evozierte Ca 2 +-Antwort-Muster, mehr Plateau-Typ-Ca 2 +-Erhöhungen und reagieren auf Agonist-Konzentrationen im Vergleich zu Astrozyten (3C) steuern senken. Unter Berücksichtigung der früheren Studien legen diese Beobachtungen nahe, dass die Gruppe I mGluR Rezeptor-Expressionsniveaus in Astrozyten erhöht. Anstiegszeit und dem Beginn (Latenz) der Ca 2 +-Erhöhungen haben auch gezeigt, direkt auf Änderungen Gq GPCR-Expressionsniveaus in kultivierten Zellen 22-24 korrelieren. Höhere Rezeptorexpressionsniveaus führen zu kürzeren Latenzzeiten und schnellere Anstiegszeiten während die Reduktion der Rezeptordichte erzeugt den gegenteiligen Effekt. Für Astrozyten in TTX, Ca 2 +-Transienten inkubiert durch Anwendung von DHPG evozierte deutlich schnellere Anstiegszeiten im Vergleich zu Astrozyten in Steuer ACSF (3D) inkubiert. Wie zuvor erwähnt, Amplituden-Agonisten hervorgerufene Ca 2 +-Antworten bleiben unverändert, unabhängig von der Konzentration des Agonisten oder des Skalierungsmodell 15 (Fig. 3D). Neben den direkt aktivierende Gruppe beobachteten Veränderungen mGluRs ich mit DHPG, spontan Astrozyten Ca 2 +-Aktivität wird auch wesentlich durch diese Manipulation betroffen. Wir beobachtenda 2,26-fachen Anstieg des Anteils der spontan aktiven Astrozyten in TTX versus Kontrolle inkubiert. Dies ist ein Anstieg von nur 12,9% der Kontroll Astrozyten zeigen spontane Aktivität im Soma auf 42,1% in der TTX inkubiert Astrozyten (3E). Da es bekannt ist, dass GPCRs weisen &quot;intrinsische&quot; oder konstitutive Aktivität in Abwesenheit von Agonist 21, 26, 28, und dass das Niveau dieser intrinsischen Aktivität mit zunehmender Rezeptorexpressionsniveaus, legen diese Daten nahe, dass die Dichte der Astrozyten Gq GPCRs Erhöhungen folgende langfristige Reduktion der neuronalen Aktionspotential Brand. Ähnlich Agonisten hervorgerufenen Reaktionen werden die Anstiegszeiten der spontanen Ca 2 + Erhebungen erhöht (Fig. 3E). Repräsentative Daten unter Verwendung des zweiten Protokolls, die Inkubation in erhöhten extrazellulären Kalium (5,0 mM) wird in Fi dargestelltengure 4. Eine Erhöhung der extrazellulären K + 2,5-5,0 mM zu einer signifikanten Zunahme der basalen CA3-Neuronen Aktionspotentialfrequenz 15. Höhere Konzentrationen von DHPG (30 um und 50 um) sind, um der Gruppe I mGluR Ca 2 +-Antworten von den Astrozyten in hohen Kalium (4A und 4B) inkubiert evozieren erforderlich. Dies ist konsistent mit einem reduzierten Niveau der Gruppe I mGluR Reaktionsfähigkeit in Astrozyten nach einer langfristigen Steigerung der neuronalen Aktionspotentiale. Darüber hinaus ist die evozierte Antwortmuster auf einen festen Konzentration von DHPG verschiebt plateauartigen Reaktionen auf schwächere Einzelpeak-Reaktion (Fig. 4B). Prüfung der Prozentsatz spontan aktiven Astrozyten in den beiden Kalium Bedingungen zeigt, dass weniger Astrozyten in hohem K + inkubiert Vergleich zu der Kontrollgruppe (Fig. 4C) werden spontan aktiv. Dieser Effekt ist in der opposite Richtung des TTX Zustand, in dem der Prozentsatz von Astrozyten zeigen spontane Ca 2 + Erhebungen erhöht wird. Last, hervorgerufen sowohl spontane und Ca 2 +-Erhebungen langsamer Anstiegszeiten in Astrozyten in hoher K + gegenüber der Kontrollbedingung (4C und 4D) inkubiert. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass Astrozyten Gq GPCR-Expressionsniveaus skala bidirektional abhängig von der Höhe der neuronalen Aktionspotenzial Aktivität über einen längeren Zeitraum. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> Fig. 1 ist. Scheibe Inkubationsraum Herstellung und eingerichtet. (A) Die Schublade Teil einer Pipette Lagerbehälter Brinkmann zusammen mit seiner luftdichten Deckel wird die Scheibe Brutraum zu konstruieren. (B) DRillen ein Loch in der Seite des Behälters etwa 1 ¼ von oben und ¼ von der Seite. Fit in einem Schlauchstück. (C) Verbinden der Microloader-Verteilervorrichtung an das eine Ende des flexiblen Schlauchs. Hinweis cut-to-fit Natur 200 ul Pipettenspitze (weißer Pfeil). (D) Sechs 20 ul Eppendorf Microloader geschnitten-to-fit zu einer Eins-zu-sechs Line-Verteiler, um eine Microloader-Verteilergeräte erstellen. (E) Bohren zwei kleine Löcher auf dem Deckel. (F) Ein Floating-Rack-Blase für die Herstellung der Scheibe Halter. (G) Die unteren &quot;Beine&quot; des Schwimmblase Zahnstange entfernt, so dass ein Stück Nylonmaschenmaterial kann mit dem Boden verklebt werden. (H) Füllen Sie den Brutraum mit einer ausreichenden Menge von ACSF, so dass die Scheibe Halter schwimmt. Stellen Sie die Schlauchlänge, so dass die Spitzen der Microloader kann an einer Ecke der Kammer Boden ruhen. Wenn Sie das Brutraum indas Wasserbad, sollte der Wasserstand in der Badewanne auf dem gleichen Niveau wie der ACSF in der Kammer sein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> 2. Die Einschätzung der Scheibe Gesundheit. (A) Eine gesunde aussehende Hippocampus-Scheibe mit Differentialinterferenzkontrast (DIC)-Optik. Gesunde Scheiben haben eine glatte, samtig Aussehen und einen hohen Anteil an gesunden CA1 Pyramidenzellen. Beachten Sie die apikalen Dendriten in Stratum radiatum vorsteht. Patch-Clamp von Neuronen, die wie die hier gezeigt aussehen zeigen einen niedrigen Ruhemembranpotential (-61 bis -62 mV) in Standard 2,5 mM K + ACSF mit wenigen spontanen Aktionspotentiale. Membranpotentials und Feuerraten als Funktion von Ex variierenzellulären K + (Xie et al. 15). Pfeile zeigen auf vermeintliche Astrozyten. Abkürzungen: sr, stratum radiatum; s.py., Stratum pyramidale. Maßstabsbalken, 10 um. (B) Ungesunde Scheiben haben einen hohen Prozentsatz an Toten CA1 Pyramidenzellen, die das Aussehen von gebratenen Eiern (weiße Pfeile zeigen auf Kerne von toten Neuronen - das &quot;Eigelb&quot; der Spiegelei) haben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> 3. Aufnahme verstärkt Gq GPCR-Aktivität und evozierte Gruppe I mGluR Ca 2 +-Antworten nach Langzeit Hemmung der neuronalen APs durch Inkubation in TTX. (A) Repräsentative Bilder der Zellen in der Aufzeichnungsfeld in C inkubiertontrol Bedingungen (obere Felder) oder im TTX (untere Felder), die bis Oregon Green BAPTA-01.00 Ca 2 +-Indikator-Farbstoff (linke Felder) und SR-101 (Mitte Panels) genommen haben. Maßstabsbalken 10 um. Overlay der beiden Signale (&quot;Merge&quot;) zeigt, dass Astrozyten Last mit Ca 2 +-Indikator. Die Boxen sind über die einzelnen Astrozyten soma gezogen, um Fluoreszenzintensität über die Zeit in den grünen Kanal aufzeichnen, um Ca 2 +-Aktivität in Astrozyten zu überwachen. (B) Probe Spuren von den Registrierkassen in A) von Ca 2 +-Aktivität in den Astrozyten. Astrozyten in TTX-Show inkubiert erhöhte spontane Aktivität und robuster evozierte Gruppe I mGluR Ca 2 +-Antworten, wie durch Änderungen in der Reaktionsmuster belegt. Beispiele einzelner Peak (Kreis), Multipeak (Rechteck) und Plateau (gestrichelte Rechteck) Ca 2 +-Transienten werden angezeigt. (C) Änderungen im Reaktionsmuster sind besonders deutlich mit verschiedenen concentRationen der Gruppe I mGluR Agonisten DHPG. Mehr Multipeak und Plateau-Antworten sind nach Inkubation in TTX im Vergleich zur Kontrolle zu einem bestimmten Agonisten-Konzentration deutlich. (D) Anstiegszeiten von DHPG-evozierte Ca 2 +-Antworten werden schneller in Astrozyten in TTX inkubiert Vergleich zur Kontrolle (oben), während die Amplituden ändern sich nicht (unten), was der &quot;Alles-oder-nichts&quot;-Antwort-Amplituden einmal die Schwelle zu reagieren erreicht wurde. (E) Anstiegszeiten der spontanen Astrozyten Ca 2 +-Transienten sind auch schneller in TTX vs Kontrolle inkubiert Astrozyten (oben), während der Anteil der Astrozyten in der Bevölkerung zeigen spontane Gq GPCR Ca 2 +-Aktivität steigt (unteres Bild). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Fig. 4" fo:content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; 4. Aufnahme vermindert Astrozyten Gq GPCR-Aktivität und evozierte Gruppe I mGluR Ca 2 +-Antworten folgende langfristige Steigerung der neuronalen APs durch Inkubation in erhöhten extrazellulären Kalium. (A) Repräsentative Spuren von Astrozyten Ca 2 +-Aufnahmen von den Scheiben in 5,0 mM K + ACSF inkubiert Neuronen zu depolarisieren und erhöhen ihre basalen Feuerrate im Vergleich zu ACSF (2,5 mM K + ACSF) zu steuern. Astrozyten mit 5,0 mM K + ACSF weisen weniger spontane somatische Ca 2 +-Transienten und schwächer DHPG inkubiert hervorgerufenen Reaktionen im Vergleich zu Astrozyten in Steuer ACSF inkubiert. (B) Ein Vergleich von Mustern hervorgerufenen Reaktionen auf mehrere Konzentrationen von DHPG zeigt schwächere Antworttypen nach langfristiger Anstieg der neuronalen APs. (C) Eine Verringerung des Anteils der Astrozyten im povölkerung spontane Ca 2 +-Aktivität zeigt nach langfristigen Inkubation in erhöhter K + beobachtet, verglichen mit ACSF (oben) steuern, während Anstiegszeiten der spontanen Aktivität langsamer werden (unten). (D) Anstiegszeiten der evozierten Astrozyten Ca 2 +-Reaktionen auf verschiedene Konzentrationen von DHPG langsamer folgenden 5,0 mM K + Behandlung im Vergleich zu Astrozyten in Steuer ACSF inkubiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

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Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Hier beschreiben wir eine Anpassung der Protokolle verwendet, um homöostatische Plastizität in Neuronen für die Untersuchung der Plastizität von Astrozyten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu induzieren. Kürzlich verwendet werden, um Veränderungen in Astrozyten Gruppe I mGluRs mit jungen Mäusen zu untersuchen, kann das Verfahren auf die Skalierung der verschiedenen Astrozyten GPCRs zu messen, in Gewebe von erwachsenen Mäusen in situ und in vivo, und ein besseres Verständnis für die Empfindlichkeit der Rezeptoren Astrozyten gewinnen angewendet werden Veränderungen in der neuronalen Aktivität.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

inducing-plasticity-astrocytic-receptors-manipulation-neuronal-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Aufrufe.  University of California Riverside.  Hier beschreiben wir eine Anpassung der Protokolle verwendet, um homöostatische Plastizität in Neuronen für die Untersuchung der Plastizität von Astrozyten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu induzieren. Kürzlich verwendet werden, um Veränderungen in Astrozyten Gruppe I mGluRs mit jungen Mäusen zu untersuchen, kann das Verfahren auf die Skalierung der verschiedenen Astrozyten GPCRs zu messen, in Gewebe von erwachsenen Mäusen in situ und in vivo,...

Serie: Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Forschung

Neurowissenschaften

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

Mapping hemmende neuronale Schaltungen durch Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Gleichzeitige Elektroenzephalographie, Real-time Messung der Laktat-Konzentration und optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität in der Nagetier Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Pentylenetetrazole-induzierten anzünden-Maus-Modell

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) have become the most popular chemogenetic approach used in modern neuroscience. Most studies deliver the ligand clozapine-N-oxide (CNO) using a single intraperitoneal injection, which is suitable for the acute activation/inhibition of the targeted neuronal population. There are, however, only a few examples of strategies for chronic modulation of DREADD-controlled neurons, the majority of which rely on the use of delivery systems that require surgical intervention. Here, we expand on two non-invasive strategies for delivering the ligand CNO to chronically manipulate neural population in mice. CNO was administered either by using repetitive (daily) eye-drops, or chronically through the animal&#39;s drinking water. These non-invasive paradigms result in robust activation of the designer receptors that persisted throughout the CNO treatments. The methods described here offer alternatives for the chronic DREADD-mediated control of neuronal activity and may be useful for experiments designed to evaluate behavior in freely moving animals, focusing on less-invasive CNO delivery methods.

Here we describe two non-invasive methods to chronically control neuronal activity using chemogenetics in mice. Eye-drops were used to deliver clozapine-N-oxide (CNO) daily. We also describe two methods for prolonged administration of CNO in drinking water. These strategies for chronic neuronal control require minimal intervention reducing animals&#8217; stress.

Nicht-invasive Strategien zur chronischen Manipulation der DREADD-kontrollierten neuronalen Aktivität

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...