Dieses Protokoll führt zu einer reproduzierbaren und zuverlässigen Chromatinextraktion aus gefrorenen Leberproben für Chromatin-Immunpräzipitationsexperimente. Legen Sie zunächst das Röhrchen mit dem gefrorenen Gewebe in den Mörser und lassen Sie es dort fünf Minuten ruhen. Üben Sie dann mit einem vorgekühlten Stößel Druck auf die Probe aus, bis keine festen Krümel mehr vorhanden sind.
Entfernen Sie das Röhrchen mit der Probe aus dem Mörser. Fügen Sie 950 Mikroliter eiskaltes PBS mit den erforderlichen Inhibitoren hinzu und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, bis die Probe vollständig resuspendiert ist. Übertragen Sie die Gewebesuspension sofort in den Homogenisator und wenden Sie 20 bis 30 Hübe mit Stößel A an, um eine feinere Suspension zu erhalten.
Vermeiden Sie es, den Stößel außerhalb der flüssigen Phase zu bewegen, um Schaumbildung zu vermeiden. Übertragen Sie das Homogenat in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen, das zuvor auf Eis gekühlt wurde. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 1.300 G und vier Grad Celsius.
Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vollständig in 950 Mikrolitern PBS bei Raumtemperatur durch vorsichtiges Pipettieren. Fügen Sie dann 63,6 Mikroliter 16%methanolfreies Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 1% zu erhaltenDrehen Sie das Röhrchen sofort 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie nach der Rotation 113 Mikroliter 1,25 molare Glycin bei Raumtemperatur hinzu, um eine Endkonzentration von 125 Millimolar zu erhalten, und drehen Sie das Röhrchen weitere fünf Minuten lang.
Dann zentrifugieren Sie die Probe bei 1.300 G für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig, indem Sie 950 Mikroliter eiskaltes PBS mit den erforderlichen Inhibitoren pipettieren. Zentrifugieren Sie die Probe erneut und resuspendieren Sie das Pellet wie zuvor gezeigt.
Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt noch einmal und fahren Sie sofort mit der Chromatinisolierung fort. Geben Sie 950 Mikroliter Puffer A mit den erforderlichen Inhibitoren in das Pellet und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. Dann drehen Sie die Röhre 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Nach der Rotation wird die Probe bei 2.000 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entfernt. Geben Sie 950 Mikroliter Puffer B mit den erforderlichen Inhibitoren in das Pellet und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. Dann drehen Sie die Röhre 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Nach der Rotation wird die Probe erneut zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand. Geben Sie dann 300 Mikroliter Raumtemperaturpuffer C mit den erforderlichen Inhibitoren in das Pellet und pipettieren Sie kräftig.
Wirbeln Sie die Probe 15 bis 30 Sekunden lang. Drehen Sie dann das Röhrchen kurz, um die Tropfen auf dem Deckel aufzufangen. Nach dem Beschallen der Chromatinprobe 30 Mikroliter 10%ige Triton X-100-Lösung hinzufügen und fünf bis 10 Sekunden lang wirbeln.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Und geben Sie den Überstand in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis vorgekühlt ist. Übertragen Sie 10 bis 25 Mikroliter geschertes Chromatin in ein neues Röhrchen und fügen Sie Puffer C hinzu, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern zu erreichen.
Aliquot und Schockfrost den Rest des Chromatins bei minus 80 Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung. Fügen Sie acht Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid hinzu und inkubieren Sie es mindestens sechs Stunden lang bei 65 Grad Celsius im Heizblock unter Schütteln mit 1.000 U/min. Verlängern Sie die Inkubationszeit nach Möglichkeit über Nacht.
Nachdem Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen gelassen haben, fügen Sie zwei Mikroliter RNase A hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 1.000 U/min. Nehmen Sie die Proben aus dem Heizblock und fügen Sie sieben Mikroliter 300 millimolare Calciumchlorid und zwei Mikroliter Proteinase K hinzu. Inkubieren Sie die Proben im Heizblock bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten unter Schütteln bei 1.000 U/min. Bereiten Sie in der Zwischenzeit für jede Probe ein Phasentrennröhrchen vor, indem Sie sie eine Minute lang bei vier Grad Celsius auf 16.000 g zentrifugieren.
Nachdem Sie die Röhrchen aus dem Heizblock genommen und drei Minuten lang bei Raumtemperatur im Gleichgewicht gelassen haben, übertragen Sie 400 Mikroliter der Probe in das zuvor zentrifugierte Phasentrennröhrchen. Als nächstes fügen Sie 400 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohollösung hinzu und wirbeln Sie fünf Sekunden lang. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 16.000 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Fügen Sie dann 400 Mikroliter Chloroform hinzu und wirbeln Sie fünf Sekunden lang. Zentrifugieren Sie das Röhrchen weitere fünf Minuten lang und geben Sie 400 Mikroliter der oberen Phase in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen, das 24 Mikroliter fünfmolare Natriumchlorid und 0,75 Mikroliter Glykogen enthält. Dann das Rohr kurz wirbeln.
Fügen Sie 1.055 Mikroliter 100%iges Ethanol hinzu. Anschließend gründlich vortexen und die Probe bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde oder bei minus 20 Grad Celsius über Nacht inkubieren. Nach Abschluss der Inkubation wird die Probe bei 16.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand vorsichtig entfernt, ohne das Pellet zu verschieben.
Fügen Sie 500 Mikroliter kaltes 70%iges Ethanol hinzu und kippen Sie das Röhrchen vorsichtig, um sicherzustellen, dass das Pellet gewaschen wird. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 16.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Überstand und lassen Sie das Pellet bei Raumtemperatur trocknen.
Alternativ können Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius inkubieren, um es schneller trocknen zu lassen. Fügen Sie 50 Mikroliter Tris-EDTA-Lösung hinzu und legen Sie den Schlauch für fünf bis 10 Minuten unter Schütteln bei 300 U/min auf den Heizblock. Analysieren Sie dann die DNA auf einem 1%igen Agarosegel.
Nach der Devernetzung des Chromatins und der Visualisierung der DNA auf dem Agarosegel kann ein erfolgreiches Scheren durch das Vorhandensein von Fragmenten im Bereich von 100 bis 300 Basenpaaren erkannt werden. Das Chromatin wurde erfolgreich mit H3K4-Trimethylierungs-, H3K27-Acetylierungs- und H3-K27-Trimethylierungsantikörpern präzipitiert und mittels qPCR weiter analysiert. Chromosom eins offenes Leseraster 43, Proteasom 20S-Untereinheit beta zwei und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Promotorregionen, die in der Leber aktiv transkribiert werden, zeigten eine Anreicherung für die H3K4-Trimethylierung und die H3K27-Acetylierung.
Im Vergleich dazu waren die Homöobox C13, die Homöobox C12 und die Myelin-Transkriptionsfaktor-Eins-Promotorregionen der Maus, die in der Leber stillgelegt sind, nicht wie erwartet angereichert. Die H3 K27 Trimethylierung zeigt das gegenteilige Verhalten und bestätigt damit den Erfolg der Chromatin-Immunpräzipitation oder des ChIP-Assays. Das Chromatin wurde erfolgreich ChIP-Seq unterzogen.
Nach der Sequenzierung wurden die Schilfrohre auf einen zuvor erstellten Index ausgerichtet und nach Arten getrennt. Die Ablagerung von H3K4-Trimethylierung und H3K27-Acetylierung an den Startstellen der Gentranskription wird wie erwartet mit der Ablagerung der H3K27-Trimethylierung antagonisiert. Es ist bekannt, dass der Hox-C-Cluster sowohl in der Leber von Mäusen als auch von Menschen transkriptionell inaktiv ist.
Das Profiling der H3K4-Trimethylierung und der H3K27-Acetylierung zeigt Peaks für diese beiden posttranslationalen Modifikationen außerhalb des Clusters, während die Signalintensität der H3K27-Trimethylierung innerhalb des Genclusters tendenziell zunimmt. Die Chromatinextraktion aus gefrorenen Gewebeproben weist eine hohe intrinsische Variabilität auf, die stark von der Feinheit der Zellsuspension und der Temperatur während der Vernetzung abhängt. Die Gewährleistung fester Laborbedingungen trägt dazu bei, die Reproduzierbarkeit des Fragmentgrößenbereichs aufrechtzuerhalten.
