Acyl-resin assisted capture oder Acyl-RAC ist eine empfindliche und zuverlässige Methode, die verwendet werden kann, um Protein-S-Acylation in einer Vielzahl von biologischen Proben zu erkennen. Dieses Protokoll umgeht einige der Einschränkungen der metabolischen Etikettierung und Radiobeschriftung und ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis der S-Acylation mehrerer Proteine. Nicht nur lebende Zellen, sondern auch Primärgewebe und gefrorene Proben.
S-Acylation kann eine Vielzahl von zellulären Prozessen regulieren, wie Proteinhandel, Plasmamembran-Targeting, Signaltransduktion, Eisentransport und Protein-Protein-Wechselwirkungen. Es ist wichtig, für jedes Experiment eine frisch zubereitete Hydroxylaminlösung mit sorgfältig angepasstem pH-Wert zu verwenden, um eine effiziente und spezifische Spaltung der Thioesterbindung zu gewährleisten. Bei einer Demonstration dieser Methode ist es entscheidend für Schritte wie Chloroform, Methanolfällung.
Das Pfannkuchen-Formpellet, das während dieses Schritts erhalten wird, sollte sehr sorgfältig behandelt werden. Es kann zerbrechlich sein und ein teilhteller Verlust der Probe während des Schritts kann zu einer ungleichmäßigen Probenrückgewinnung führen. Demonstriert wird das Verfahren von Savannah West, einer Doktorandin unseres Labors.
Um Zelllysate zu erhalten, sammeln Sie die interessendeckenden Zellen in einem konischen Zentrifugenrohr. Und entfernen Sie alle Zellablagerungen durch Zentrifugation. Waschen Sie das Pellet in 5 Milliliter PBS.
Und die Zellen sofort in 600 Mikroliter frisch zubereiteten Lysepuffern wieder aussetzen. Die Probe bei 1.500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoshaker 30 Minuten bei vier Grad Celsius aufstellen. Vor dem Löschen der Lysate, Pelletwaschmittel und lösliches Material durch Zentrifugation.
Am Ende der Zentrifugation das gereinigte Lysat in einem vorgekühlten 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr auf Eis sammeln. Und führen Sie einen Bradford- oder Bicinchoninsäure-Assay durch, um die Proteinkonzentration nach Standardprotokollen abzuschätzen. Methanol und Chloroform im Verhältnis 2:1 lysieren.
Schütteln Sie rigoros, um eine homogene Suspension zu schaffen und zentrifugieren Sie die Probe, um ein Proteinpellet an der Schnittstelle zwischen den wässrigen und organischen Phasen zu sammeln. Kippen Sie das Rohr, verwenden Sie eine Nadel oder eine Gel-Ladespitze, um so viel Lösungsmittel wie möglich zu aspirieren. Das Proteinpellet für einige Minuten an der Luft trocknen.
Vor dem sanften Mischen des Rohrinhalts mit 600 Mikroliter Methanol, achten Sie darauf, das Pellet nicht aufzubrechen. Nach sorgfältigem Entfernen des Methanolwaschens das Proteinpellet auf einer Bankplatte ca. fünf Minuten trocknen. Als nächstes setzen Sie das Proteinpellet in 200 Mikroliter 2SHB-Puffer wieder aus.
Und Wirbel bei 42 Grad Celsius und 1.500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermo-Shaker. Wenn das Pellet aufgelöst ist, fügen Sie der Probe 200 Mikroliter 0,2%MMTS in 2SHB hinzu. Und das Protein 15 Minuten bei 42 Grad Celsius und 1.500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoshaker inkubieren.
Führen Sie am Ende der Inkubation 3:4 Chloroform-Methanol-Fällungen durch, wie gezeigt. Um das MMTS zu entfernen, lösen Sie das Pellet in 100 Mikroliter frischen 2SHB Puffer mit Wirbel. Und verdünnen Sie die Probe mit 300 Mikroliter Puffer A nach jedem Niederschlag.
Nach der endgültigen Fällung die Proben in 200 Mikroliter 2SHB-Puffer auflösen und mit 240 Mikroliter Puffer A verdünnen. Messen Sie die Proteinkonzentration erneut und legen Sie 40 Mikroliter aus jeder Probe als Eingangssteuerung beiseite. Teilen Sie Proben in zwei gleiche Volumina von 200 Mikrolitern auf. Und markieren Sie die Tuben als plus Hydroxylamin und MinusHydroxylamin.
50 Mikroliter frisch zubereitetes neutrales zwei molares Hydroxylamin zu einer Endkonzentration von 400 Millimolaren in das Plus-Hydroxylamin-Röhrchen geben. Und 50 Mikroliter neutrales zwei molares Natriumchlorid zur Negativkontrolle, ein Minus Hydroxylamin-Rohr. Dann fügen Sie 30 Mikroliter TS Perlenschlämme in jedes Rohr.
Und drehen Sie die Rohre für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Perlen viermal mit 1%SDS in Puffer A, um Resthydroxylamin zu entfernen. Nach der letzten Wäsche alle Perlenproben mit drei sanften einminütigen Mikrozentrifugationen waschen.
Sorgfältig die Überstand eisstillieren und die Perlen in 500 Mikroliter 1%SDS in Puffer A bei jeder Wäsche wieder aufhängen. Nach der letzten Wäsche, drehen Sie die Perlen vorsichtig nach unten, wie gezeigt. Und so viel Überstand wie möglich aspirieren, ohne die Perlen zu stören.
Um die Proteine aus den Perlen zu gewinnen, fügen Sie 50 Mikroliter 4%SDS-Probenpuffer in jede Röhre und inkubieren die Proben bei 80 Grad Celsius und 1, 500 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten in einem Thermoshaker. Lassen Sie die Proben am Ende der Inkubation abkühlen, bevor Sie zentrieren, um die Perlen vollständig zu pellet. Dann verwenden Sie eine Gel-Ladespitze, um die eluierten Proteine in neue 1,5-Milliliter-Röhren zu übertragen.
Und führen Sie die Proben auf einem SDS-PAGE-Gel aus, um die S-Acylation der proteine von Interesse durch Western Blotting zu analysieren. Tyrosinkinase Lck kann in Lysaten nachgewiesen werden, die mit neutralem zwei molarem Hydroxylamin behandelt werden. die Thioesterbindung zwischen Cysteinrückständen und der Fettsäure-Feuchtigkeit zu spalten.
und Reprobing mit Antikörpern gegen Proteine Fyn und LAT zeigen, dass Acyl-Harz-unterstützter Capture-Assay verwendet werden kann, um die S-Akylierung mehrerer Proteine gleichzeitig zu analysieren. Darüber hinaus kann die S-Akylierung von Lck, Fyn und LAT in primären Maussplenozyten leicht erkannt werden. Gibt an, dass diese Änderung zwischen zwei Arten konserviert wird.
Neben der Identifizierung neuartiger S-acyatierter Proteine kann diese Methode auch zur Beurteilung von Veränderungen der Protein-S-Acylation unter verschiedenen biologischen Bedingungen eingesetzt werden. Die Anzahl der neu identifizierten S-acyatierten Proteine hat enorm zugenommen, nachdem die Verdoppelung eine schnelle und zuverlässige Technik wie Acyl-RAC bedeutete. Neben der Identifizierung neuartiger S-acyatierter Proteine kann diese Methode auch zur Beurteilung von Veränderungen der Protein-S-Acylation unter verschiedenen biologischen Bedingungen eingesetzt werden.
