Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

1. Klonierung des tdTomato-markierten Wildtyp und Motorless KIF5B Proteine <ol><li> Erhöhen der cDNAs für das menschliche Wildtyp und motorlose KIF5B Proteine ​​unter Verwendung der Primer in Tabelle 1, Taq-DNA-Polymerase (5 Einheiten pro 100 ul), dNTP-Mix (2 mM je Desoxynukleotid) und dessen 10X Puffer für 30 Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus einem Denaturierungsschritt (95 ° C für 30 sec), einem Glühschritt (45 ° C für 30 sec) und einem Verlängerungsschritt (72ºC für 3 min). </li><li> Extrahiere die amplifizierte DNA-Produkt mit einem gleichen Volumen Phenol / Chloroform (1: 1). Hinweis: Phenol ist brennbar und kann zu Verbrennungen führen. Chloroform ist gefährlich. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit ihnen und mit ihnen unter einer chemischen Abzugshaube. Alternativ PCR-Produkte können durch verschiedene Kits gereinigt werden. <ol><li> Schleudern bei 18.000 xg in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 1 min. Die wäßrige Lösung in ein neues Röhrchen und Extrahieren mit einem gleichen Volumen an Chloroform. </li><li> Drehenbei 18.000 xg in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 0,5 min. Die wäßrige Lösung in ein neues Röhrchen. </li><li> Mischen der wässrigen Lösung mit einem Zehntel Volumen 3 M Na-Acetat und zwei Volumina absolutem Ethanol. </li><li> Schleudern bei 18.000 xg in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 5 min. Verwerfen der wässrigen Lösung. </li><li> Waschen Sie die DNA-Pellet mit zwei Volumen von 75% Ethanol. Verwerfen der wässrigen Lösung und Luft in das DNA-Pellet bei Raumtemperatur für 5 min trocknen. Resuspendieren DNA-Pellet in 34 ul Wasser. </li></ol></li><li> Verdauen die Amplifikate in einem Endvolumen von 40 ul mit den Restriktionsenzymen SalI (10 Einheiten) und BamHI (10 Einheiten) und 4 &amp; mgr; l der 10X-Puffer bei 37 ° C für zwei Stunden. Die verdauten Produkte auf einem Agarosegel (1,0% bei 100 V), die Ethidiumbromid (0,2 ug / ml). Hinweis: Ethidiumbromid ein potenter mutagen und kann durch die Haut aufgenommen werden. Daher ist es wichtig, direkten oder indirekten Kontakt zu vermeiden, with Ethidiumbromid. </li><li> Schneiden Sie die richtigen Bands zur Reinigung aus durch Spalten. Man wiegt das Agarosegel das DNA-Fragment enthält. Dann löst ihn in der Solubilisierungspuffer (300 &amp; mgr; l für 0,1 g) bei 37 ° C für ca. 20 min. </li><li> Fügen Sie die erhaltene Lösung auf eine Säule und Schleudern in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für 5 sec. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Die Säule wird mit 0,5 ml Solubilisierungspuffer durch den Schritt 1.5 wiederholen. Die Säule wird erneut mit 0,75 ml Waschpuffer durch den Schritt 1.5 wiederholen. Drehen Sie die Spalte für 2 Minuten, um loszuwerden, die verbleibende Waschpuffer. </li><li> Man eluiert das DNA-Fragment mit 50 ul Wasser um 1,5 Schritt wiederholen. Schätzung der Konzentration des DNA-Fragments, indem ein Aliquot davon gegen einen DNA-Größenleiter in einem Agarosegel (1,0% bei 100 V) ausgeführt enthalten Ethidiumbromid (0,2 ug / ml). </li><li> Ligation der gereinigten Produkte (etwa 100 ng) mit dem ptdTomato-C1-Vektor 17 (etwa 100 ng), die zuvor mit th verdaute gleichen Restriktionsenzymen in 10 ul T4 DNA-Ligase für 16 Stunden unter Verwendung von (2.000 Einheiten) und 1 ul 10x Ligationspuffer bei Raumtemperatur. Hinweis: Die Wildtyp und Mutante motorlosen enthält Aminosäuren 2-963 und 584-963, respectively. Zuvor wurde eine größere motorlose KIF5B Mutante verwendet, um seine Funktion 9 zu identifizieren. Eine kleinere motorlose KIF5B Mutante wurde für den vorliegenden Untersuchungen verwendet, um seine Expressionsniveaus zu erhöhen. </li></ol> 2. Immunfluoreszenz-Mikroskopie <ol><li> Für Live-Zelle oder indirekten Fluoreszenzbildgebung mit Vergrößerung bei oder unter 40X, Saatgut 0,2-0.300.000 HeLa-Zellen in 1 ml Komplettmedium [Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS)] in jede Vertiefung einer sechs-Well-Platte. Wachsen bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Für die indirekte Immunfluoreszenz-Studien mit Vergrößerungen über 40x, waschen Deckgläser (18 mm x 18 mm, 1,5 Dicke) in absolutem Ethanol kurz und Luft trocknen sie indie Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte in einem biologischen Sicherheitsschrank, Kontamination zu vermeiden. <ol><li> Seed ,2-0.300.000 Zellen in 1 ml komplettem DMEM-Medium in jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Transfektion Complex <ol><li> Am nächsten Tag in einem biologischen Sicherheitsschrank, verdünnte 0,6 &amp; mgr; g (gesamt) des Expressionsplasmids für tdTomato-markierten Wildtyp oder motorlose KIF5B in Gegenwart oder Abwesenheit eines Expressionsplasmids für einen Frachtkandidatenprotein (pTagCFP-c-MYC 5 mit 0,1) ml Transfektion Medium in einem 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Anmerkung: Der Vektor pTagCFP-c-MYC drückt die TagCFP-markierten c-MYC. </li><li> In 1,8 ul des Transfektionsreagenz bis 0,1 ml Transfektionsmediums in einem anderen 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Typischerweise einen Master-Mix von verdünnten Transfektionsreagenz genug für 12 Proben vorzubereiten. </li><li> Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> In der verdünnten 0,1 ml Transfektionsreagenz dem verwässerten 0,1 ml DNAs. miden Inhalt X durch die Rohre umgekehrt wird. Drehen Sie die Rohre für 5 Sekunden in einer Mikro. </li><li> Inkubieren für 45 min bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Das Waschen der Zellen <ol><li> Waschen Sie die beimpften Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) während der Inkubationszeit für die Bildung des Transfektionskomplexes. </li><li> Ersetzen Sie das Medium der ausgesäten Zellen in jeder Vertiefung mit 0,8 ml vorgewärmten Transfektionsmediums. Bringen Sie die Platten in den Inkubator bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Transfektion von Zellen <ol><li> Nach einer Inkubation von 45 min tropfenweise zu jeder Vertiefung der Platte 0,2 ml des DNA / Transfektionsreagenz Komplex (in Schritt 2.3 hergestellten) hinzuzufügen. </li><li> Schaukeln der Platte mit 6 Vertiefungen sanft für 5 Sekunden, bevor sie in den Inkubator bei 37 ° C zurückgeführt werden. </li><li> Nach 6-8 Stunden, ersetzen Sie das Medium mit der kompletten DMEM-Medium. </li></ol></li><li> Lebender Zellen Fluoreszenz-Imaging 18 <ol><li> Nach weiteren 16 h Inkubation einet 37 ° C, fügen die DNA interkalierende Fleck Hoechst 33342 zu dem Medium bis zu einer Endkonzentration von 1 uM. Anmerkung: Hoechst 33342 ist ein zelldurchlässig, DNA interkalierenden Farbstoff, der die Zellkerne färbt. </li><li> Inkubieren der transfizierten Zellen für 10 min im Brutschrank bei 37 ° C, bevor sie für die Expression von fluoreszierenden Proteinen durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines 40X-Objektiv untersuchen. Die Filtersätze für DAPI, CFP, FITC und Cy3 sind (EX350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) und (Ex545 nm / Em605 nm), respectively. Hinweis: Wenn der Hintergrund durch Autofluoreszenz der kompletten DMEM-Medium hoch ist, Medium ohne Phenolrot verwendet wird. </li></ol></li></ol> 3. Für die indirekte Immunfluoreszenz Studies <ol><li> Herstellung von Paraformaldehydlösung <ol><li> Wiegen Paraformaldehydpulver (4 g pro 100 ml PBS) und fügen Sie ihn in PBS. Hinweis: Paraformaldehyd ein brennbarer Feststoff ist und eine potenzielle Krebs hazard. Es reizt Augen, Atmungsorgane und die Haut. Daher ist es wichtig, den Kontakt mit oder Inhalation von Paraformaldehyd zu vermeiden. </li><li> Hinzufügen NaOH zu der Lösung (150 &amp; mgr; l 10 N NaOH / 100 ml). </li><li> Halten der Lösung bei 37 bis 42 ° C für 2-3 h unter gelegentlichem Schütteln. </li><li> PH-Wert auf 7,0 durch Essigsäure zu der Lösung Zugabe (etwa 75 &amp; mgr; l / 100 ml) nach dem Paraformaldehyd Pulver gelöst ist. </li></ol></li><li> Zielproteine ​​Färbung <ol><li> Nach weiterer Inkubation für 16 h bei 37 ° C, Waschen der transfizierten Zellen bei Raumtemperatur einmal mit PBS von den sechs-Well-Platte für 5 sec wirbeln. </li><li> Fix die Zellen mit 1 ml frisch zubereitet, 4% Paraformaldehydlösung pro Vertiefung. für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS wurde 5 sec wirbelnden der sechs-Well-Platte. Entsorgen Sie die Lösung. </li><li> Inkubieren der Zellen mit 1 ml von 0,1% Triton X-100 (in PBS) bei Raumtemperatur für 30 min. die detergent Triton-X 100 die Zellmembran permeabilisiert Zugang von Antikörpern auf ihre intrazellulären Ziele zu ermöglichen. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS viermal durch jedes Mal die sechs-Well-Platte für 5 sec wirbeln. Entsorgen Sie die Lösung nach jeder Wäsche. </li><li> Inkubieren der Zellen mit 1 ml von primären Antikörpern (c-MYC Kaninchen-Antikörper oder p53-Maus-Antikörper; 0,1 &amp; mgr; g / ml) in einem 10% FBS in PBS-Lösung bei Raumtemperatur für 4 Stunden Schaukel. </li><li> Waschen mit PBS viermal durch die Sechs-Well-Platte für 5 Sekunden wirbeln jedes Mal. Entsorgen Sie die Lösung nach jeder Wäsche. </li><li> Inkubieren mit 1 ml von Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten sekundären Antikörper (Alexa Fluor 488-konjugiertem anti-Kaninchen oder Anti-Maus-IgG-Antikörper; 0,5 &amp; mgr; g / ml) in 10% FBS in PBS bei Raumtemperatur im Dunkeln wurde 2 h Schaukel. </li><li> Waschen mit PBS viermal durch die Sechs-Well-Platte für 5 Sekunden wirbeln jedes Mal. Entsorgen Sie die Lösung nach jeder Wäsche. </li></ol></li><li> Kernfärbung und Montage <ol><li&gt; Inkubieren der Zellen mit dem 1 ml DNA interkalierende Farbstoff 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 0,5 &amp; mgr; g / ml) in PBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten in Dunkelheit. Gehen 3.4 zu Schritt, wenn keine Deckgläser verwendet werden. Anmerkung: DAPI ist ein DNA-interkalierenden Farbstoff, der die Zellkerne färbt. </li><li> Bewerben 10 ul Befestigungslösung auf jedem Objektträger. Montieren jedes Deckglas über die Befestigungslösung auf einem Objektträger. </li><li> in der Dunkelheit über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Seal die Ränder der Deckgläser mit Nagellack. Legen Sie in der Dunkelheit im Inneren einer Abzugshaube über Nacht die Nagellack um Abgase zu entfernen. </li></ol></li><li> Fluoreszenzmikroskopie 19 <ol><li> Am nächsten Tag, überprüfen Sie die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie einen 40X-Objektiv verwenden. Die Filtersätze für DAPI, CFP, FITC und Cy3 sind (EX350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) und (Ex545 nm / Em605 nm), respectively. </li></ol></li></ol>

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Das beschriebene Verfahren nutzt die Eigenschaften des motorlose KIF5B Mutante, die die Fähigkeit, entlang der Mikrotubuli zu bewegen fehlt, aber behält die Fähigkeit Dimere mit dem Wildtyp-KIF5B zu bilden und dadurch ermöglichen, die tetrameres Protein mit den gleichen Ladung Proteinen zu interagieren wie der Wildtyp-KIF5B. Freilaufendes KIF5B wirkt daher als dominant negative Mutante und Formen mislocalized mit ihren Ladungen zusammenfasst. Dieses Verfahren hat sich bewährt, die Kinesin-1 Fracht c-MYC (Abbildung 1) 5 zu identifizieren. In diesem Artikel wurde das gleiche motorlose KIF5B Mutante zu identifizieren p53 als eine weitere potentielle Ladung von Kinesin-1 (2) verwendet. Dies zeigt, dass die Methodik möglich ist, andere Ladungen von Kinesin-1 zu identifizieren. Darüber hinaus wird die Spezifität der Mutante durch das Fehlen der Wirkung der Mutante auf der negativen Kontrollprotein c-Fos (Figur 3) vorgesehen. In diesem Protokoll, das tdTomato-markierten Wild tyPE oder motorlose KIF5B Protein wird mit einem anderen fluoreszierenden Protein-markierten Kandidaten Fracht Protein koexprimiert. In diesem Fall werden die lebenden Zellen Fluoreszenzmikroskopie und bildgebende durchgeführt. Die Bildung der Aggregate durch Zeitraffer-Bildgebung verfolgt werden. Alternativ wird die tdTomato-markiertes Protein exprimiert allein und der Kandidat Ladung Protein an seine physiologischen Niveaus durch indirekten Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von spezifischen Antikörpern sichtbar gemacht. Das fluoreszierende Protein tdTomato 17 für die Helligkeit und Lichtstabilität gewählt. Wenn der Hintergrund durch Autofluoreszenz der kompletten DMEM-Medium hoch ist, Medium ohne Phenolrot verwendet wird. Die motorlose KIF5B Mutante bildet Dimere mit dem Wildtyp-KIF5B stöchiometrisch. Daher ist es wichtig, eine ausreichende Menge an motorlose KIF5B Mutante auszudrücken Dimere mit dem Wildtyp-Gegenstück zu bilden, deren Funktion zu inhibieren und Aggregate zu bilden. Zur Bewältigung dieses Problems, die Optimierung der ausdrITZUNG des motorlosen Mutante ist von wesentlicher Bedeutung. Es wird unter Verwendung eines kleinen motorlose Mutante mit dem Dimerisierungsdomäne erreicht. Zusätzlich Optimierung des entsprechenden Transfektionsreagenz und Protokoll ist ebenfalls notwendig. Die Dauer der Inkubation von HeLa-Zellen mit dem DNA / Transfektionsreagenz wurde in HeLa-Zellen für die Expression von exogenen Proteinen und Zelllebensfähigkeit optimiert. Die Inkubationsdauer werden müssen für andere Zelllinien optimiert. Für Vergrößerungen zwischen 4X bis 40X, werden keine Deckgläser erforderlich. Die Zellen können direkt in den Vertiefungen untersucht werden. Daher wird in diesem Fall ist das Protokoll, preiswert und einfach. Für Vergrößerungen über 40x, werden die Zellen auf Deckgläser in den Vertiefungen gewachsen und, nach dem Färben, montiert auf Objektträger zur Untersuchung unter Öl-Immersionsobjektive. Beobachtung der Aggregate des motorlose KIF5B Protein wird durch die Größe des Zytoplasmas beschränkt. Es ist leicht, das zu erkennen,Aggregate in vielen Säugerzellen. Es ist jedoch relativ schwierig, die Aggregate in neuronalen Zellen zu beobachten, wenn das Volumen des Zytoplasma und um die Kerne in Neuriten klein ist. Das Protokoll wird verwendet, um den Zusammenhang zwischen 13-16 KIF5B und ihre Ladungen zusätzlich zu der in vivo Hefe-Zwei-Hybrid und biochemische Pulldown-Assays zu zeigen. Alle diese Tests den Verein unter verschiedenen physikalischen Bedingungen bestimmen und ihre Ergebnisse gegenseitig ergänzen können. Darüber hinaus ist der Vorteil dieses Fluoreszenzassay im Vergleich zu anderen Assays, dass es die Regulierung der subzellulären Lokalisierung der Ladungen durch KIF5B zeigen können (1 und 2). Das Protokoll ist nicht auf KIF5B beschränkt und kann verwendet werden Ladungen anderer Motor Proteine ​​zu identifizieren, wie einige andere Kinesin Motoren 3 und einige der Myosin Motoren 23,24 in den intrazellulären Transport von Ladungen verwendet 3. Diese Motorproteine ​​auch Motor-Domains für die Bewegung entlang von Mikrotubuli für Kinesin-Motoren und Mikrofilamenten für Myosinmotoren enthalten, und Coiled-Coil-Segmente für die Oligomerisierung. Die meisten von ihnen bilden Homodimere 3,23. Daher kann eine ähnliche Strategie zu ihnen angewendet werden durch ihre motorlose dominant negative Mutanten schaffen ihre Ladungen zu identifizieren.

Kinesin-1 ist ein Protein, das Motor anterograden Transport von seiner Ladungen 1,2 vermittelt. Es ist ein Heterotetramer der beiden Untereinheiten von Kinesin Light Chain 1 (KLC1) und zwei Untereinheiten von Kinesin Schwere Ketten (KHCs). KIF5B 1, a KHC enthält einen Motor Domäne an ihrem N-Terminus, die hydrolysiert ATP und wandelt die chemische Energie in mechanische Energie zur Bewegung entlang Mikrotubuli. Seine C-terminale Region enthält die Dimerisierungsdomäne, die mit KLC1, die mit Ladungen assoziiert interagiert. Kinesin-1 transportiert Ladungen wie Vesikel, Organellen und mRNAs 3,4. Kürzlich wurde KIF5B die Kerntranskriptionsfaktor c-MYC für proteosomalen Abbau im Zytoplasma 5 zu transportieren gezeigt. Drei Methoden (chemischer Inhibitor, siRNA / shRNA und dominant negative Mutante) wurden verwendet, Kinesin-1-Funktion zu hemmen. Alle Aggregation von c-MYC in das Zytoplasma induziert. Für die letzte Methode, c-MYC wurde nur von der herrschenden negat betroffenive Mutante von KIF5B, aber nicht von der eines anderen verwandten KIF5A Motor Protein, was darauf hindeutet, dass die Mutante nicht allgemeine Wirkungen auf die intrazellulären Komponenten ausübt (wie Mikrotubuli Störung) oder Proteinaggregation. Die dominant negative Mutante von KIF5B wirkte sich auch keine andere Transkriptionsfaktor, was darauf hindeutet, dass es keine allgemeinen Auswirkungen auf die Transkriptionsfaktoren ausübt. Vielmehr schlägt er vor, dass die dominante negative Mutante spezifische Auswirkungen auf die Ladungen ausübt. Die Verwendung von dominant negativen Mutanten ist auf dem Gebiet der Motorproteine ​​gemeinsam. Ähnliche motorlosen Mutanten von kinesins und Myosine wurden bisher verwendeten. Sie wurden hauptsächlich verwendet, 6-12 die Wirkung der Mutanten auf die subzelluläre Lokalisation ihrer Ladungen oder auf zelluläre Funktionen zu demonstrieren. Weniger Wert wurde zwischen den Mutanten auf die räumliche Beziehung setzen und die von ihnen betroffen Ladungen. Jedoch in einigen Fälle wurden die Mutanten beobachtet zusammen lokalisieren mit ihren cargos 6,10. Die Wechselwirkung zwischen KIF5B und die zugehörigen Proteine ​​wurde zuvor von der in vivo Hefe-Zwei-Hybrid-Assay und biochemische Pull-down-Assays, wie Co-Immunpräzipitation und in vitro-Pulldown-Assays 13-16 bestätigt. In diesem Artikel wird eine zusätzliche visuelle Methode unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie beschrieben KIF5B Frachtproteine ​​zu identifizieren. Das Verfahren verwendet eine motorlose KIF5B Mutante, die als dominant negative Mutante wirkt. Es vereinigt in das Zytoplasma und induziert die Aggregation der Ladungen. Die Markierung von Wildtyp und motorlose KIF5B Mutante mit dem fluoreszierenden Protein tdTomato 17 ermöglicht, ihre Visualisierung von Fluoreszenzmikroskopie. Die markierten KIF5B Proteine ​​können aus dem KIF5B Tag getrennt mit spektralen Eigenschaften in geeigneter Weise an einem anderen fluoreszierenden Protein fusioniert mit einem Kandidatenprotein coexprimiert werden. Die markierten Proteine ​​werden direkt in lebenden Zellen beobachtetunter Fluoreszenzmikroskopie. Die Induktion der Aggregation des Kandidatenprotein durch die motorlose KIF5B Mutante wird bestätigen, dass die Kandidaten-Protein ist ein In-vivo-Ladung von KIF5B. Darüber hinaus können die tdTomato-markierten Proteine ​​KIF5B allein in den Zellen exprimiert werden, um ihre Auswirkungen auf die endogene Ladung Proteine ​​zu studieren. Später, Immunfluoreszenz-Mikroskopie durchgeführt wird, in dem die transfizierten Zellen fixiert und mit einem spezifischen Antikörper gegen den endogenen Kandidatenprotein, gefolgt von einem geeigneten sekundären Antikörper konjugiert ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt. In diesem Fall wird die endogene Kandidatenprotein an seinem physiologischen Ebene untersucht. Ähnliche motorlosen Mutanten von anderen Motorproteine ​​hergestellt werden, ihre Ladungen zu identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="620">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">absolute ethanol (200 proof)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">BP2818</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM-I (transfection medium)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, para</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">10342020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">12111424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Quick Gel Extraction kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K210012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">c-MYC rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td align="right">5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p53 mouse antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescent microscope&#160;</td>
			<td colspan="2">Olympus IX71_Fluoview</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer software for imaging</td>
			<td>&#160;cellSens&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Exogen exprimierten Wildtyp KIF5B erschien homogen im Zytoplasma, während c-MYC schien hauptsächlich in dem Kern (1A). Jedoch wird das gebildete motorless KIF5B Mutante Aggregate im Zytoplasma (1A). Die Aggregation des motorlosen KIF5B induziert die Aggregation von c-MYC. Der Prozentsatz der Zellen aggregiert exprimieren TagCFP-markierten c-MYC in den Zellen, die Wildtyp-KIF5B war gering. Es war jedoch signifikant höher, wenn die motorlose KIF5B wurde coexprimiert (1A). Die beobachtete Kolokalisation von mutierten KIF5B mit c-MYC (Figur 1) legt nahe, dass die subzelluläre Lokalisation KIF5B von c-MYC reguliert und c-MYC ist eine Ladung von Kinesin-1. Negative Kontrollen, in denen die Konstrukte wurden allein ausgedrückt werden in der unteren Platte der 1A enthalten. Die Ergebnisse zeigen, dass es keinen signifikanten Durchbluten der Fluoreszenz Emission. Die motorlose KIF5B auch Aggregation des endogenen c-MYC (1B) und den Transkriptionsfaktor p53 (Figur 2) induziert, was anzeigt, dass c-MYC und p53 sind sowohl die Ladungen von Kinesin-1 und KIF5B regelt die subzelluläre Lokalisation von beiden körpereigenen Proteinen. Zusammen mit den Ergebnissen, dass die Kinesin-1-Inhibitor bengal Lacton (RBL) 20 induziert die Bildung von hochmolekularen Spezies sowohl c-MYC und p53 5, ist p53 stieg wahrscheinlich eine Ladung von Kinesin-1. Es ist interessant, dass die Kerntranskriptionsfaktor p53 zu beachten, wie c-MYC, ebenfalls aus dem Zellkern in das Zytoplasma für den proteasomalen Abbau 21,22 exportiert wird. Die Bewegung von Transkriptionsfaktoren durch KIF5B scheint spezifisch zu sein, da die Expression des motorlose KIF5B Mutante nicht die subzelluläre Lokalisation c-Fos nicht beeinträchtigte oder dazu führen, dass (Figur 3) zu aggregieren. Die obigen Daten zeigen, dass die method in dieser Veröffentlichung verwendet ermöglicht die hochspezifische Identifikation von Kinesin-1 Ladungen. Eine ähnliche Strategie kann auch auf andere Motorproteine ​​angewendet werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die Expression des motorlosen KIF5B Mutante induziert c-MYC-Aggregation im Zytoplasma (A) wurden HeLa-Zellen, die mit tdTomato-markierten Wildtyp (WT) KIF5B (rot) und TagCFP-markierten c-MYC (blau).. tdTomato-markierten WT KIF5B schien hauptsächlich im Zytoplasma, während TagCFP-markierten c-MYC hauptsächlich im Zellkern erschien. Allerdings ist die tdTomato-markierten motorlose KIF5B Mutante (rot) fadenförmige oder punktförmige Aggregate im Zytoplasma gebildet. Die Expression des motorlose KIF5B induziert die Aggregation von c-MYC. Das mutierte KIF5B und c-MYC co-lokalisiert zusammen (pink). Die Prozentsätze von Zellen (%) Aggregate von GFP-c-MYC (%) sind anzeigt gezeigt. Die Ergebnisse sind alsMittelwert ± Standardabweichung (n = 3). Negative Kontrollen mit der Expression von tdTomato-markierten KIF5B Proteine ​​oder TagCFP-markierten c-MYC zusammen mit leeren Vektoren (V) werden im unteren Bereich angezeigt. (B) Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem endogenen c-MYC (grün) erhalten, wenn tdTomato-markierten WT oder motorlose KIF5B Proteine ​​(rot) zum Ausdruck gebracht wurden. Die tdTomato-markierten motorless KIF5B Mutante Aggregate im Zytoplasma gebildet und Aggregation des endogenen c-MYC induziert. Beide Arten von Aggregaten co-lokalisiert gemeinsam in das Zytoplasma (orange). Die Kerne wurden mit dem Farbstoff Hoechst 33342 oder DAPI gefärbt. Maßstabsbalken; 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Expression des motorlosen KIF5B Mutante induziert endogenen p53-Aggregation in ter Zytoplasma. In HeLa-Zellen exogene tdTomato-markierten Wildtyp (WT) KIF5B (rot) erschien hauptsächlich im Zytoplasma, während das endogene p53 (grün) erschien vor allem in den Zellkern. Im Gegensatz dazu bildeten die tdTomato-markierten motorlose KIF5B Mutante (rot) Aggregate im Zytoplasma. Die Expression des motorlose KIF5B induziert die Aggregation von p53, was zu einer Co-Lokalisation von KIF5B und p53 im Zytoplasma (gelb). Das Experiment wurde dreimal durchgeführt. Die Kerne wurden mit dem Farbstoff DAPI gefärbt. Maßstabsbalken; 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Abb. 3: Die Expression des motorlosen KIF5B Mutante nicht induziert die Aggregation von c-Fos im Zytoplasma tdTomato-markierten Wildtyp (WT) KIF5B (rot) erschienenhauptsächlich im Zytoplasma von HeLa-Zellen, während EGFP-c-Fos (grün) schien hauptsächlich im Zellkern. Im Gegenteil, die tdTomato-markierten motorless KIF5B Mutante (rot) gebildeten Aggregate im Zytoplasma. Die Expression des motorlose KIF5B hat die Aggregation von c-Fos nicht induzieren. Das Experiment wurde viermal durchgeführt. Die Kerne der Zellen wurden mit dem Farbstoff DAPI gefärbt. Maßstabsbalken; 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> gemeinsame Rückwärtsprimer </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> Wildtyp-KIF5B Vorwärtsprimer </td><td> 5&#39;AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td> motorless KIF5B Vorwärtsprimer </td><td> 5&#39;AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>Tabelle 1: Primersequenzen für die Wildtyp und motorlose KIF5B Proteine ​​klonen.

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Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Hier wird ein Protokoll vorgestellt Kinesin-1 Ladungen zu identifizieren. Ein motorlose Mutante des Kinesin-1 schweren Kette (KIF5B) Aggregate im Zytoplasma und induziert die Aggregation der Ladungen. Beide Aggregate werden unter Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Strategie Ladungen anderer Motor-Proteine ​​zu identifizieren, eingesetzt werden.

Identifikation von Kinesin-1 Cargos Mit Fluoreszenzmikroskopie

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Aufrufe.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Hier wird ein Protokoll vorgestellt Kinesin-1 Ladungen zu identifizieren. Ein motorlose Mutante des Kinesin-1 schweren Kette (KIF5B) Aggregate im Zytoplasma und induziert die Aggregation der Ladungen. Beide Aggregate werden unter Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Strategie Ladungen anderer Motor-Proteine ​​zu identifizieren, eingesetzt werden. 

Serie: Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Forschung

Biologie

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Die Analyse der Autophagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Mithilfe von Starvation Pads in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...