Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung von Virusinfektionen und bietet tiefe Einblicke in die raumzeitliche Auflösung der Infektionsumgebung und des umgebenden zellulären Kontexts. Die Anwendbarkeit der Immunostainierung auf die Tiefengewebebildgebung ermöglicht nicht nur den Nachweis von Viren, sondern ermöglicht auch die Differenzierung verschiedener zellulärer Subpopulationen mit ihren jeweiligen Zellmarkern. Um das Gewebe für die Immunfärbung zu fixieren, platzieren Sie die Gehirnproben in einem Verhältnis von 1 bis 10 von 4% Paraformaldehyd in PBS, um das Gewebevolumen für mindestens 48 Stunden bei vier Grad Celsius zu proben.
Am Ende der Fixierungszeit waschen Sie die Gewebeproben dreimal in PBS für mindestens 30 Minuten pro Wäsche, bevor Sie die Proben auf 02% Natriumazid in PBS bei vier Grad Celsius übertragen. Verwenden Sie dann ein Vibratom, das auf eine Vorschubrate von 0,3 bis 0,5 Millimetern pro Sekunde eingestellt ist, um das Gewebe in ein Millimeter dicke Abschnitte zu teilen. Bewahren Sie die Abschnitte in frischem 02%Natriumazid in PBS bei vier Grad Celsius auf.
Für die Methanol-Vorbehandlung tauchen Sie die Proben in eine aufsteigende Methanolserie ein, wie für eine Stunde pro Inkubation bei Raumtemperatur mit sanfter Schwingung angegeben. Nach der letzten Inkubation kühlen die Proben auf vier Grad Celsius ab. Ersetzen Sie das 100%methanol durch vier Milliliter vorgekühlte Bleichlösung für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius.
Am nächsten Morgen die Bleichlösung durch vier Milliliter frisches 80%Methanol für eine eine Stunde Inkubation bei Raumtemperatur ersetzen. Dann tauchen Sie die Proben in eine absteigende Serie von Methanol in umgekehrtes von dem, was gerade demonstriert wurde, waschen Sie die Proben einmal für eine Stunde in vier Milliliter PBS nach dem 20%methanol-Eintauchen. Zur Immunfärbung der Hirngewebeabschnitte waschen die Proben zweimal für eine Stunde in vier Millilitern von 0,2%Triton X-100 in PBS, gefolgt von Permeabilisation für zwei Tage bei 37 Grad Celsius in vier Millilitern triton X-100, 20% Dimethylsulfoxid und 0,3 Molglycin in PBS.
Blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit vier Millilitern 0,2%Triton X-100, 10% Dimethylsulfoxid und 6% normalem Serum in PBS für zwei Tage bei 37 Grad Celsius. Am Ende der blockierenden Inkubation beschriften Sie die Proben mit zwei Millilitern Primärantikörperlösung für fünf Tage bei 37 Grad Celsius und erfrischen die Antikörperlösung nach zwei und zwölf Tagen. Als nächstes waschen Sie die Proben für einen Tag in vier Milliliter n. Chr. von 0,2% Tween 20 und 10 Mikrogramm pro Milliliter Heparin in PBS, die den Waschpuffer mindestens vier bis fünf Mal im Laufe des Tages austauschen und die endige Wäsche über Nacht lassen.
Am nächsten Tag die Proben in zwei Millilitern sekundärer Antikörperlösung für fünf Tage bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dann waschen Sie die Proben in vier Milliliter frische 0,2%Tween 20 und 10 Mikrogramm pro Milliliter Heparin in PBS, wie gezeigt. Zur kerntechnischen Färbung der Proben inkubieren die Proben in vier Millilitern des Nukleinsäureflecks TO-PRO-3 für fünf Stunden vor Licht geschützt.
Am Ende der Inkubation waschen Sie die Proben in 0,2%Tween 20 und 10 Mikrogramm pro Milliliter Heparin in PBS, wie gezeigt, gefolgt von Dehydrierung in einer aufsteigenden Tert-Butanol-Serie für zwei Stunden pro Tauchgang. Nach dem 90%-Eintauchen die Proben über Nacht in eine 96%tert-Butanol-Lösung übertragen. Am nächsten Morgen die Proben zwei bis sechs Stunden lang in 100%tert-Butanol weiter dehydrieren, bevor sie die Gewebeabschnitte in frisch zubereitetem BABB-D15 für zwei bis sechs Stunden räumen, bis sie optisch transparent sind.
Die Proben können dann in BABB-D15 lichtgeschützt bis zur Montage und Abbildung gelagert werden. Verwenden Sie für die Probenmontage einen 3D-Drucker, um eine Bildkammer und einen Deckel zu drucken. Montieren Sie einen Deckelrutsch mit einem Durchmesser von 30 Millimetern auf die Bildkammer mit einkomponentigem Raumtemperaturvulkanisierendem Silikonkautschuk.
In ähnlicher Weise montieren Sie einen 22-Millimeter-Abdeckungsslip auf den Deckel. Verwenden Sie einen wasserbenetzten Wattestäbchen, um den überschüssigen Silikonkautschuk auf beiden Ringen zu entfernen, bevor Sie den Gummi über Nacht aushärten lassen. Legen Sie am nächsten Tag eine Probe in die Bildkammer und fügen Sie ein kleines Volumen BABB-D15 in die Kammer, bevor Sie den Deckel einsetzen.
Füllen Sie die Kammer mit einer hypodermischen Nadel mit BABB-D15 durch den Einlass und stecken Sie den Einlass, bevor Sie die Bildkammer mit Silikonkautschuk versiegeln. Um die Bildaufnahme einzurichten, wählen Sie die entsprechenden Laserlinien für die verwendeten Fluorophore aus, und passen Sie die Erfassungsbereiche jedes Detektors an, um Signalüberlappungen zwischen kanälen zu verhindern. Legen Sie dann die Erfassungsparameter fest, um den oberen und unteren Rand des Z-Stacks zu finden und den Image-Stack zu erfassen.
Um 3D-Projektionen des Bildstapels zu generieren, öffnen Sie die Bilddateien in Fidschi und wählen Sie Image Color Channels Tool Mehr und Split Channels aus, um die zusammengeführten Bilder in einzelne Kanäle aufzuteilen. Für die Bleichkorrektur der Bilder wählen Sie für jeden Kanal Bild-Bleichbleichkorrektur und einfache Verhältnis- und Einfachverhältnis. Verwenden Sie die Schieberegler, um die Helligkeit und den Kontrast für jeden Kanal anzupassen, und wählen Sie Bildfarbe und Zusammenführungskanäle aus.
Aktivieren Sie die Option Composite erstellen. Konvertieren Sie das Bild in das RGB-Format, und wählen Sie Bildstapel und 3D-Projekt aus, um eine 3D-Projektion zu generieren. Wählen Sie Hellester Punkt als Projektionsmethode aus, und legen Sie den Slice-Abstand so fest, dass er der Z-Schritt-Größe des erworbenen Bildstapels entspricht.
Legen Sie für eine maximale Qualität das Rotationswinkelinkrement auf eins fest, und aktivieren Sie die Interpolation. Ändern Sie die Gesamtrotation, Transparenzschwellenwerte und Deckkraft nach Bedarf. Speichern Sie dann die 3D-Projektion als tiff- und AVI-Dateiformat.
Mit Immunostaining von Tollwut-Virus Phosphoprotein komplexe Schichten von infizierten neuronalen Zellen können in dicken Abschnitten der Maus Gehirngewebe Proben visualisiert werden. Anschließend können nahtlose 3D-Projektionen der erfassten Bildstapel rekonstruiert werden. Aufgrund der hohen Auflösung, mit der die Bildstapel erfasst werden, kann die Infektion bis zu einer einzelnen Zellebene beurteilt werden, so dass Behauptungen über z.B. die Häufigkeit und Verteilung von Antigen innerhalb einer Zelle von Interesse möglich sind.
Neben Dem Gehirngewebe der Maus kann das Protokoll auch auf Hirngewebeproben anderer Tierarten angewendet werden. Zum Beispiel zeigen Abschnitte, die aus verschiedenen Fächern eines infizierten Frettchengehirns gewonnen werden, ein unterschiedliches Maß an Tollwutvirusinfektion. Astrozyten können durch die Expression von glialen fibrillären Säureprotein unterschieden werden, während Neuriten speziell für mikrotubuli-assoziiertes Protein II gefärbt werden können. Gleichzeitig können virale Proteine mitgefärbt werden, um die Beziehung zwischen den infizierten Zellen und der hervorgehobenen zellulären Subpopulation zu bewerten.
Für die Immunfärbung ist die Wahl der Antikörper zum Nachweis der Proteine von Interesse von entscheidender Bedeutung. Während Standard-Immunhistochemie-Konzentrationen oft ein guter Ausgangspunkt sind, können einige Antikörper eine zusätzliche Anpassung benötigen. Viele der in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien haben schädliche Eigenschaften.
Führen Sie das jeweilige Experiment in einer Dunstabzugshaube mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung einschließlich Labormantel und Handschuhen durch.
