Diese biochemische Methode ermöglicht die Bestimmung des Palmitoylationszustands jedes Membranproteins, das im Gehirn exprimiert wird und für das ein geeigneter Antikörper zur Verfügung steht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie keine Affinitätsreinigung erfordert und stattdessen Änderungen in der Gelmobilität nutzt, um die Anzahl der Modifikationen eines Proteins von Interesse zu bestimmen. Nach dem Aussezieren des Gehirns, homogenisieren Sie es sofort in 10 Milliliter Homogenisierungspuffer in einem Glas homogenisator auf Eis.
Mit ca. 12 Schlägen zentrifugieren Sie die Lysate 15 Minuten bei 1400 mal G und vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre auf Eis. Das Pellet in 10 Milliliter Homogenisierungspuffer aussetzen.
Homogenisieren Sie es mit etwa sechs Strichen. Zentrifugieren Sie die Federung bei 710 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Kombinieren Sie die Überstand und Zentrifuge sie bei 40, 000 mal G und vier Grad Celsius für 20 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die pelletierte Membranfraktion in einem Homogenisierungspuffer wieder auf, indem Sie das Pellet mit einer Pipettenspitze aufbrechen und nach oben und unten pfeifen. Führen Sie ABCA-Assay durch, um den Proteinspiegel zu quantitieren. Um den APEGS-Test durchzuführen, legen Sie 470 Mikroliter Puffer A in eine 1,5-Milliliter-Röhre und fügen Sie etwa 100 bis 200 Milligramm Protein hinzu.
Sonicate die Röhre und dann trennen Sie das unlösliche Protein durch Zentrifugieren der Röhre bei 25 Grad Celsius und einem Minimum von 13.000 mal G für 10 Minuten. Übertragen Sie das lösliche Protein in eine neue 1,5-Milliliter-Röhre. Erstens, stören Sie die Disulfidbindungen, indem Sie das lösliche Protein in 25 Mikroliter TCEP für 60 Minuten bei 55 Grad Celsius inkubieren.
Dann blockieren Sie freie Cysteins, indem Sie die Lösung mit 12,5 Mikrolitern der Stammlösung von NEM für drei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes beginnen Sie den Prozess der Chloroform Methanol Fällung. Übertragen Sie die Proteinlösung aus dem 1,5-Milliliter-Rohr auf ein Polypropylen- oder Glasrohr, das in einem schwingenden Schaufelrotor mit bescheidener Geschwindigkeit zentrifugiert werden kann.
Fügen Sie zwei Milliliter Methanol und Wirbel kurz hinzu. Fügen Sie einen Milliliter Chloroform und Wirbel kurz hinzu. Dann 1,5 Milliliter entionisiertes Wasser und Wirbel kurz wieder hinzufügen.
Falls erforderlich, invertieren Sie das Rohr, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie die Proben bei 3000 mal G und 25 Grad Celsius für 30 Minuten in einem schwingenden Schaufelrotor. Entfernen und entsorgen Sie die obere Phase der Lösung vorsichtig in einem Rohr.
1,5 Milliliter Methanol hinzufügen. Mischen Sie sanft, aber gründlich durch sanfte Umkehrung der Röhre, achten Sie darauf, nicht den undurchsichtigen Protein Pfannkuchen fragmentieren. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten in einem schwingenden Schaufelrotor.
Mit einer serologischen Glaspipette so viel wie möglich von der Obersten Phase der Lösung entfernen, ohne den Proteinpfannkuchen zu stören. Spülen Sie das Pellet vorsichtig mit einem Milliliter Methanol ab und lassen Sie es mindestens 10 Minuten trocknen. Wenn die Chloroform Methanol-Fällung abgeschlossen ist, beginnen Sie die Spaltung der Palmitoyl-Thioester-Verbindungen, indem Sie den Proteinauslauf in 125 Mikroliter Puffer A.Transfer in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr wieder aufsetzen.
Beschallen Sie das Rohr kurz und zentrifugieren Sie es dann bei 13 000 mal G oder höher und 25 Grad Celsius für 10 Minuten, um unlösliches Material zu entfernen. Übertragen Sie das lösliche Protein in neue 1,5-Milliliter-Röhren und fügen Sie 375 Mikroliter Puffer H oder Puffer T hinzu. Nach der Inkubation der Proben für 60 Minuten bei Raumtemperatur, wiederholen Sie die Chloroform Methanol-Ausfällung. Um m-PEG zu ungeschützten Cysteins hinzuzufügen, beginnen Sie mit dem Wiederaufsetzen des Pellets in 100 Mikroliter Puffer A, der 10 mil oder mehr TCEP enthält.
Dann die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie 25 Mikroliter Der Vorrat m-PEG 5K Lösung und mischen durch Pipettieren. Bei Raumtemperatur mit End-over-End-Rotation inkubieren.
Entfernen Sie nach 60 Minuten Inkubation m-PEG 5K ohne Inkorporation, indem Sie erneut Chloroform-Methanol-Fällung durchführen. Zentrifuge bei mehr als 13.000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig die obere Phase wie zuvor, um den dicken, flockigen Pfannkuchen zu vermeiden.
Einen Milliliter Methanol dazugeben und schonend, aber gründlich mischen. Zentrifuge bei mehr als 13.000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und spülen Sie das Pellet mit einem Milliliter Methanol ab.
Wieder Zentrifuge bei mehr als 13.000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Nach dem Lufttrocknen des Pellets in 50 Mikroliter Puffer A ohne TCEP oder einem Reduktionsmittel wieder aufsetzen. Reservieren Sie 5 Mikroliter der Lösung für die BCA-Proteinquantitation.
Nach der Quantifizierung eine entsprechende Menge an 4x Laemmli-Probenpuffer hinzufügen. Laden Sie das Beispiel auf ein SDS-Seitengel. Verwenden Sie Standard-Trennübertragungs- und -erkennungsprotokolle für das Western-Blotting.
Um den Palmitoylierungszustand von SynDIG-Proteinen zu untersuchen, wurden P2-Membranfraktionen aus homogenisierten Maushirnen dem APEGS-Assay unterzogen. Die Trennung und Untersuchung mit Antikörpern zeigte, dass SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 und Prrt2 im Mausgehirn palmitoylated sind. Der Zweck der Chloroform-Methanol-Ausfällung besteht darin, eine Chemikalie wie NEM zu verhindern, die den nächsten Schritt des Protokolls beeinträchtigt.
Eine richtige Chloroform Methanol Fällung entfernt unerwünschte Chemikalien und minimiert gleichzeitig den Proteinverlust. Diese Methode kann auf Gehirnlysate von Mäusen unterschiedlichen Alters oder aus verschiedenen Hirnregionen angewendet werden, um die räumlich-zeitlichen Vorschriften der Palmitoylierung zu untersuchen.
