Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus Canadian Institutes of Health Research MOP-81158 unterstützt.

Ein. Extraktion von Zielprotein aus kultivierten primären hippocampalen Neuronen <ol><li> Vor der Ernte endogenes Protein aus primären Zellen des Hippocampus, bereiten Sie einen Lysepuffer (LB; Tabelle 1) mit Protease-Inhibitoren. Zu 10 ml Lyse-Puffer, 0,1 ml Lösung Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) auf eine Endkonzentration von 10 mM, und es wird 1 Proteaseinhibitorcocktail Tablette. </li><li> Planen N-Ethylmaleimid (NEM)-Lösung (Tabelle 1) aus lyophilisierten Pulvers. Sanft in 100% EtOH lösen sich bei Raumtemperatur (RT). Immer vorzubereiten NEM-Lösung frisch für den Tag des Experiments. </li><li> Weiter kombinieren die Lysepuffer und NEM. 0,5 ml 2M NEM-Lösung zu einem frischen 50 ml konischen Röhrchen. 20 ml LB über Oberseite und schnell erfolgt LB + NEM (Endkonzentration 50 mM) auf einer Schüttelplattform bei 4 ° C in vollem Umfang für 5 min mischen. Immer fügen NEM / EtOH-Lösung ersten und zweiten LB, um richtig mischen die beiden. </li><li> Entfernen Sie kultivierten Neuronen aus Inkubator und auf Eis *. Entfernen Sie vorsichtig zellulären Medien und sanft zweimal waschen mit kaltem Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1x. 300 ml LB + 50 mM NEM in die erste Vertiefung der Neuronen im Hippocampus, und kratzen Zellen unter Verwendung eines Einweg-Zelle Heber. Sammeln Sie die Zelllysat, dann entladen, das Lysat in die nächste Vertiefung dieser Gruppe. Kratzen Zellen innerhalb des zweiten auch unter Verwendung der Zellen Heber, sammeln, und wiederholen Sie mit einer dritten, bei Bedarf auch weiter zu konzentrieren das Lysat. </li><li> Sammle Zelllysat in eine vorgekühlte (auf Eis), 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie Schritt 1,4 mit 100 ul LB + 50 mM NEM, um alle verbleibenden Zelllysat zu sammeln. Pass Ganzzelllysat durch eine 26 ½ Manometer Spritze 5-6 mal in mechanische Lyse helfen, wobei darauf zu nicht blasen Blasen in der Lösung. Man kann statt für 15 sec beschallen auf Eis, wenn die Ausrüstung zur Verfügung steht. Nutieren Zelllysat für ≥ 30 min bei 4 ° C. </li><li> Klären Sie die Zelle lysate durch Zentrifugation bei 16.000 × g / 30 min, um Pellets nicht lysierten Zellen und Detergens-unlöslichen Material. </li><li> Sammle gelöscht Zelllysat (Überstand) in einem neuen vorgekühlte 1,5 ml Röhrchen auf Eis. Wiederholen Ernte Protokoll für alle Gruppen von Zellen. Maßnahme Proteinkonzentration in allen Proben unter Verwendung Lysat BCA-Assay, und Normalisierung des Volumens aller Lysatproben von Gruppen von Zellen zu genau gleich Gesamtprotein haben, mit einem empfohlenen minimalen von 500 ug. Füllen Sie alle Proben mit LB + 50 mM NEM zu 500 ul Gesamtvolumen. </li><li> Hinzufügen 1-5 ug primären Antikörper gegen das Zielprotein gerichtet zu jedem Lysat Probe. Nutieren die Antikörper-Lysat Mischproben über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> * Die primären Ratten-Hippocampus-Neuronen in einer Dichte von ca. 250.000 Zellen sollten / Vertiefung in einer 6-Well-Platte kultiviert werden, in einem serumfreien Medium, das eine neuronale B27 Ergänzung, wie zuvor beschrieben, 5, und für den Wunsch gezüchtetd Zeitdauer, typischerweise 14-16 Tage-in-vitro (DIV) zur Reife zu erreichen. Ein Minimum von 500 ug des Gesamtproteins empfiehlt sich erfolgreich immunpräzipitieren und Biotinylierung eines Ziel neuronaler Protein, was typischerweise 2 bis 3 Vertiefungen einer 6-well-Schale. 2. Präzipitation von Antikörper-gebundenem Zielprotein <ol><li> Vor Ausfällen und Immobilisieren eines Zielproteins, bereiten eine 50% ige Aufschlämmung von Protein-A oder Protein-G-Sepharose beschichteten Perlen. Insbesondere, fügen ≥ 60 ul Sepharosebeads pro Probe bis 1,5 ml Röhrchen, sicherzustellen, dass alle Proben gleiche Mengen von Perlen haben. Magnetkügelchen eignen sich auch, wenn das Gerät zur Verfügung steht. </li><li> Hinzufügen eines gleichen Volumens 50% Aufschlämmung auf jeden Antikörper-Lysat Probe und nutieren für ≥ 1 h bei 4 ° C. </li></ol> 3. Acyl-Biotin Exchange: Hydroxylamin (HAM) Spaltung <ol><li> Während der Durchführung von Schritt 2.2, vorzubereiten eine Anzahl von Rohren mit Lysispuffer (LB) Different pHs. Der pH-Wert ist sehr wichtig für diese Schritte und sollten immer eingestellt unter Verwendung eines pH-Meters wird. Planen 2 ml LB pH 7,2 pro Probe und 0,5 ml Puffer pro Stringente Probe (Tabelle 1). Bereiten auch 0,5 ml LB + 10 mM NEM pro Probe, wie in Schritten von 1,1 bis 1,3. Hinzufügen PMSF und Proteaseinhibitor-Tabletten zu allen Lysepuffer, wie in Schritt 1.1. </li><li><ol class="lalpha"><li> Hydroxylamin (HAM) ist ein starkes Reduktionsmittel, deren Spaltung von Palmitat aus Cysteinen für Biotinylierung (Abbildung 1) erforderlich ist, und der Wegfall der HAM-Spaltung dient als negative Kontrolle. Split jede Probe von Kügelchen in zwei Proben, ein Weglassen des HAM Spaltungsschritt (-HAM) und eine einschließlich der HAM Schritt (+ HAM). Um für den Proteinabbau durch HAM Behandlung verursacht normalisieren, sollte man jede Probe in Drittel aufgeteilt, mit 1/3 der Kügelchen für die HAM-Steuerung verwendet und die restlichen 2/3 für die + HAM Behandlung verwendet. </li><li> Bereiten Sie zusätzlich 1.5 ml Röhrchen auf Eis, da die-HAM Steuerung für jede Probe beschriftet. Nach Schritt 2,2, sanft zentrifugiert Alle Proben &#39;Perlen bei 0,5 ug / 1 min bei 4 ° C (Zentrifuge bei dieser Geschwindigkeit, Dauer und Temperatur für alle weiteren Schritte, sofern nicht anders angegeben), legen Sie die Röhrchen auf Eis, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Perlen in 600 ul LB + 10 mM NEM. </li></ol></li><li> Nach Resuspendieren der Proben &quot;Perlen in Lysepuffer + NEM 10mM sofort sammeln 200 ul der Probe Lysat-Kügelchenaufschlämmung und Einleitung in die Probe-HAM Röhrchen auf Eis. Fügen Sie eine weitere 300 ul LB + 10 mM NEM die-HAM Probe und eine zusätzliche 100 ul der + HAM Probe für insgesamt 500 ul in jeder Probe. Die Röhrchen für 10 min auf Eis. </li><li> Resuspendieren (waschen) the-HAM und + HAM Proben vorsichtig mit 0,5 ml strengen Puffer pro Probe. Diesen Schritt schnell, wie ein längerer Inkubation in SDS Entfernung von gebundenem Antikörper aus dem Ergebnis wirdPerlen. </li><li> Vorsichtig waschen Alle Proben dreimal in 0,5 ml / Probe LB pH 7,2, und Spin-down zwischen Wäschen in Schritt 3.2b. </li><li> Während der Durchführung von Schritt 3,5, bereiten Sie einen HAM-Puffer (Tabelle 1). Hinzufügen geeigneten Volumen Hydroxylaminlösung in ein neues Röhrchen, um eine Endkonzentration von 1 M in einem Volumen von 0,5 ml LB pH 7,2, pro Probe + HAM erreichen. Immer Vorbereitung der HAM-Puffer frisch für den Tag des Experiments. 0,5 ml / Probe der LB pH 7,2 bis alle Proben-HAM und 0,5 ml / Probe des HAM-Puffer für alle + HAM Proben. </li><li> Nutieren alle Proben für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT). Nicht mehr als 1 Stunde. </li></ol> 4. Acyl-Biotin Exchange: Biotin-BMCC Labeling <ol><li> Während der Durchführung von Schritt 3.6, vorzubereiten 2 ml LB pH 6,2 pro Probe (Tabelle 1), wie in Schritt 3.1. Legen Sie die LB pH 6,2 auf Eis, bis sie benötigt. Bereiten auch eine Stammlösung von Biotin-BMCC (Tabelle 1) unmittelbar vor Gebrauch. Abwiegen exactly 2,1 mg Biotin-BMCC, in einem 1,5-ml-Tube sammeln und vorsichtig in 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zu lösen, indem auf einem Schüttler bei RT bis 8mm Konzentration (verwenden Sie nicht eine Pipette zum Aufbrechen des Pulvers zu erreichen ). </li><li> Sobald der Schritt 3,6 abgeschlossen ist, vorsichtig waschen die Perlen einmal in pH 6,2 Lysepuffer, um restliche HAM Puffer zu entfernen. Entfernen Sie den Überstand und legen Sie die Proben auf Eis. </li><li> Biotin-BMCC ist ein maliemide konjugierten Biotin-Molekül, das eine hohe Affinität zu freien Thiolgruppen der Cysteine ​​(Abbildung 1) weist. Während der Durchführung von Schritt 4,2, bereiten 0,5 ml Biotin-BMCC Buffer (Tabelle 1) pro Probe auf Arbeitsebene Konzentration zwischen 0,5 uM bis 5 uM. Konzentrationen von mehr als 5 uM wird wahrscheinlich zu sättigen das Zielprotein 6, und in der Regel nicht überschritten werden sollte, aber dies kann je nach der gewünschten Zielproteins. 0,5 ml Biotin-BMCC Puffer zu jeder Probe, und nutieren genau 1 Stunde bei 4 &amp;deg; C Nicht mehr als 1 Stunde. </li></ol> 5. Elution von Biotin-konjugiertem Zielprotein und SDS-PAGE <ol><li> Sobald der Schritt 4,3 abgeschlossen ist, vorsichtig waschen alle Proben einmal in LB pH 6,2. Bewahren Sie alle Proben auf Eis zwischen Wäschen. Entfernen 2x SDS Probenpuffer ohne Reduktionsmittel (Tabelle 1) von -20 ° C Lagerung und langsam auf Eis auftauen. </li><li> Vorsichtig waschen Proben dreimal in LB pH 7,5 + PMSF / Inhibitoren, und halten Proben auf Eis zwischen Wäschen. </li><li> Entfernen des Überstands des dritten Wäsche, so dass die pelletierten Kügelchen in einer Aufschlämmung mit verbleibenden Puffer in dem Boden des Röhrchens. Tauchen Sie ein Pipette mit einem kleinen Durchmesser Spitze (a Spitze für Gel-oder P2 Pipettenspitze sind ausreichend) in die ganz unten auf der Röhre durch den Schlamm und schnell zu sammeln alle verbleibenden Puffer, man aufpassen, nicht zu nehmen keine Perlen. </li><li> Ergänzen Sie die 2x SDS Probenpuffer mit DL-Dithiothreitol (DTT) bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zu erreichen. Hinzufügen40-50 ul 2x Probenpuffer + 5mM DTT zu jeder Probe. Wenn nötig, Wirbel die Perlen vollständig mit dem Probenpuffer vermischt und sofort mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert, um alle Perlen in einem Pellet, in Probenpuffer untergetaucht zu sammeln. </li><li> Sieden alle Proben 10 Minuten lang bei 75-80 ° C. Lassen Proben cool RT für ≥ 10 min auf der Bank oben und Zentrifuge bei 16.000 xg / 3 min vollständig Pellet der Perlen. </li><li> Fügen gesamte Volumen der eluierten Protein (Überstand) von jeder Probe zu einer einzigen Spur in einem Polyacrylamidgel für Western Blot, mit SDS-PAGE 7. Alle Proben anzuordnen, so daß die Steuerung-HAM Elutionsmittel und + HAM Eluent für eine einzelne Probe unmittelbar benachbart zueinander während der SDS-PAGE (Abb. 2) ausgeführt werden. Nach der SDS-PAGE, einem PVDF oder Nitrozellulosemembran übertragen. </li></ol> 6. Western Blot und Detektion von Palmitoylierung von Target Protein <ol><li> Sobald der Schritt 5,6 abgeschlossen ist, waschen Sie die Membranzweimal in Saline (TBS 1x) für 10 min auf einer Schüttelplattform bei RT Tris-gepuffert. </li><li> Vorbereiten einer Blocking Buffer um nicht-spezifische Markierung durch Auswiegen Bovine Serum Albumin (BSA), zu 3% Gewicht in einem Volumen von TBS 1x erreichen blockieren Tween-20 + 0,05% (TBS-T), die ausreicht, um vollständig eintauchen die Membran . Für Streptavidin Blotting, immer mit BSA blockiert und nicht Milchpulver. Blockieren der Membran für 1 h bei RT auf einem Schüttler Plattform. </li><li> Bereiten Sie eine Antikörper-Lösung der TBS-T + 0,3% BSA. Hinzufügen Streptavidin-HRP-Antikörper rekonstituiert auf 1 mg / ml in destilliertem Wasser bei 1:5,000-1:10,000 verdünnt. Sobald der Schritt abgeschlossen ist 6,2, waschen die Membran einmal in TBS-T für 10 min, dann Inkubieren der Membran in Streptavidin-Antikörper-Lösung auf einem Schüttler für entweder für 1 h bei RT, oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen der Membran dreimal in TBS-T für 10 min auf einem Schüttler Plattform. Um die Palmitoylierung Signal zu erfassen, das HRP freizulegen Lumineszenz unter Verwendung einer chemiluminescent Substrat-Kit. </li><li> Um Palmitoylierung Ebenen zu der Menge des Proteins von Interesse, immunpräzipitiert wurde normalisieren, Streifen der Membran unter Verwendung Westernblot Stripping Puffer für 5-10 min auf einer Schüttelplattform bei RT. Die Schritte von 6,1 bis 6,4 mit dem primären Antikörper gegen das Protein von Interesse, die ursprünglich für die Immunpräzipitation verwendet wurde. </li><li> Quantifizieren Palmitoylierung des Proteins von Interesse unter Verwendung der Bildanalyse-Software, und normalisieren Palmitoylierung Ebenen zur Höhe des immunpräzipitierten Protein. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die IP-ABE-Assay präsentiert hier ist eine einfache und hochempfindliche Methode zur Detektion palmitoylierte Proteine ​​in kultivierten primären hippocampalen Neuronen, die meist von biochemischen Standardtechniken. Dies macht den Test leicht anpassbar für Labore bereits mit Western-Blot-Materialien ausgestattet. Die IP-ABE-Assay kombiniert eine Standard-Immunopräzipitation-Protokoll zu isolieren und zu immobilisieren eigenen Zielprotein durch zuvor beschriebenen ABE Chemie 2-4 gefolgt, um schnell zu erkennen Ebenen Palmitat auf einem Substrat Protein. Die ABE Technik weist ein breites Spektrum von Anwendungen zum Überprüfen palmitoylierten Proteine ​​in verschiedenen Geweben und Zelllinien, einschließlich großflächigen Palmitoyl-Proteom Screening von globalen Palmitoylierung Profile und schnellen Nachweis von Palmitoylierung Ebenen eines einzelnen Zielproteins. Vorherige Beschreibungen der ABE Chemie haben verschiedene Methoden Zelllyse und Detergenzextraktion neuronaler prot genutzteins 2, 9, freie Thiol-Blockade 10, 11, Biotinylierung, und Aufreinigung des Zielproteins 4, abhängig von der Anwendung des Experiments. Die Zugabe von Palmitat zu neuronalen Proteinen führt zu deren Ausrichtung in Richtung Zellmembranen, und Detektion des palmitoylierten Bruchteil eines Zielproteins erfordert ihre Extraktion aus dieser Membranen. Zuvor beschriebenen Methoden ABE haben eine Vielzahl von ionischen 9 und nicht-ionischen Detergenzien 8 bis gewünschten Zielproteine ​​extrahieren verwendet, und die Verwendung eines bestimmten Detergens abhängig vom Zielprotein und seiner bekannten Membranverkehr. Hier nutzen wir das nicht denaturierende und nichtionischen Detergens IGEPAL CA-630 bis palmitoylierten Proteine, die wir für die Extraktion und Detektion des palmitoylierten neuronaler Protein δ-Catenin (Abbildung 2) bestätigt wurden extrahieren. Die Struktur IGEPAL CA-630 enthält einen sperrigen und starren nicht-polaren Kopfgruppe, die nichtstören nativen Proteinkonformation oder Wechselwirkungen, die aber ihre Verbindung kann mit den hydrophoben Bereichen von Membran-assoziierten Proteinen, um dadurch Übertragung Mischbarkeit zu ihnen und ermöglicht ihre Extraktion. Viele neuronaler Proteine ​​lokalisiert dem synaptischen Membran oder postsynaptische Dichte von Synapsen extrahiert werden soll, indem IGEPAL CA-630 werden jedoch einige möglicherweise nicht vollständig löslich zu machen, und kann die Verwendung eines anderen nicht-denaturierenden Detergenz, wie Triton X-100, die erforderlich ist zuvor für ABE Chemie 2, 8 genutzt. Mehrere Beschreibungen von ABE Chemie haben auch einen anderen thiolreaktive Biotinylierungsreagenz aus dem Molekül Wir beschreiben hier, genannt Biotin-HPDP (Thermo Scientific), die auch bedingt eine unterschiedliche Mittel Proteinreinigung 4 ausgenutzt. Biotin-HPDP ist ein weiteres thiolreaktive, maliemide-konjugierten Biotin-Molekül, das eine Disulfidbindung in der Linkerarms maliemide enthält, strukturell differentiating aus Biotin-BMCC, die nicht enthält dieses Disulfidbindung. Nach Thiol-Biotinylierung eines Proteins frei oder palmitoylierten Cystein durch Biotin-HPDP, kann die resultierende Disulfid-Bindung zwischen dem Zielprotein und dem Biotin-Gruppe durch reduzierenden Reagenzien, um die Biotin-Gruppe freizugeben und zu regenerieren, die das Protein in seiner unmodifizierten Form abgespalten werden, wodurch Biotinylierung von Biotin-HPDP vorübergehend und reversibel. Daher verwenden hierfür Biotinylierungsreagenz erfordert Reinigung eines Target-Proteins durch immobilisiertes Avidin Reagenzien wie Streptavidin-beschichtete Beads. Jedoch Thiol-Biotinylierung eines Zielproteins durch Biotin-BMCC, wie hier beschrieben wird, ist stabil und relativ dauerhaft und braucht Reinigung des Zielproteins durch einen Antikörper, der gegen das Ziel, und immobilisiert auf Sepharosebeads. Beide ABE Techniken wurden bisher für große Bildschirme und Erkennung von Palmitoylierung einzelner Proteine ​​2, 8-10, 12 eingesetzt, und dieIP-ABE Assay Wir beschreiben hier optimal ist für die schnelle Erkennung der Palmitoylierung von einzelnen neuronalen Zielproteine. Eine überwältigende Mehrheit der zellulären Palmitoylierung beinhaltet die reversible Addition von Palmitat an die Thiolgruppe von Cysteinen (sog. S-Palmitoylierung, die wir als &#39;Palmitoylierung&#39; in diesem Protokoll zu verallgemeinern), sind jedoch eine sehr begrenzte Gruppe von Proteinen zu irreversiblen Palmitoylierung am Glycin ausgesetzt und Cysteinreste durch die Bildung stabiler Amidbindungen, N-Palmitoylierung 13 bezeichnet. Eine Einschränkung von ABE Chemie ist ihre Unfähigkeit, N-Palmitoylierung wegen der Stabilität der Amidbindung zu detektieren, und so Screening einer neuartigen Zielprotein für Palmitoylierung sollte bestätigt mit 3H-Palmitat metabolische Markierung 1 werden. Wie zuvor erwähnt, kann die IP-ABE Assay zur Untersuchung leicht Palmitoylierung in Proteinextrakten aus verschiedenen Quellen, einschließlich tran angepasst werdensfected heterologen Zelllinien, primären Gewebes und primären neuronalen Kulturen von verschiedenen Gehirnregionen. Die IP-ABE Assay wurde für die Prüfung Palmitoylierung ausreichenden mutierten Cystein-zu-Serin Proteine ​​an der Position eines Cysteins palmitoylierten entlang eines Zielproteins 8 kennzeichnen, der für die Prüfung dynamischer Palmitat Umsatz an synaptischen Proteinen in kultivierten Neuronen unter basalen Bedingungen 10 verwendet worden, und Veränderungen in Palmitoylierung Ebenen neuronaler Proteine ​​nach Induktion der neuronalen Aktivität 9. Die Empfindlichkeit und Anpaßbarkeit der IP-ABE Assay ideal geeignet ist für die Prüfung Palmitoylierung Profilen neuronaler Proteine ​​und optimale zur Erfassung dynamischer Veränderungen Palmitoylierung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> Sigma </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93482 </td><td></td></tr><tr><td> Protease Inhibitor Cocktail </td><td> Roche Complete Mini </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> NEM </td><td> Sigma </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> HAM-Lösung </td><td> Sigma </td><td> 46780-4 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td> Die Kompatibilität mit ausgewählten Reinigungsmittel </td></tr><tr><td> Protein G / A-Sepharose-Kügelchen beschichtete </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6002-35 </td><td></td></tr><tr><td> Biotin-BMCC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21900 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21126 </td><td> Rekonstituieren mit 1 mg / ml in Wasser </td></tr><tr><td> Western Blot Stripping Buffer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21059 </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of protein palmitoylation in cultured hippocampal neurons by immunoprecipitation and acyl-biotin exchange (abe)

Palmitoylierung ist eine posttranslationale Modifikation, die Lipid die Befestigung einer 16-Kohlenstoff-gesättigten Fettsäure, Palmitat, um Cysteinreste des Substrats durch eine labile Proteine ​​Thioesterbindung [Übersicht in 1]. Palmitoylierung von einem Substrat-Protein erhöht die Hydrophobie, und in der Regel erleichtert die Bekämpfung Richtung Zellmembranen. Neuere Studien haben gezeigt, Palmitoylierung einem der häufigste Lipidmodifikationen in Neuronen 1, 2 sein, was nahe legt, dass Palmitat Umsatz ist ein wichtiger Mechanismus, durch den diese Zellen regulieren die Targeting und Trafficking von Proteinen. Die Identifizierung und Erkennung von palmitoylierten Substrate können und daher besser unser Verständnis von Protein-Trafficking in Neuronen. Detektion von Protein Palmitoylierung in der Vergangenheit wurde technisch aufgrund des Fehlens einer Konsensussequenz unter Substratproteine ​​behindert, und die Abhängigkeit von metabolischen labeling von Palmitoyl-Proteine ​​mit 3 H-Palmitat, ein zeitaufwändiger biochemischen Assay mit niedriger Empfindlichkeit. Entwicklung des Acyl-Biotin Exchange (ABE) Assay ermöglicht schnelleren und hohe Empfindlichkeit Nachweis von Proteinen palmitoylierten 2-4 und ist optimal zur Messung des dynamischen Umsatz von Palmitat auf neuronalen Proteinen. Die ABE Assay wird von drei biochemischen Schritten (Figur 1) umfasst: 1) irreversiblen Blockade von unmodifizierten Cystein-Thiolgruppen unter Verwendung von N-ethylmaliemide (NEM), 2) spezifische Spaltung und Demaskierung der palmitoylierten Cystein die Thiolgruppe von Hydroxylamin (HAM) und 3) selektive Markierung des palmitoylierten Cystein mit einem Thiol-reaktiven Biotinylierungsreagenz, Biotin-BMCC. Die Reinigung der Thiol-biotinylierten Proteine ​​nach den ABE Schritte hat unterschieden, je nach dem allgemeinen Ziel des Experiments. Hier beschreiben wir eine Methode, um eine palmitoylierten Protein von Interesse in der primären Hippocamp reinigenal Neuronen durch einen anfänglichen Immunopräzipitation (IP) unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Protein, von dem ABE und Western Blot-Assay zum direkten Messen Palmitoylierung Niveaus dieses Proteins, der die IP-ABE Assay bezeichnet wird gefolgt gerichtet. Low-Density-Kulturen von embryonalen Ratten hippocampalen Neuronen wurden häufig verwendet, um die Lokalisation, Funktion und Menschenhandel neuronaler Proteine ​​zu untersuchen, so dass sie ideal geeignet für die Untersuchung neuronaler Protein Palmitoylierung über die IP-ABE-Assay. Die IP-ABE Assay erfordert hauptsächlich Standard IP und Western Blot Reagenzien und wird nur durch die Verfügbarkeit von Antikörpern gegen das Zielsubstrat begrenzt. Dieser Assay kann leicht zur Reinigung und zum Nachweis von transfizierten palmitoylierten Proteine ​​in heterologen Zellkulturen, primären neuronalen Kulturen von verschiedenen Hirngewebe von Maus und Ratte abgeleitet sind und auch primäre Hirngewebe selbst angepasst werden.

Die IP-ABE Assay detektiert spezifisch Thiol-Palmitoylierung von Cysteinresten entlang Substrat Proteine ​​und können verwendet werden, um die Palmitoylierung von immunpräzipitierten neuronaler Proteine ​​in einer Weise in 1 dargestellt detektieren. Behandlung des Proteins mit neuronalen immunpräzipitierten HAM (Abbildung 1) spaltet die Thioesterbindung zwischen Palmitat und einem Cystein der Thiolgruppe, so dass für spezifische Einbau von Biotin-BMCC auf die neu verfügbaren Thiolgruppe, die anschließend nachgewiesen werden kann unter Verwendung von Western Blotting. Das Weglassen HAM (minus-HAM) Spaltung verhindert die Inkorporation von Biotin-BMCC und fungiert als negative Kontrolle für Palmitoyl-spezifische Biotinylierung des Plus-HAM Probe, und sollte daher stets benachbarte laufen an den Plus-HAM Probe werden für westlichen Blotting durch SDS-PAGE (Abb. 2). In einer optimierten Experiment (2A), die PalmitoylierungSignal der neuronalen Proteinextravasation δ-Catenin 2 kann leicht durch Blotting für Biotin-BMCC bei einer Konzentration von 1 nM, unter Verwendung von Streptavidin, konjugiert mit HRP, gegen parallel minus-und plus-HAM Proben nachgewiesen werden. Die spezifische Palmitoylierung Signal für δ-Catenin erscheint an dessen vorhergesagten Größe von 160kD, nur in der Plus-HAM Probe. Die Spezifität dieses Signals wurde durch Rehybridisierung für δ-Catenin mit dem spezifischen Antikörper, die ursprünglich verwendet wurde, um es immunpräzipitieren, was in einem Signal in beiden HAM Behandlungen gleichzeitig vorhergesagten Größe bestätigt. Optimierung der IP-ABE Assay (2A) wird in einem Western-Blot-Profil einer Minus-HAM Probe, die leicht von dem Plus-HAM Probe führen wird und eine minimale bis keine Palmitoylierung Signal. Die Konzentration von Biotin-BMCC zur palmitoylierten Cysteine ​​beschriften erfordert eine sorgfältige Optimierung, und wenn ein super-Sättigungskonzentration von biOtin-BMCC wird während der ABE Chemie Schritte (2B), übermäßige Hintergrund und unspezifische Signale sichtbar sein wird. Eine lineare Kennlinie für die Biotinylierung eines palmitoylierten neuronaler Protein, dem nikotinischen Acetylcholinrezeptor α7, unter Verwendung von Biotin-BMCC wurde zuvor 6 bestimmt und zeigt nahezu vollständigen Sättigung bei einer Konzentration von 5-10 pM. Obwohl die optimale Konzentration von Biotin-BMCC wird abweichen leicht je nach neuronalen Zielprotein, wird die Behandlung mit Biotin-BMCC in einer Konzentration von mehr als 5 uM wahrscheinlich super-Sättigung des Zielproteins und resultieren in einem Western Blot Profil mit sichtbarer Hintergrund und unspezifische Signale. Eine Konzentration von 0,5 pM für Biotin-BMCC wurde zuvor verwendet, um die Palmitoylierung von anderen neuronalen Proteinen einschließlich SNAP-25, Huntingtin, AMPA-Rezeptor-Untereinheiten und GluA1 GluA2 und Paralemmin 8, und Bestimmung der optimalen Konzentration eines neuartigen detektierenZielprotein kann durch Versuch und Irrtum in linearer Weise bewerkstelligt werden, beginnend im Bereich von 0,5 bis 5 uM, daß wir hier beschreiben. Die daraus resultierenden Streptavidin Western-Blot-Profile unter den Minus-und Plus-HAM Proben für δ-Catenin Palmitoylierung ähnlich aussehen, wenn sie mit 4 uM Biotin-BMCC (2B), mit zusätzlichen Hintergrundinformationen Signalen in verschiedenen Größen, so dass unangemessen Biotinylierung aufgetreten ist behandelt. Hydroxylamin ist ein starkes Reduktionsmittel, das zu begrenzter Abbau des Zielproteins neben seiner effizienten Spaltung Thioesterbindung. Folglich erfordert Optimierung ABE Chemie ein, die Menge an Protein für immunpräzipitierten minus-und plus-HAM Proben (Schritte 3.2 - 3.3) verwendet normalisieren. Normalisierung erfordert die Verwendung der doppelten Menge an immobilisiertem Zielprotein in der Plus-Minus-vs-HAM Probe, die tatsächlich zu ununterscheidbar western Blotting Profile für das Zielprotein, wie für δ-Catenin (Abbildung 2A, B) gezeigt. Wenn jedoch die Menge der immobilisierten Ziel-Protein nicht zwischen minus-und plus-HAM Proben normalisiert, kann das resultierende Westernblot Signal für das Zielprotein in der Plus-HAM Probe verloren, da für δ-Catenin gezeigt, wenn gleiche Mengen an Protein wurden in beiden Behandlungen HAM (2C) verwendet. Die Spezifität der ABE Chemie für die Kennzeichnung palmitoylierte Proteine ​​ist sehr empfindlich und erfordert die Optimierung. Die häufige Fehler bei der IP-ABE Assay angetroffen umfassen die suboptimalen Ergebnissen in den 2B und 2C gezeigt, und Abbau des Zielproteins, unabhängig von HAM Behandlung, die typischerweise durch ältere Reagenzien und Puffer verursacht werden und falsche pH. Um diese Fehler zu vermeiden und zu korrigieren suboptimale ABE Chemie, die Frische und Konzentration der Reagenzien für die erforderlichePuffern in Tabelle 1 aufgelisteten sollte immer geprüft werden, und die pH-Einstellungen aller Puffer sollten immer vor der Ausführung des Experiments überprüft werden. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Puffer </td><td> Working Concentration </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Lysispuffer (LB) </td><td> In destilliertem H 2 O: 1% IGEPAL CA-630 50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl 10% Glycerin </td><td> N / A </td><td> Vorbereiten, bevor Experiment und bei 4 ° C </td></tr><tr><td> NEM-Lösung </td><td> In 100% EtOH: NEM lyophilisierte Pulver </td><td> 2 M </td><td> Ansetzen, unmittelbar vor Gebrauch. </td></tr><tr><td> Strenge Buffer </td><td> In LB: 10 mM MEM 0,1% SDS </td><td> N / A </td><td> Planen kurz vor Gebrauch auf Eis zu halten. </td></tr><tr><td> LB pH 7,2 </td><td> In LB: pH-Wert auf genau 7,2 </td><td> N / A </td><td> Verwenden Sie einen pH-Meter auf pH unmittelbar vor Gebrauch einzustellen. </td></tr><tr><td> HAM Buffer </td><td> In LB pH 7,2: Auf HAM-Lösung </td><td> 1 M (final HAM Konzentration) </td><td> Planen unmittelbar vor Gebrauch. </td></tr><tr><td> LB pH 6,2 </td><td> In LB: Der pH-Wert exakt 6,2 </td><td> N / A </td><td> Gleiche wie für LB pH 7,2 </td></tr><tr><td> Lager Biotin-BMCC Lösung </td><td> In DMSO: 2,1 mg Biotin-BMCC Lösung </td><td> 8 mM </td><td> Planen unmittelbar vor Gebrauch. </td></tr><tr><td> Biotin-Buffer BMCC </td><td> In LB pH 6,2: In Biotin-BMCC Lösung </td><td> 1 bis 5 uM (final Biotin-BMCC Konzentration) </td><td> Planen unmittelbar vor Gebrauch. </td></tr><tr><td> 2x SDS Sample Buffer, keine Reduktionsmittel </td><td> In destilliertem H 2 O: 5% SDS 5% Glycerol 125mm Tris-HCL pH 6,8 0,01% Bromphenolblau </td><td> N / A </td><td> Vorbereiten, bevor Experiment, und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Ergänzung mit 5 mM DTT vor Gebrauch. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Puffer und Reagenzien für die IP-ABE-Assay benötigt. Viele der Lysepuffer kann vor Beginn des Experiments, aber der pH-Wert sollte überprüft werden und unmittelbar vor der Verwendung mit einem pH-Meter eingestellt, um den Erfolg der ABE Chemie sicher vorbereitet werden. Die Mehrheit der Stammlösungen sollten bereit sein, für jedes Experiment frisch, unmittelbar vor Gebrauch. Viele der Puffer erfordern Reagenzien in den meisten Laboratorien für Biochemie ausgestattet und spezielle Reagenzien mit Lieferanteninformationen sind in der Tabelle von Reagenzien und Geräten angegeben. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Schema der Immunpräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (IP-ABE) Assay zur Reinigung und detektieren Palmitoylierung neuronaler Proteine. Kultivierten hippocampalen Neuronen lysiert werden, (1) ein Ziel-Protein wird dann unter Verwendung einer Ziel-spezifischen Antikörper, und immobilisiert auf Sepharose Kügelchen mit Protein G oder A beschichtet Das gereinigte Zielprotein dann (2) mit N-ethylmaliemide (NEM) irreversibel zu binden und blockieren freie Thiol (-SH) Gruppen entlang unmodifizierte Cysteine ​​(C). Das Zielprotein wird dann (3) auf eine Behandlung mit Hydroxylamin (HAM) unterzogen, wodurch spezifische Spaltung von Bindungen an Thioester palmitoylierten Cysteinen und die Demaskierung eines freien palmitoylierten Thiolgruppe (-SH). Als nächstes wird das Zielprotein (4) treated mit einem Thiol-reaktiven Biotin-Molekül, Biotin-BMCC, wodurch spezifische Biotinylierung des Cysteins palmitoylierten. Schließlich, (5) das biotinylierte Zielprotein eluiert und aus dem Antikörper und Wulst. Das Zielprotein mit seinen palmitoylierten Cystein (s) mit Biotin markiert ist nun für SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blot mit Streptavidin für Palmitoylierung des gereinigten neuronalen Protein nachzuweisen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="Abbildung 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> Abbildung 2. Detektion Palmitoylierung des neuronalen Proteinextravasation δ-Catenin unter Verwendung der IP-ABE Assay. Primären Ratten hippocampalen Neuronen wurden als Pre gezüchtetbisher beschriebenen 5, bei einer Dichte von 130 Zellen / mm 2 bis zur Fälligkeit bei 14DIV wurden dann lysiert, und einer der IP-ABE Assay Palmitoylierung eines kürzlich identifizierten palmitoyliert neuronalen Substrat, δ-Catenin 2 zu erfassen. Gereinigtes Immunpräzipitaten (IPs) von δ-Catenin (Zielprotein) wurden isoliert unter Verwendung von 5 ug δ-Catenin-Antikörper pro Probe (BD Transduction Laboratories), und wurden dann in SDS-PAGE parallel minus-und plus-hydroxylamin (HAM) ausgesetzt Proben. Palmitoylierung wurde durch Western-Blot (WB) mit Streptavidin-HRP (Palmitoylierung) erfasst wird, und die Membran wurde gestrippt und einer reprobe WB für δ-Catenin. (A) Eine optimierte repräsentativen IP-ABE Ergebnis für palmitoylierten δ-Catenin (Pfeilspitze) behandelt mit 1 uM Biotin-BMCC, welche die Spezifität der ABE Chemie zum Nachweis von Thiol-palmitoylierten Proteine ​​aus IP Proben. (B) A sub-optimal vertretenrepräsentativen IP-ABE Ergebnis für δ-Catenin, in denen ein Überschuß Konzentration von 4 Biotin-BMCC uM verwendet wurde, was zu nicht-spezifische Signale und Hintergrund in beiden minus-und plus-HAM Proben (Pfeile). (C) Ein weiterer suboptimalen repräsentativen IP-ABE WB für δ-Catenin, in denen eine übermäßige Konzentration von 4 uM Biotin-BMCC verwendet wurde, und der Menge an Protein für die plus-HAM IP Probe verwendet wurde nicht für HAM-vermittelte normalisiert Proteinabbau, was zu einem Signal verloren in der reprobe WB für δ-Catenin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

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Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Die reversible Zugabe von Palmitat an Proteine ​​ist ein wichtiger Regulator des intrazellulären Protein-Trafficking. Dies ist von besonderem Interesse, wo viele Neuronen synaptische Proteine ​​palmitoyliert. Wir nutzen einen einfachen biochemischen Verfahren zur palmitoylierten Proteinen in kultivierten Neuronen, die für mehrere Zelltypen und Gewebe angepasst werden kann zu detektieren.

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

35.2K Aufrufe.  University of British Columbia. Die reversible Zugabe von Palmitat an Proteine ​​ist ein wichtiger Regulator des intrazellulären Protein-Trafficking. Dies ist von besonderem Interesse, wo viele Neuronen synaptische Proteine ​​palmitoyliert. Wir nutzen einen einfachen biochemischen Verfahren zur palmitoylierten Proteinen in kultivierten Neuronen, die für mehrere Zelltypen und Gewebe angepasst werden kann zu detektieren.

Serie: Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) der Fluoreszenz-markierten Proteine ​​in dendritischen Dornen von hippokampalen Neuronen

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induktion von dendritischen Wachstums in Cultured sympathischen Neuronen

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolierung und Kultivierung von Neuronen im Hippocampus von Mäusen Pränatale

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.