Wir danken Eric Wieschaus, der das Fundament, auf dem dieses Protokoll wurde entwickelt, zur Verfügung gestellt. Unsere Arbeit wird durch eine Verna &amp; Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology Start-up Award, Baylor College of Medicine unterstützt.

1. Montieren Embryo Sammlung Cups <ol><li> Schneiden Sie die unten aus einer 100 ml Tri-Mais Becherglas mit einer Rasierklinge, so dass die Kante so glatt wie möglich. Die Tassen sind einfacher zu handhaben, wenn Sie schneiden auch die drei Ecken von der Spitze, obwohl dies nicht zwingend erforderlich. </li><li> Schneiden Sie ein Quadrat aus Drahtgitter (6 cm x 6 cm). Auf einer vorgewärmten heißen Platte, innerhalb einer Abzugshaube, Schicht des Platzes aus Drahtgitter auf einem Stück von schweren Aluminium-Folie. Schieben Sie den Schnitt unteren Rand der Tasse fest auf den heißen Masche. Warten Sie ein paar Sekunden, und heben Sie die Tasse mit dem Mesh jetzt angebracht. Wenn die Folie auch Stöcke, nur diese abziehen. </li><li> Kühlen Sie die Tasse über Nacht. Entfernen Sie das überschüssige Gewebe mit einer Schere und Sand aus alle scharfen Kanten mit feinkörnigem Sandpapier. </li></ol> 2. Machen Apfelsaft Agar-Platten <ol><li> In einem 6L-Kolben, kombiniert 100 g BD Bacto Agar und 3L destilliertem Wasser. Autoclave der Agar für 30 Minuten auf der langsamen Auspuff-Einstellung. </li><li> In einem 2L Kolben mit einem Rührstab, kombinieren 100 g Saccharose, 1L Apfelsaft, und 6 g p-Hydroxybenzoesäure. Erhitzen Sie die Lösung zum Sieden unter Rühren auf einer heißen Platte. Nicht kochen für mehr als 2 Minuten. Lassen Sie den Apfelsaft Mischung abkühlen, und fügen Sie dann mit Rührstab auf dem Agar. Mix komplett. </li><li> Lassen Sie die kombinierte Lösung in einem 60 ° C Wasserbad vor dem Einfüllen in 60x15 mm Petrischalen cool. Alternativ kann eine Schlauchpumpe verwendet, um den Agar zu verzichten. Lassen Sie die Platten auf Raumtemperatur für mindestens 4 Stunden kühlen. Stack in Rubbermaid Behälter mit einer Schicht aus nassem Papier Handtücher und lagern bei 4 ° C. </li></ol> Notes: <ul><li> Im Herbst oder Winter, kann es notwendig sein, weitere 100 ml Wasser zu dem Agar hinzufügen. </li><li> Die Marke von Petrischalen ist uns wichtig! Nur die BD Falcon Gerichten passen die Tri-Mais Becher. Spezielle Bestellinformationen finden Sie in den Materialien Tabelle im folgenden Abschnitt. </li></ul> 3. Add GFP Flies auf die Embryo-Entnahme-Cups <ol><li> Expand GFP Aktien nach Ihren Bedürfnissen Sammlung durch die Einrichtung von Flaschen fliegt etwa zwei Wochen vor der Bildgebung. Eine Flasche fliegt in der Regel mehr als ausreichend, wenn ein Embryo-Entnahme-Tasse mit einem Minimum von 50 Frauen und 30 Männern zu füllen. Für eine optimale Verlegung sollte Fliegen sein neu eclosed (dh weniger als 5 Tage nach dem Schlüpfen). </li><li> Machen Sie eine Hefe, indem eine kleine Tasse mit etwa gleichen Teilen Red Star aktiven Trockenhefe und destilliertem Wasser einfügen, und rühren, bis die Hefe gelöst ist. Die Paste sollte in etwa die Konsistenz von nassem Erdnussbutter. Mehr Hefe oder Wasser hinzugefügt werden, um die Konsistenz zu verändern. Hefe Paste kann für mehrere Tage verwendet werden und gespeichert werden sollen, abgedeckt, bei 4 ° C. </li><li> Sobald die Hefe paste bereit ist, zu entfernen Apfelsaft Platten von 4 ° C Lagerung. Streak der Apfelsaft-Platten mit der Hefe einfügen und es ihnen ermöglichen, auf 22-25 ° C erwärmen, die einen Anreiz für die Eiablage wird. </li><li> Falten Sie ein Rundschreiben Filterpapier in der Mitte, dann in der Hälfte wieder. Trim auf 8-9 cm Durchmesser, und machen Akkordeon Falten im Viertelkreis. Klappen Sie den Kreis, kehren sie, und fügen Sie ihn in einem Auffangbehälter, bis er das Netz berührt. Stellen Sie sicher, dass das Papier sicher ist in der Tasse, so dass sie nicht fallen und zerschlagen die Fliegen. Das Filterpapier ist optional, aber ein günstiges Umfeld für die Paarung zu schaffen, und hält Feuchtigkeit in die Tasse. </li><li> Beschriften Sie eine Tasse mit Lager Namen und Datum. Übertragen Sie die Fliegen aus der Flasche zu den Auffangbehälter durch leichtes Schütteln der umgedrehten Flasche über den Kelch, und sofort Deckel des Bechers mit einer vorbereiteten Apfelsaft Platte. Befestigen Sie die Platte in die Tasse mit einem Gummiband. Set Tassen Netzseitentaschen bis in einen Bereich mit direktem Licht. Stellen Sie sicher, dass kein Schatten auf die Tasse fallen, da fliegt nicht gut lag im Dunkeln. </li><li> Ändern Sie den Apfelsaft Platte nach Bedarf. Zwei-Stunden-Sammlungen, bei Raumtemperatur gut für bildgebende Zellularisierung. </li></ol> 4. Bereiten Sie eine Montage Kammer <ol><li> So bereiten Sie eine Aufnahmekammer für die Embryonen, schneiden Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband 2-3 cm lang und legen Sie es auf einer Folie, die Ausrichtung der Längsachse des Bandes und Rutsche. Cut eine zweite 2-3 cm langes Stück doppelseitiges Klebeband und Schicht es auf der anderen Stück Klebeband, so dass Sie sicher, dass die Kanten ausgerichtet sind. </li><li> Mit einer Rasierklinge, machen zwei Schnitte von etwa 3 mm Abstand in der Mitte des Bandes und senkrecht zur Längsachse des Schlittens. Entfernen Sie das Klebeband zwischen den Schnitten, um einen Kanal zu machen. Pipet ein Tropfen Halocarbon 27 Öl in den Kanal. Dieser Kanal ist, wo die Embryonen montiert werden. </li></ol> Notes: <ul><li> Nur die ½-Zoll-Scotch doppelseitige Klebeband ist die richtige Dicke, um die Embryonen unterzubringen. </li><li> Halocarbon 27 Öl ist Sauerstoff durchlässig, und so ermöglicht Austausch von Sauerstoff und verhindert gleichzeitig Embryo Austrocknung. Aufgrund dessen Brechungsindex ist Halocarbon 27 Öl auch ideal für die Inszenierungund Imaging-Embryonen. </li></ul> 5. Dechorionate Embryos <ol><li> Zu sammeln und zu dechorionate Embryonen genug pour 50% Bleichmittel auf die Apfelsaft-Agar-Platte voll versenken die gesamte Oberfläche. Mit einem Binokular, wie die Zeiss Entdeckung V8 mit Durchlicht, achten Sie auf die Embryonen aus ihrem Chorion freizugeben. Sobald das Chorion und lockert Versionen von ein paar Embryonen (30-60 Sekunden), pour Bleichmittel und Embryonen in eine Zelle Sieb. </li><li> Wash Embryonen in das Sieb sofort und kräftig mit destilliertem Wasser aus einer Spritzflasche. Dab Sieb auf Küchenpapier. Wenn die rosa ist auf dem Handtuch nach dem Abtupfen gesehen, weiterhin das Waschen der Embryonen mit Wasser. </li><li> Mit einem feuchten Pinsel auf 10-50 Embryonen, um eine saubere Apfelsaft Platte (ohne Hefe-Paste) zu übertragen. Wick entfernt Wasser mit den zerrissenen Rand ein Papiertuch, und sofort decken die Embryonen mit einer kleinen Menge von Halocarbon 27 Öl. </li></ol> Notes: <ul><li> Verwenden Sie keine Clorox Bleiche. Verwenden Sie stattdessen eine Marke wie Austin A-1 Handelsregister Bleach, die &lt;6% Natriumhypochlorit ist. </li><li> Over-Bleaching oder unzureichende Spülung wird in matschig Embryonen mit unregelmäßigen Zellularisierung führen. </li></ul> 6. Bühne und Mount Embryos <ol><li> Mit dem Binokular mit Durchlicht, folgen Sie den morphologischen Richtlinien Bownes 20 bis Embryonen auf der Platte Bühne. Mit einer Pinzette, Transfer ca. 5 Mitosecyclus 11 oder 12 Embryonen, entsprechend Bownes Stufe 4, um den Kanal der Montage Kammer. Vereinbaren Embryonen in einer Linie mit dorsalen und ventralen Seiten sichtbar und lateralen Seite nach unten. Embryonen sind leicht in diese Orientierung in Öl allein angeordnet. Nicht Menge Embryonen zusammen, wie sie ihre Nachbarn von Sauerstoff wird entzogen, wenn das Deckglas unten aufgetragen wird. (Lassen Sie etwa die Hälfte eines Embryos Länge zwischen ihnen). </li><li> Lay einer Kante eines 25x25 mm Deckglas auf dem doppelseitigen Klebeband an einer Seite des Kanals. Drop the Deckglas, um den Kanal zu decken. Wenn Luft unter gefangen ist, eine kleine Menge von Halocarbon 27 Öl am Rande des Deckglases. Kapillarwirkung wird das Öl in den Kanal Pull-und Push out der Luft. </li></ol> Notes: <ul><li> Eine weitere hervorragende Ressource für die Inszenierung Embryonen ist die folgende: Campos-Ortega, JA und Hartenstein, V. (1985). Die Embryonalentwicklung von Drosophila melanogaster. Springer-Verlag, Berlin. Während dieses Buch nicht mehr veröffentlicht wird, werden gebrauchte Exemplare regelmäßig auf Amazon.com. </li><li> Verwenden Sie immer die Halocarbon 27 Öl sparsam. Damit wird die Montage zu erleichtern. Es wird auch ein versehentliches Nässen des Öls auf den Mikroskop-Objektiv in den folgenden Imaging-Schritten. </li></ul> 7. Bild Embryos <ol><li> Wie Sie hier vorgehen wird natürlich von der Zelle Form zu ändern, dass Sie Bildgebung sind, und die Frage, die Sie ansprechen diktiert werden. Für jede Form zu ändern, platzieren Sie Ihre Montage Kammer entweder auf eine aufrechte oder inverse Mikroskop finden Sie Ihre Embryonen im Durchlicht, und wechseln Sie dann zu konfokale Bildgebung auf eine Region von Interesse sind. Halten Sie sich an Best Practices für die konfokale Mikroskopie, wie die im Nikon MicroscopyU (diskutiert <a href="http://www.microscopyu.com/articles/confocal">http://www.microscopyu.com/articles/confocal</a> ). Seien Sie besonders strengen in die Offenlegung Ihrer lebenden Embryonen, so wenig Laserleistung wie möglich Bleichen und Phototoxizität zu verhindern. </li><li> Für Zellularisierung mit uns Bild auf einem Zeiss 710 Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop, ein C-Apochromat 40x/1.2 W Corr Ziel. Dieses Mikroskop wird in einem klimatisierten Raum untergebracht, mit Temperaturen von 18-20 ° C. Während Temperaturregelung ist nicht unbedingt notwendig, ist es besser für das Mikroskop und macht die Bildgebung mehr konsistent. Wir führen regelmäßig Bild in einer Ebene, in der Nähe der Mitte des Embryos, zur Plasmamembran Einstülpungen im Querschnitt (Abb. 2) folgen. Für einfach folgenden Invagination Dynamik, sind zu 30-60 Sekunden reichen für Zeitraffer-Imaging und Embryonen Bildgebung für&gt; 90 Minuten ohne erkennbare Anzeichen von Sauerstoffmangel zu widerstehen. </li><li> Nach dem Erwerb der Bilder können sie unter Verwendung einer beliebigen Anzahl von Bildanalyse-Pakete, einschließlich Freeware von den National Institutes of Health, genannt ImageJ (werden <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a> ). Die Daten können dann zum Beispiel Filme (Movie 1), Sequenzen (Abbildung 2) oder kymographs 21 vorgestellt werden. </li></ol> Hinweis: <ul><li> Das Eintauchen in Wasser C-Apochromat 40x/1.2 W Corr Ziel ist es, für die Bildgebung in der Nähe des Embryo mittleren Abschnitt durch seine hohe Blende, die Aberrationen Grenzwerte für Deep Tissue Imaging in wässrigen Proben gut geeignet und bietet eine hohe Auflösung und hohe Fluoreszenz-Signal. Darüber hinaus dieses Zielhat eine sehr lange Distanz (220 um). Allerdings werden auch andere Wasser oder Glycerin Immersionsobjektive gute Leistung, vor allem, wenn die Zelle Formveränderung von Interesse in der Nähe des Embryo Oberfläche abgebildet werden kann. </li></ul> 8. Alternative Methode: Mount Embryonen mit &quot;Embryo-Kleber&quot; <ol><li> Um das Bild einer Zelle Form zu ändern außer Zellularisierung, kann es notwendig sein, um Embryonen in einer bestimmten Orientierung, die nicht leicht in Öl gepflegt allein montieren. Dazu verwenden Sie eine alternative Methode zur Montage der zuvor beschriebenen. Beginnen Sie, indem &quot;Embryo-Kleber&quot; durch die Kombination von 20 cm von doppelseitigem Klebeband mit 250 ul Heptan in einem Scintillationsfläschchen. Legen Sie die Scintillationsfläschchen auf einem Kolbenpendel oder rotierenden Plattform, und mischen Sie über Nacht. </li><li> Tauchen Sie ein gelbes Pipettenspitze in den Embryo Kleber, und dann verfolgen die Spitze entlang einer Rutsche, eine Spur von Leim. Während die Heptan verdunstet, richten Sie Ihre inszenierten Embryonen in der vorgeschriebenen Richtung auf einen Block von Agar. (Denken Sie daran, dass der Embryo Oberfläche abgebildet werden sollte nach der Agar. Zum Beispiel, um Bildzelle Formänderung beim Bildung der ventralen Furche, mount Embryonen mit ihrem ventralen Seite nach der Agar.) </li><li> Drehen Sie die Folie mit Klebstoff und drücken Sie vorsichtig den Spuren von Klebstoff gegen die Embryonen auf die Agar-Block. Jetzt kehren die Folie wieder. Die Embryonen werden in die entsprechende Ausrichtung aufgeklebt werden. Fügen Sie zwei Schichten von doppelseitigem Klebeband auf beiden Seiten des Embryos, decken Sie sie mit Halocarbon 27 Öl und Deckglas auflegen. Fahren Sie mit der Bildgebung wie oben beschrieben. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse: Wenn die Embryonen gesund sind und die Abbildung optimal ist, dann Zellularisierung sollte 50-60 Minuten, und der Plasmamembran Einstülpungen sollte das Eindringen von fast 40 Mikron. Allerdings, wenn die Embryonen over-gebleicht, Sauerstoff entzogen oder durch Phototoxizität beschädigt sind, dann Einstülpung entweder verlangsamen oder stoppen, vor allem in der abgebildeten Fläche. Solche Verschlechterung der Embryo Gesundheit führt oft veränderte Entwicklung, und ein Ausfall als Larven schlüpfen. Somit ist für einen rigorosen Test Test Embryo Gesundheit nach der Bebilderung, halten Sie Ihre Folien in einer feuchten Kammer und sehen für das Ausbrüten des nächsten Tages. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Workflow von Embryo-Entnahme zur Bildgebung. Der Workflow des Protokolls lässt sich in vier Hauptphasen unterteilt werden. In der ersten Phase werden alle einzelnen Lieferungen und Komponenten hergestellt, und dann die Embryo-Entnahme-cup, Apfelsaft-Agar-Platte und GFP Fliegen sind zusammen, um den Embryo-Verlegung zu schaffen setzen. In der zweiten Phase werden die Eier und Embryonen, die auf der Apfelsaft-Agar-Platten gelegt werden gesammelt. In der dritten Phase, die Embryonen von der Platte entfernt werden, inszeniert und an die Montage Kammer. In der vierten Phase werden die montierten Embryonen auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Repräsentative Daten aus Zeitraffer-Bildgebung von Zellularisierung. Embryonen werden mit dorsaler (D) und ventralen (V) Seiten gut sichtbar angebracht und sind in der Nähe ihrer Mitte abgebildet an die Plasmamembran Einstülpungen im Querschnitt zu folgen. Der Embryo hier gezeigten drückt eine GFP-Myosin-2-Sonde 6, die an den Spitzen der Plasmamembran Einstülpungen konzentriert. So verfolgen das Eindringen von dieser Front im Laufe der Zeit gibt die Rate, mit der Plasmamembran stülpt. Die 0.00 Minuten-Zeitpunkt entspricht Zellularisierung Beginn. Kurz nach der 56:00 Minuten-Zeitpunkt, beginnt der Gastrulation auf der Bauchseite des Embryos. Bar ist 40 Mikron. Movie 1. Vertreter Film von Zeitraffer-Bildgebung von Zellularisierung. Dieser Film entspricht 2 Abbildung. So nehmen Sie den gesamten Prozess der Zellularisierung begann Bildgebung in der vorherigen Mitosecyclus 13, Erfassung pseudocleavage Furche Regression, und dauerte bis Gastrulationsbewegungen auf der Bauchseite des Embryos zu sehen waren. Die Bilder wurden in Intervallen von einer Minute gesammelt. Die Intensitäten wurden nach der Akquisition erhöht, um es einfacher, die Gastrulationsbewegungen sehen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2503/Movie%201.mov">Klicken Sie hier für Film</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Developmental Event-und Timing * </td><td> Zellform Änderungen im Zusammenhang mit </td><td> Ein Link zu Krankheit oder die menschliche Gesundheit </td><td> Aktuelle Referenzen mit Live-Bildgebung </td></tr><tr><td> Pseudo-Teilungsfurche Bildung (4; 90 Minuten pf) </td><td> Cytokinesis </td><td> Polyploidie und Krebs Reihe 1 </td><td> Mavrakis et al., 2009 8 Cao et al., 2010 9 </td></tr><tr><td> Zellularisierung (5; 130 Minuten pf) </td><td> Cytokinesis </td><td> Polyploidie und Krebs Reihe 1 </td><td> Cao et al., 2008 10 Sokac &amp; Wieschaus, 2008 11 </td></tr><tr><td> Bildung der ventralen Furche; Mesoderm Invagination (6; 180 Minuten pf) </td><td> Apikalen Konstriktion, Epithelial-mesenchymale Transition </td><td> Krebs Metastasen 2 </td><td> Fox &amp; Peifer, 2007 12 Martin et al., 2009 13 </td></tr><tr><td> Germband Erweiterung (7; 195 Minuten pf) </td><td> Konvergente Extension </td><td> Neuralrohrdefekte 3 </td><td> Bertet et al., 2004 14 Blankenship et al., 2006 15 </td></tr><tr><td> Tracheogenesis (11; 320 Minuten pf) </td><td> Epitheliale tube formation und Verzweigung </td><td> Angiogenese 4 </td><td> Caussinus et al., 2008 16 Gervais &amp; Casanova, 2010 17 </td></tr><tr><td> Dorsal Schließung (14; 620 Minuten pf) </td><td> Apikalen Konstriktion </td><td> Die Wundheilung 5 </td><td> Gorfinkiel et al., 2009 18 Solon et al., 2009 19 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Beispiele Zellform Veränderungen in lebenden Embryonen zu fliegen abgebildet * Die Bownes Bühne Zahl und Zeit nach der Befruchtung (pf), wenn jedes Ereignis beginnt, werden nach Campos-Ortega, 1985 aufgeführt. <table border="1"><tbody><tr><td> Fly Lager </td><td> Labels </td><td> Original-Referenz </td></tr><tr><td> Spider-GFP (95-1) </td><td> Plasma-Membran </td><td> Morin et al., 2001 22 </td></tr><tr><td> Resille-GFP (117-2) </td><td> Plasma-Membran </td><td> Morin et al., 2001 22 </td></tr><tr><td> GAP43-Venus </td><td> Plasma-Membran </td><td> Mavrakis et al., 2009 8 </td></tr><tr><td> Spaghetti Squash-GFP (SQH-GFP) </td><td> Myosin-2 </td><td> Royou et al., 2002 6 </td></tr><tr><td> E-Cadherin-GFP (ECAD-GFP) </td><td> Zell-Zell-Verbindungen </td><td> Oda et al., 2001 23 </td></tr><tr><td> GFP-Moesin </td><td> F-Aktin </td><td> Kiehart et al., 2000 24 </td></tr><tr><td> Utrophin-Venus (Utro-Venus) </td><td> F-Aktin </td><td> Sokac et al., Unveröffentlichte Ergebnisse </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Nützliche Aktien für die Bildgebung Zellform Änderung fliegen Embryonen

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J., Arias, M. a. r. t. i. n. e. z., A, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+control+of+global+cell+behaviour+during+dorsal+closure+in+Drosophila.">Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila.</a> Development. 136, 1889-1898 (2009).</li><li>Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+forces+timed+by+a+ratchet-like+mechanism+drive+directed+tissue+movement+during+dorsal+closure.">Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure.</a> Cell. 137, 1331-1342 (2009).</li><li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster.">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).</li><li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization.">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li></ol>

Das Protokoll beschriebenen wird die Live-, konfokale Bildgebung von einer Reihe von Zellform Veränderungen in den Entwicklungsländern zu fliegen Embryo zu ermöglichen. GFP Aktien für die Bildgebung kann durch einen individuellen Labor (Tabelle 2) hergestellt werden, aber viele dieser Bestände sind auch öffentlich verfügbar von Zentren wie Bloomington Drosophila Stock Center an der Indiana University ( <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indiana.edu</a> ) und Fliegenfalle Stoc...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>12-550-343</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips 25x25</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (Corning #2865-25)</td>
<td>1 2-524C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Squirt bottles (H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>02-897-11</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml Falcon tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD# 352070)</td>
<td>14-432-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bulbs for small pipets, 1 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>03-448-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scintillation vials with caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (Wheaton #986546)</td>
<td>66021-533</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tri-Corn Beakers, 100 mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>60970</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon Petri dish 60x15mm </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD# 351007)</td>
<td>08757 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific (BD#352350)</td>
<td>08-771-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yellow pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ranin</td>
<td>L200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless steel mesh, 304, 12x24</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>CX-0150-F-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass 5&frac34; inch Pasteur Pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>13-678-20B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P4 Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisherbrand/Fisher Scientific</td>
<td>09-803-6F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber bands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Max</td>
<td>A620645</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scotch double-sided tape, &frac12; inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Office Max</td>
<td>A8137DM-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jerry&#x2019;s Artarama</td>
<td>56460</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 Forceps High Precision Inox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Services</td>
<td>72701-DZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (BD #214010)</td>
<td>55411-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil 27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H 8773</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Chemical/Fisher Scientific</td>
<td>H360-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR (BD# 214010)</td>
<td>90000-760</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S7903</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>p-Hydroxybenzoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>H5501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Red Star Active Dry Yeast</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>LeSaffre</td>
<td>15700</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels, C-fold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kleenex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heavy duty aluminum foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Reynolds Wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Austin&#x2019;s A-1 Commercial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100% Apple juice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Spray or Tree Top</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

imaging cell shape change in living drosophila embryos

Die Entwicklung von Drosophila melanogaster Embryo durchläuft eine Reihe von Zellform Veränderungen, die sehr gut für konfokale Bildgebung leben. Zellform Veränderungen in-the-fly sind analog zu denen in höheren Organismen, und sie fahren Gewebemorphogenese. Also, in vielen Fällen hat ihre Studie direkte Implikationen für das Verständnis menschlicher Erkrankungen (Tabelle 1) 1-5. Auf der sub-zellulärer Ebene sind diese Zellform Veränderungen das Produkt der Aktivitäten reicht von der Genexpression bis Signaltransduktion, Zellpolarität, Zytoskelett-Umbau-und Membran-Handel. Somit stellt die Drosophila-Embryo nicht nur den Kontext zu Zellform Veränderungen zu bewerten, da sie Gewebemorphogenese beziehen, sondern bietet auch eine völlig physiologischen Umgebung, die sub-zellulären Aktivitäten, die Form-Zellen zu studieren. Die hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um Bild einer bestimmten Zelle Formveränderung genannt Zellularisierung. Zellularisierung ist ein Prozess der dramatischen Plasmamembran Wachstum, und es letztendlich wandelt die Syncytial Embryo in die zelluläre Blastoderm. Das heißt, bei der Interphase der Mitose-Zyklus 14, der Plasmamembran gleichzeitig stülpt sich um jede ~ 6000 kortikal verankert Kerne auf ein Blatt von primären Epithelzellen zu generieren. Zähler zur vorherigen Vorschläge, ist Zellularisierung nicht von Myosin-2 Kontraktilität 6 angetrieben, sondern wird weitgehend durch Exozytose von Membran aus internen Shops 7 angeheizt. So ist Zellularisierung ein hervorragendes System zur Untersuchung von Membran-Handel während der Zellform Veränderungen, die Plasmamembran Invagination oder Erweiterung erfordern, wie Zytokinese oder Quer-Tubuli (T-Tubulus) Morphogenese in der Muskulatur. Beachten Sie, dass dieses Protokoll einfach auf die Abbildung von anderen Zellform Veränderungen in-the-fly Embryo angelegt und erfordert nur geringe Anpassungen wie die Änderung der Phase der Embryo-Entnahme oder Verwendung von &quot;Embryo Kleber&quot;, um den Embryo in einer bestimmten Orientierung (Tabelle montieren 1) 8-19. In allen Fällen wird der Workflow im Grunde die gleichen (Abbildung 1). Standard-Verfahren für das Klonen und Drosophila Transgenese werden verwendet, um stabile fliegen Aktien, die ein Protein von Interesse exprimieren, fusioniert mit Green Fluorescent Protein (GFP) oder dessen Varianten vorzubereiten und diese Fliegen bieten eine erneuerbare Quelle von Embryonen. Alternativ sind auch fluoreszierende Proteine ​​/ Sonden direkt in fly Embryonen über einfache Mikro-Injektion Techniken 9-10 eingeführt. Dann, je nach Entwicklungs-Event-und Zell-Form zu ändern, die abgebildet werden, sind Embryonen gesammelt und inszeniert von Morphologie auf einem Binokular und schließlich positioniert und montiert für Zeitraffer-Bildgebung an einem konfokalen Mikroskop.

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Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Frühe Entwicklung der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, wird durch eine Reihe von Zell-Form verändert, dass auch für die Bildgebung Ansätze geeignet sind, geprägt. Dieser Artikel beschreibt grundlegende Werkzeuge und Methoden für die Live-konfokale Abbildung von Drosophila Embryonen erforderlich ist, und wird auf eine Zelle Formveränderung genannt Zellularisierung konzentrieren.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

imaging-cell-shape-change-in-living-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

14.2K Aufrufe.  Baylor College of Medicine (BCM). Frühe Entwicklung der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, wird durch eine Reihe von Zell-Form verändert, dass auch für die Bildgebung Ansätze geeignet sind, geprägt. Dieser Artikel beschreibt grundlegende Werkzeuge und Methoden für die Live-konfokale Abbildung von Drosophila Embryonen erforderlich ist, und wird auf eine Zelle Formveränderung genannt Zellularisierung konzentrieren.

Serie: Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Forschung

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Upright Imaging von Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolierung und Reinigung von Kinesin aus Drosophila Embryonen

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Studieren mitotischen Checkpoint durch Veranschaulichung Dynamische Kinetochor Protein Verhalten und Chromosome Motion in Lebens-<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial Embryonen

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...