Diese Forschung wurde durch die Interne Research Program der NIH, National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung unterstützt.

Teil 1: Mikroskop und Vorbereitung der Imaging-Setup <ol><li> Jede invertiert konfokalen Mikroskop sollte für IVM sein. In dieser Studie eine Olympus IX81 inverses Mikroskop, mit einer FluoView-1000 konfokaler Laser-Scanning-Einheit ausgestattet war. Um die bestmögliche Auflösung zu erreichen, ist der Einsatz von Hoch NA Ziele, wie zB die Wasser-Immersions UPLSAPO 60x/1.20 NA, und der Öl-Immersion-Plan-Apo 60x/1.42 NA empfohlen. Ölimmersionsobjektive haben höhere Sammelwirkungsgrade und obwohl sie die Verwendung eines Deckglases zwischen dem Gewebe und dem Ziel, bieten sie eine bessere Bildqualität bei der Bildbereiche innerhalb von 15-20 &amp;mgr; m von der Oberfläche verwendet. Außerdem ist die Verwendung von Öl beseitigt die Sorge um die Wasserverdampfung bei längeren Imaging-Sitzungen. Um die Temperatur und Feuchtigkeit zu halten, ist das Mikroskop vollständig gekapselt und mit warmen und befeuchteten Luft versorgt werden. Alternativ kann das Tier, der Objekttisch und dieZiel muss es durch andere Mittel erwärmt werden. Zum Beispiel können chemische Heizkissen für das Tier und dem Stadium verwendet werden, und speziell Ziel Heizungen können für das Ziel (Fig. 1A) verwendet werden. Das Ziel Heizung sollte 30 Minuten vor Beginn des Verfahrens eingeschaltet werden. Hinweis: wenn die Wärme-Pads werden verwendet, um das Tier warm halten eine Gaze hat in zwischen dem Kissen und der Haut zu Ort. Die Haut hat, um Verbrennungen zu überwachen. </li><li> Die Standardschritte in den meisten der im Handel erhältlichen konfokale Mikroskope haben eine Öffnung, die verwendet wird, um verschiedene Halterungen, die verwendet werden, um Folien, Petrischalen und Platten unterschiedlicher Größen passen einzufügen. Um IVM, eine Standard-Bühneneinsatz für 35 mm Petrischalen durchführen wird auf den Kopf umgedreht, mit einem 40 mm Glasträger, die dann durch Hochvakuum-Silikonfett oder Klebeband (Abbildung 1A) gesichert abgedeckt. Eine benutzerdefinierte Einsatz kann auch aus 3 mm dicken Aluminiumplatte hergestellt werden. Die Glasoberfläche ist dann clmit 70% Ethanol und eaned swiped mit Kimwipe. </li><li> Herstellung eine maßgeschneiderte Halter für die SGs Immobilisierung (Stabilisator). Der Zweck des Inhabers ist es, die SGs vorhanden und starr koppeln sie auf die Bühne und das Deckglas zu stabilisieren. Der Halter kann aus einer 60 mm Petrischale aus Kunststoff hergestellt sein. Zunächst wird der Boden der Schale von den Wänden gebrochen und in Rechtecke von ca. 15 x 10 mm geschnitten. Dann werden die Kanten mit feinem Schleifpapier gerundet und poliert. Vier Abstandshalter (1,5-2 mm) werden durch Entfernen der Gummispitzen 1 ml Spritzenkolben aufgebaut. Durch die Verwendung von Feinpapier, wobei die Oberfläche der Abstandshalter und die vier Ecken der Kunststoffteil sind poliert. Die Abstandshalter werden dann mit Hilfe gallertSekundenKleber verklebt und mit feinem Schleifpapier auf einer ebenen Fläche später geglättet. Beachten Sie, dass bei älteren Tieren, die Größe der Halter und die Abstandshalter können erhöht werden, um etwas größer Drüsen aufzunehmen. </li><li> Herstellung der optischen Kopplungs Gel. 0,3% Carbomer-940 (Tabelle 2) Gel wird durch Erwärmen 100 ml von ultra-reinem Wasser und löst 5,47 g D-Sorbitol vorbereitet. Dann werden 0,3 g Carbomer-940 zugegeben. Das Becherglas abgedeckt sein sollten und auf einer heißen Platte Rühren (niedrigsten Heizstufe) gelegt für mehrere Stunden oder bis alle Klumpen Carbomer vollständig gelöst sind. Schließlich Triethanolamin wird tropfenweise unter leichtem Rühren, bis ein pH-Wert von etwa 7,4 erreicht ist. Das Gel wird bei 4 ° C 13 gespeichert. </li></ol> Teil 2: Tiere und Anästhesie <ol><li> Vor der Durchführung keine Experimente mit Tieren, sollten die Protokolle, die von Ihrem örtlichen Tierpflege und-Ethik-Kommission genehmigt werden. Wichtig ist, dass die Forscher richtig ausgebildet, um chirurgische Verfahren durchführen und sollten mit ihren lokalen Tierpflegeausschuss oder Institution Tierarzt vor dem Verfahren fortfahren zu konsultieren. </li><li> In dieser Studie wurde ein Maus-Modell (GFP / mTomato-Maus) durch Kreuzung FVB Mäusen löslichen GFP (GFP-Maus) wi ausdrücken abgeleitetth C57B6 Mäusen eine Membran-Targeting-Peptid mit dem fluoreszierenden Protein Tandem-Tomate (mTomato-Maus) 6 fusioniert exprimiert, wurde verwendet. Hinweis: es dauert normalerweise 20-30 min für das Tier vollständig betäubt und für die Bildgebung vorbereitet werden </li><li> Die Mäuse werden in einer kontrollierten Umgebung in der Tiereinrichtung untergebracht und läßt eine Woche vor dem Versuch akklimatisiert. Dieser Schritt ist für die Abbildung des SGs da jegliche Not führt zu einer erhöhten sekretorische Aktivität 12 erforderlich. Wasser und Nahrung sind vorhanden ad libitum. Männer 2 -5 Monate alt sind, für die Bildgebung Experimente (20-30 g) verwendet. </li><li> Vor der Narkose, wiegen die Tiere, um die richtige Dosis des Narkosemittels zu bestimmen. </li><li> Da die Belastung durch die Verabreichung von injizierbaren Anästhetika induzierten kann die sekretorische Aktivität des SGs beeinträchtigen, induzieren Pre-Anästhesie durch Isofluran-Inhalations, gefolgt von der Injektion von Anästhetika. Zu diesem Zweck legen die Mäuse sehr sanft in die Verdampferkammer, undschalten Sie den Sauerstofffluss (800-900 mmHg). Stellen Sie die Isofluran-Ebenen, um 3% auf die Pre-Narkose starten. </li><li> Sobald die Tiere bewusstlos sind, injizieren einer Mischung von 100 mg / kg Ketamin und 20 mg / kg Xylazin in der Bauchhöhle (25 G Nadel). Anästhetika werden frisch durch Verdünnen von 100 mg / ml Xylazin und 20 mg / ml in Kochsalzlösung und dann Vermischen mit dem Ketamin bereit. Dieses Gemisch wird weiter verdünnt 1:1 mit Kochsalzlösung und eine geeignete Menge wird auf der Grundlage der Tiergewicht injiziert. Diese Verdünnung hilft bei der Verhinderung versehentlichen Überdosierung. Beachten Sie, dass das Gemisch seine Wirksamkeit nach 20 min. </li><li> Beobachten Sie die Tiere auf Anzeichen von Wachheit und injizieren mehr Betäubung Mischung, wenn sie aus der Narkose kommen (ca. 75% der ursprünglichen Dosis innerhalb von 45 Minuten nach der ersten Injektion und 50% jede Stunde danach). Prüfen Sie die Tiefe der Narkose alle 15 min durch Kneifen der Pfote und die Beobachtung der Reaktion. Hinweis: Immer Augensalbe verabreichen, um zu verhindernAugentrockenheit. </li><li> Anästhetika Hypothermie induzieren, was die Reproduzierbarkeit der Experimente und die Gesundheit des Tieres beeinflussen können. Daher sollten die Mäuse unter Wärmelampe oder einem Heizkissen für die gesamte Dauer des Experiments gehalten. Anmerkung: der Wärmelampe sollte mindestens 12-18 cm von dem Tier um ein Verbrennen zu verhindern </li><li> Die Körpertemperatur der Tiere muss mit einem Thermometer mit einer rektalen Temperatursonde ausgestattet überwacht werden. </li></ol> Teil 3: Tierchirurgie und Positionierung für die Intravitalmikroskopie <ol><li> Bereiten Sie den Arbeitsbereich mit allen chirurgischen Instrumenten (Tabelle 1), die sauber und steril sein sollten. </li><li> Rasieren Sie den Halsbereich der Maus mit einer elektrischen Schermaschine. Wischen Sie die Bauchseite des Halsbereich des narkotisierten Maus mit einem Gaze-Schwamm in 70% Ethanol getränkt. Trocknen Sie den Überschuss mit einem Kimwipe. </li><li> Mit stumpfen Pinzette gebogen heben ein kleines Stück Haut an der Mittellinie (nähemately am unteren Ende der Kaumuskeln), und machen einen kleinen Schnitt (Abbildung 1B). </li><li> Setzen Sie die Schere in die Öffnung und trennen Sie die Haut von der darunter liegenden Gewebes durch Öffnen der Scherenblätter. Vermeiden Sie Schäden am darunter liegenden Drüsengewebe durch Zeigen der Schere bis zur Unterseite der Haut. Wiederholen Sie diesen Schritt einige Male, bis die Haut von den tieferen Geweben (Abbildung 1B) getrennt. </li><li> Mit einer Schere, schneiden Sie einen Streifen von gelockerten Haut ca. 3 mm breit und 10 mm lang. Die Haut sollte so geschnitten, dass die Öffnung beginnt in der Nähe der Basis der SGs, wo der Nerv, der Kanal und die Blutgefäße verbinden Sie die Verschraubung an den Rest des Körpers werden. Nach der Reinigung der Wundfläche, wird die daraus resultierende Öffnung ovale Form haben und messen ca. 8 x 12 mm. Beide SGs wird nach der Öffnung (1B) sichtbar. </li><li> Mit einer Spritze gelten die optische Kopplung Gel in der Mitte des Schnittes und wischen gegendie Außenseite mit steriler Gaze. Saubere Stücke aus Gaze verwendet werden soll für jedes Tuch, um die Einführung der Haare oder Blut in die freiliegende Gewebe zu verhindern. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Blut und lose Haare entfernt. </li><li> Verwendung einer Pinzette Nr. 7, trennen das Bindegewebe vom rechten Unterkieferspeicheldrüse hin zu dem Boden der Stopfbuchse (alternativ kann dieses Protokoll auf der linken SGs verwendet werden). Suchen Sie zunächst die Spitze des SG und greifen das Bindegewebe ein paar Millimeter über der Spitze der Drüse. Reißen Sie das Bindegewebe um die Drüse ohne Verletzung des Parenchyms. (Fig. 1B). Wenn die Drüse ausgesetzt ist, vorsichtig trennen das Bindegewebe aus der Drüse. Wenn Blutungen auftreten, waschen das Blut weg mit Kochsalzlösung. Stellen Sie sicher, dass alle Bindegewebe getrennt und die Drüse voll ausgesetzt ist. Halten Sie die Drüse feucht, indem die optische Kopplung Gel regelmäßig. </li><li> Vor dem Ziel, das Tier an das Mikroskop, einen dicken Stück Gaze und heat Pack auf den Mikroskoptisch, um eine Temperatur von 38 ± 2 ° C zu halten Die Temperatur der chemischen Wärmepackung kann durch die Größe der Einschnitte, die den inneren Beutel der Atmosphäre auszusetzen eingestellt werden. Gaze bietet einige Isolierung der Wärmepackung aus der Metall-Bühne. Decken Sie die Oberseite der Wärmepackung mit einem dünnen Stück Gaze als gut. </li><li> Legen Sie das Tier auf die Seite (rechte Seite für die rechte Drüse) und auf die Gaze. Positionieren Sie das Tier mit der Unterkieferspeichelspeicheldrüse in der Mitte des Deckglases (1C) gegeben. </li><li> Das Tier befestigt ist und in dieser Position stabilisiert werden, bevor die Immobilisierung des Drüse. Legen Sie ein Stück Kreppband an der Bauchseite des rechten Vorderpfote der Maus. Haken Sie die Schneidezähne des Maus von einem Seidenfaden (1C, Einschub). Erstelle eine gewisse Spannung zwischen dem Seidenfaden und die Pfote und bringen sie auf der Bühne von Klebeband. Die SG sollte natürlich in der Mitte der AuflageDeckglas. Der Kopf und die Brust sollte zusätzlich durch Kunststoffkeile, die auf der Bühne gekoppelt werden kann stabilisiert werden. </li><li> Legen Sie ein kleines Stück von einem Linsenreinigungstuch über der Drüse (Abbildung 1C). Verlängern Sie die Verschraubung leicht und legen Sie eine kundenspezifische Halterung über dem Drüse. Der Stabilisator Dich Paar auf die Bühne, mit Klebeband. Kopplung kann durch eine Metallklammer an der Stufe (1C) verbunden verbessert werden. Spannung und scharfen Kanten sollten vermieden werden, da sie den Blutfluss beeinträchtigen. Unmittelbar nach der Stabilisierung überprüfen den Blutfluss entweder durch die Untersuchung der Drüse visuell (es sollte rosa Färbung behalten) oder durch Epifluoreszenz. In der GFP / m-Tomaten-Maus können Brutto Veränderungen der Blutfluss einfach ausgewertet werden, da sowohl die Blutgefäße und mehrere von den Blutzellen mit dem m-Tomate bezeichnet. </li><li> Bedecken Sie das Tier mit Gaze und einem Heizkissen. Messen der Temperatur der exponierten gland mit einem Thermometer ausgestattet with eine kleine flexible Thermosonde in Kontakt mit einer Seite des freiliegenden Drüse angeordnet. </li></ol> Teil 4: Imaging-Parameter <ol><li> Mit Epi-Fluoreszenz Beleuchtungsfokus auf der Oberfläche der Drüse entweder über die GFP oder RFP-Filtersatz. Finden Sie die Oberfläche der SG, und bewerten den Blutfluss in den Kapillaren und die gesamte Morphologie der Gewebe. Anzeichen von Gewebeschäden sind Membranblasenbildung oder das Aussehen der großen Vakuolen. </li><li> Beurteilen Sie die Stabilität des Gewebes entweder über Epi-Fluoreszenz oder die Pre-Scan den ausgewählten Bereich. Stabile Zubereitung ist wesentlich, da die meisten der Bewegungsartefakte können nicht entfernt oder korrigiert werden in der Nachbearbeitung Datenanalyse. Wenn die Zubereitung nicht stabil ist, sind Anpassungen erforderlich. </li><li> Um die richtige Bildebene finden die Drüsen in der Vor-Scan-Modus (1X-Zoom), und das Ziel, schrittweise in Richtung auf das Deckglas, bis die acinar Strukturen, die sekretorischen Granula und der pLASMA Membran deutlich sichtbar (Abbildung 2). </li><li> Die Bildaufnahmeparameter für die Zeitraffer hängen von der einzelnen Experiment. Zur Abbildung der Dynamik der sekretorischen Granula mit einem Scan-Geschwindigkeit von 0,5-2 sec / Rahmen, und 256 x 256 Pixel mit einer 0,2 &amp;mgr; m / Pixel räumlichen Skala (Sichtfeld von etwa 50 um x 50 um). Um das Granulat und die Plasmamembran optimal visualisieren, sollte die optische Dicke zwischen 0,9 bis 1,2 um festgelegt werden. Um das GFP und die Tandem-Tomato erregen kann man eine Wellenlänge von 488 nm und 561 nm, auf. Die Spitzenleistung rund 0,5 mW für die 488 nm und 1 mW für die 561 nm eingestellt. Dies sorgt für minimale Photobleaching. </li><li> Die Detektoreinstellungen angepasst werden, um das Signal in den Dynamikbereich zu erhalten und abhängig von der Helligkeit der Probe. </li><li> Wenn alle Parameter eingestellt sind, können bildgebende gestartet werden. Zuerst nehmen Sie einen Schnappschuss von dem Sichtfeld als Referenzpunkt verwendet werden. WährendBildgebung im Zeitablauf kann Driften des Gewebes in XY und Z auftreten. Dies kann manuell durch Einstellung der Scan-Bereich und der Z-Position kompensiert werden. Die Anpassungen sollten allmählich und in kleinen Schritten, um Artefakte zu vermeiden. Darüber hinaus kann das Referenzbild verwendet, um zu bestimmen, ob Bleichen auftritt. Wenn bedeutende Photobleaching erkannt wird (mehr als 15-20% ige Reduktion der Fluoreszenz), reduzieren Sie die Laserleistung von 0,1 mW. </li><li> Zur Stimulierung Exozytose, subkutan injizieren 0,1 mg / kg einer frisch hergestellten Lösung von Isoproterenol in Kochsalzlösung. Exozytose ausgelöst wird ungefähr 1 Minute nach der Injektion. Sekretorischen Granula verschmelzen mit der Plasmamembran wird durch einen Anstieg der GFP-Fluoreszenz um die Körnchen und die Diffusion der Tandem-Tomato Peptide in ihre begrenzende Membran (3) detektiert werden. Wir empfehlen den Erwerb 3-4 Zeitraffer-Sequenzen, die in der gleichen Gegend, jeweils 10 Minuten. </li><li> Nach dem Imaging-Sitzung, die einschläfern anesthetized Tier durch CO 2-Inhalation in einer Euthanasie Kammer (10-12 mmHg für 10 min). </li></ol>

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Microsc. 222, 58-64 (2006).</li><li>Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+morphology+and+functional+dynamics+of+vital+murine+intestinal+mucosa+revealed+by+autofluorescence+2-photon+microscopy.">Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).</li><li>Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. 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Bisher subzellulärer Strukturen sind meist in in vitro (dh Zellkulturen) oder im ex vivo (dh Organkulturen, Gewebeschnitt, acinar Zubereitungen) Modellsysteme, die oft nicht die Eigenschaften von intakten lebenden Gewebe 6 rekapitulieren abgebildet worden. In dieser Hinsicht ist die hier vorgestellte Ansatz stellt einen wichtigen Durchbruch, da es ermöglicht die Abbildung der Dynamik einer bestimmten Membrantransportschritt (dh geregelt Exozytose) in lebenden Mäusen. <p class...

In den vergangenen zwei Jahrzehnten die Einführung von Live-Mikroskopie und die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen haben große Durchbrüche auf jedem erdenklichen zellulären Prozess geführt, damit unser Verständnis der Zellbiologie ein. Dieses Feld enorm von der Verwendung von Säugetierzellkulturen, die extrem leistungsfähigen Modellsysteme, besonders, wenn es um experimentelle Manipulationen kommt profitiert hat. Allerdings stehen sie nicht oft bieten keine wahre Darstellung der Biologie der komplexen mehrzelligen Organismen 2. Dieses Problem hat damit begonnen, von der Entwicklung der Intravitalmikroskopie (IVM) angesprochen werden, die die Tür zur Untersuchung biologischer Schlüsselfragen in Bereichen wie der Neurobiologie, Immunologie und Tumorbiologie 3 geöffnet wurde. Bisher haben die meisten der Studien, die auf IVM wurden auf der Ebene von Geweben und einzelnen Zellen durchgeführt wurde, ohne Angaben über die Dynamik der subzellulären Kompartimenten. Vor kurzem hat unser Labor und anderes haben IVM Techniken in der Lage, Bild subzellulärer Strukturen in lebenden Nagern 4-7, 13-15 und so pharmakologischen und genetischen Manipulationen in vivo entwickelt. Dieser Ansatz wurde von uns verwendet worden, um Membrantransport in vivo zu untersuchen, und insbesondere Endozytose und Exozytose reguliert 6,7. Unsere experimentellen Modellsystem wird auf die Entlarvung, die Stabilisierung und die Abbildung der Unterkieferspeichelspeicheldrüsen (DMS) der Nager betäubt basiert. Die Wahl der SGs als Modell für Orgel IVM aufgrund der Tatsache, dass die Drüsen, indem eine kleine Chirurgie leicht zugänglich sind, kann ohne ihre Physiologie externalisiert werden und stabilisiert, um die Bewegungsartefakte durch Atmung und Herzschlag reduzieren. Außerdem SGs selektiv entweder genetisch durch die Injektion von viralen oder nicht-viralen Vektoren auf der Basis durch den Speichelgang 8,9 manipuliert werden. Schließlich SGs sind exokrinen Drüsen des polarisierten epith zusammenElial Zellen, die den Acini und die Kanäle, Myoepithelzellen, und eine komplexe Population von Stromazellen zu bilden. Aus diesem Grund sind sie ein hervorragendes Modell zur Exozytose, Endozytose, Gentransfer und Aktin-Zytoskelett zu studieren, wie in unserem aktuellen Studien 10 markiert ist, und bieten die Möglichkeit, Aspekte der Zellbiologie wie Zellpolarität, Zellteilung, Zell studieren Zellverbindungen und Ionenkanälen. In diesem Beitrag beschreiben wir im Detail ein Abbildungs ​​Protokoll für die Erreichung subzellulärer Auflösung im Epithel der SGs einer Live-Maus. Insbesondere zeigen wir, wie man die Bild sekretorischen Granula in den Azinuszellen der SGs im regulierten Exozytose. Wie bereits dargestellt, nach Stimulation mit Agonisten des beta-adrenergen Rezeptor, verschmelzen die sekretorischen Granula mit der apikalen Plasmamembran und nach und nach zusammenbrechen, die Freigabe ihrer Inhalte in die Kanälchen acinar 6. Unser Ziel ist es, die grundlegenden Werkzeuge, um die Ermittler mit m bieteninimal Erfahrung in der chirurgischen Verfahren und die Behandlung der Tiere, so dass sie erfolgreich bei einem subzellulärer Auflösung durchführen IVM. Da der schwierigste Teil in IVM ist die Vorbereitung des Tieres, hier konzentrieren wir uns auf die Beschreibung der grundlegenden chirurgischen Verfahren, die verwendet werden, um zu entlarven und zu immobilisieren die SGs, ohne ihre Funktion zu beeinträchtigen. Wie bei den Verfahren zur subzellulären Strukturen, verschiedene Strategien, wie systemische Abgabe von Fluoreszenzsonden, die Verwendung von transgenen Tieren, oder eine Kombination von beiden zu markieren, wurden an anderer Stelle beschrieben worden ist 7,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflourane (Forane)</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>101936-40</td>
			<td>Handle under chemical hood</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine (ketaved)</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health</td>
			<td>57457-034-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine (Anased)</td>
			<td>Akorn, Decatur</td>
			<td>61311-481-10</td>
			<td>Stock solution 100 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Neomycin/Polymyxin B</td>
			<td>Bausch and Lomb</td>
			<td>24208-785-55</td>
			<td>Use to lubricate the eye of the mouse</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carbomer-940</td>
			<td>Ashalnd, Inc.</td>
			<td>4607-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90279</td>
			<td>Add drop wise to prevent the solution to solidify</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoproternol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16504</td>
			<td>Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 &deg;C</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instrument</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane V 1.9 (Vaporizer)</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>190AF</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Portable Downdraft table equipped with HEPA filter</td>
			<td>Hazard Technology</td>
			<td>PDDT</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Heat lamp, Model HL1</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>HL-1 US</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MicroTherma 2T Thermometer</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>TW2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Operating Scissors (11.5 cm straight</td>
			<td>World Precision Instruments </td>
			<td>5003708-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#7 curved tip tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14187</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black Braided Silk suture #4.0</td>
			<td>George &amp; Tiemann &amp; Co</td>
			<td>160-1219-4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gauze sponges 2" x 2"</td>
			<td>Tyco Healthcare</td>
			<td>9022</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lens cleaning tissue</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CL-TISSUE (M97) AX6476</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Bild subzelluläre Strukturen in lebenden Nager, die auf der Verwendung von konfokalen Intravitalmikroskopie beruht. Als Modell Organ, verwenden wir die Speicheldrüsen von lebenden Mäusen, da sie mehrere Vorteile. Erstens kann sie leicht freigelegt werden, um den Zugriff auf die Optik zu ermöglichen, und stabilisiert ist, um die Reduzierung der Bewegungsartefakte aufgrund von Herzschlag und Atmung zu erleichtern. Dies erleichtert Bildgebung und Tracking kleine subzellulärer Strukturen. Zweitens, die meisten Zellpopulationen der Speicheldrüsen von der Oberfläche des Organs zu erreichen. Dies ermöglicht die Verwendung der konfokalen Mikroskopie, die eine höhere räumliche Auflösung als andere Techniken, die für die in vivo-Bildgebung verwendet wurden, wie beispielsweise Zwei-Photonen-Mikroskopie. Schließlich kann Speicheldrüsen leicht pharmakologisch und genetisch manipuliert werden, so dass ein robustes System zur biologischen Prozesse auf molekularer Ebene zu untersuchen. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf ein Protokoll, das die Kinetik der Exozytose von sekretorischen Granula in Azinuszellen und die Dynamik der apikalen Plasmamembran, wo die sekretorischen Granula fusionieren bei Stimulierung der ß-adrenergen Rezeptoren folgen. Insbesondere verwendeten wir eine transgene Maus, die co-exprimiert GFP cytosolische und membranZielPeptid mit dem fluoreszierenden Protein Tandem-Tomato fusioniert. Allerdings können die Verfahren, die wir zur Stabilisierung und Bild die Speicheldrüsen zu anderen Mausmodellen erweitert und an andere Ansätze zur in-vivo-Zellbestandteile zu kennzeichnen, so dass die Visualisierung verschiedener subzellulärer Strukturen, wie Endosomen, Lysosomen, Mitochondrien gekoppelt werden, und das Aktin-Zytoskelett.

In der GFP / mTomato Maus, die Acini erscheinen als deutlich verschieden Strukturen, die GFP cytosolische und membran gezielte Tandem-Tomato-Peptid (Abbildung 2, gestrichelte Linie) zum Ausdruck bringen. In einzelnen Acini werden Azinuszellen durch die Tandem-Tomaten-Peptid abgegrenzt. GFP ist auch in den Kernen, die eindeutig in den Azinuszellen sichtbar (Fig. 2, Pfeil) nachgewiesen. Cytosolic GFP wird aus den sekretorischen Granula, die als dunkle kreisförmige Vesikel von etwa 1 bis ...

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Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitalmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Abbildung verschiedener biologischer Prozesse in lebenden Tieren ermöglicht. In diesem Artikel stellen wir eine detaillierte Methode zur Abbildung der Dynamik der subzellulären Strukturen, wie den sekretorischen Granula, in den Speicheldrüsen von lebenden Mäusen.

Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.5K Aufrufe.  National Institutes of Health.  Intravitalmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Abbildung verschiedener biologischer Prozesse in lebenden Tieren ermöglicht. In diesem Artikel stellen wir eine detaillierte Methode zur Abbildung der Dynamik der subzellulären Strukturen, wie den sekretorischen Granula, in den Speicheldrüsen von lebenden Mäusen. 

Serie: Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Forschung

Biologie

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Die Transplantation von GFP-exprimierenden Blastomeren für Live Imaging von Retinal und Entwicklung des Gehirns in Chimäre Zebrafischembryonen

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of fluorescence can be changed by exposure to light of a specific wavelength. Optical highlighting allows noninvasive marking of a subpopulation of fluorescent molecules, and is therefore ideal for tracking single cells or organelles.
Critical parameters for efficient photoconversion are the intensity and the exposure time of the photoconversion light. If the intensity is too low, photoconversion will be slow or not occur at all. On the other hand, too much intensity or too long exposure can photobleach the protein and thereby reduce the efficiency of photoconversion.
This protocol describes a general approach how to set up a confocal laser scanning microscope for pc-FP photoconversion applications. First, we describe a procedure for preparing purified protein droplet samples. This sample format is very convenient for studying the photophysical behavior of fluorescent proteins under the microscope. Second, we will use the protein droplet sample to show how to configure the microscope for photoconversion. And finally, we will show how to perform optical highlighting in live cells, including dual-probe optical highlighting with mOrange2 and Dronpa.

This protocol describes a general approach to perform photoconversion of fluorescent proteins on a confocal laser scanning microscope. We describe procedures for the photoconversion of puried protein samples, as well as for dual-probe optical highlighting in live cells with mOrange2 and Dronpa.

Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine ​​und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen

Photoconvertible fluorescent proteins (pc-FPs) are a class of fluorescent proteins with "optical highlighter" capability, meaning that the color of ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Fluoreszenz-Erholung nach Immunofluoreszenz von gelb fluoreszierende Protein Tagged p62 in Aggresome-induzierten Strukturen

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...