Die Autoren danken Elisabeth Blanchard für ihre technische Unterstützung danken. Die Erkenntnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die Ansichten der Centers for Disease Control and Prevention.

Ein. Kultivierung Calu-3 Zellen zur Verwendung in Transwell Kulturen Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur Technik. <ol><li> Um Zellen aus Gefrierlagerung auftauen: <ol><li> Planen Eagles Minimum Essential Medium mit 20% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, und 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Sterile-Filter das vorbereitete Medium unter Verwendung eines 0,2 &amp;mgr; m Porengröße Filter, und warm in einem Wasserbad auf 37 ° C. Genauer reflektierende des in situ Atemwegsepithel Umgebung wird Mediums nicht mit Antibiotika oder Antimykotika ergänzt. </li><li> Auftauen eine gefrorene Kryoröhrchen von Calu-3-Zellen schnell (&lt;1 min) in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Übertragen der aufgetauten Zellen auf eine 50 ml sterile konische Röhre und 30 ml erwärmten EMEM-20% + S. </li><li> Pelletieren der Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 1000-1200 × g,ohne Kühlung und mit geringem Steuerdruck Geschwindigkeit. </li><li> Den Überstand umfüllen sanft und die Zellen in 5 ml erwärmter EMEM-20% + S durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Seed 2 bis 5 × 10 6 Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well Gewebekulturplatte und bei 37 ° C, 7% CO 2 in Luft-Atmosphäre, bis die Zellen 75% - 80% konfluent. Überprüfen Sie täglich, bis zu 7 Tage erforderlich sein. Alle 3-4 Tage saugen das Medium aus den Zellen und ersetzen Sie es mit frischen EMEM-20% + S. </li></ol></li><li> Um Subkultur Zellen: <ol><li> Warm 0,05% Trypsin - 0,02% EDTA in einem 37 ° C warmen Wasserbad. Absaugen Mediums von den Zellen und wäscht die Zellen einmal mit 0,05% Trypsin erwärmte - 0,02% EDTA, um überschüssiges Medium und Serum zu entfernen. Entfernen Sie die Wasch-und 1 ml erwärmt Trypsin pro Well zu den Zellen. </li><li> Bei 37 ° C und 7% CO 2 und unter einem Mikroskop Monitor alle 5 min, bis mindestens 75% der Zellen aus der Wanne (n) der Gewebekulturplatte abzulösen. Dies kannnehmen zwischen 5 und 30 min. </li><li> Waschen der Zellen in EMEM-20% + S, um überschüssiges Trypsin zu entfernen. Übertragung der Zellen auf eine trypsinisierte 50 ml sterile konische Röhre. Mehrere Vertiefungen von Zellen aus einer 6-Well-Kulturplatte können in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen gepoolt werden. 30 ml EMEM-20% + S und Pellet der Zellen durch Zentrifugation bei 1000-1200 xg, ohne Kühlung, und mit geringem Bremsgeschwindigkeit. </li><li> Den Überstand umfüllen sanft und die Zellen in frischem EMEM-20% + S durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Mit Schritte 1.2.1 bis 1.2.3 oben, um Zellen trypsinieren weiterhin Subkultur Zellen in Zellkulturschalen wie in den Schritten 1.2.5 bis 1.2.7 beschrieben, wenn sie zwischen 75 sind - 80% konfluent. </li><li> Subkultivierung von einem Well einer 6-Well-Platte bis zu einem T-25-cm 2-Kolben, in einem Endvolumen von 5 ml 20%-EMEM + S, Säen zwischen 0,5 bis 1 × 10 6 Zellen / Kolben. </li><li> Mit 5 ml erwärmt Trypsin pro T-25 cm 2-Kolben, um Zellen, Subkultur lösenaus einem T-25-cm 2-Kolben bis zu einem T-75-cm 2-Kolben, in einem Endvolumen von 10 ml-20% EMEM + S, Säen von 1 bis 5 × 10 6 Zellen / Kolben. </li><li> Mit 8 ml erwärmt Trypsin pro T-75 cm 2-Kolben, um Zellen, Subkultur von einem T-75 cm 2-Kolben lösen in 2 T-75 cm 2-Kolben. Für ein optimales Zellwachstum, nicht Subkultur Zellen in Kolben größer als T-75 cm 2 oder Subkultur in einem Verhältnis größer als 1 übergeordneten Kolben: 3 neue Flaschen. </li></ol></li><li> Sobald Zellen wurden subkultiviert, vollständig zu entfernen und zu ersetzen Medium alle 2 bis 3 Tage, bis sie 75-90% Konfluenz erreichen. Zellen können bis zu 3 Wochen zu 75-90% Konfluenz erreichen. Für eine optimale Erzeugung polarisierten Kulturen, Subkulturen Zellen, bevor sie wachsen über 90% Konfluenz als Monolayer. </li><li> Weiterhin Subkultur Zellen, bis genügend Zellen auf Saatgut der gewünschten Anzahl von Einsätzen Transwell gewachsen sein. Jeder Transwell-Einsatz benötigt 2 × 10 5 Zellen. Für eine optimale Leistung Erzeugen polarisierten Kulturen, Zellen verwenden, die nicht mehr als 10 Subkulturen unterzogen wurden. </li></ol> 2. Wachsende Polarized Calu-3 Liquid-bedeckten Kulturen (LCC) Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur Technik. <ol><li> Planen EMEM mit 10% FBS (EMEM-10%) und warm in einem Wasserbad auf 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine 24-Well-Transwell Platte für die Aussaat. Mit einer sterilen Pinzette bewegen Transwell Einsätze aus dem Inneren zum Äußeren Reihen der Platte ohne den Einsatz Membran. Zellen sollten nur in die Vertiefungen auf den äußeren Reihen der Platte subkultiviert werden. Um die Einführung der Luftblasen in die basolateralen Kompartimenten verhindern, fügen 600 ul EMEM-10% zu jedem durch Abwinkeln der Pipette gegen die Wand jedes Abteil und langsam freisetzenden das Medium in das Bohrloch. </li><li> Nehmen Zellen aus T-75 cm 2 Gewebe. Subculture Flaschen mit warmen Trypsin, waschen und in 30 ml EMEM-20% + S pro alle 2 Flaschen des trypsinierten Zellen, wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Gründlich resuspendieren gewaschenen Zellen in 5 ml EMEM-10% durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. </li><li> Nachweis lebensfähiger und insgesamt Zellzahlen von der Trypanblau-Methode. Fahren Sie nur fort, wenn 80% - 90% lebensfähig sind. </li><li> In einem 50 ml konischen Röhrchen sterile, verdünnte Zellen auf eine Konzentration von 2 × 10 6 lebensfähigen Zellen / ml mit 10% EMEM-. </li><li> Hinzufügen von Zellen auf der apikalen Kammer jeder Transwell. Um Vertiefungen A1 und D1, die zellfreie Kontrollvertiefungen, dass Rohlinge ist, fügen Sie 100 ul EMEM-10% ohne Zellen sein wird. Zu jedem der verbleibenden Vertiefungen werden 100 ul resuspendierten Calu-3-Zellen, die Pipette vorsichtig Angelgewässer gegen die innere Führungskanal der Einsatzwand und langsam freisetzende die Zellen. Berühren Sie nicht die Pipette mit dem Einsatz Membran. Um eine homogene Suspension von Calu-3-Zellen erhalten, die leicht bewegen Zellsuspensionwährend dieser Seeder Schritt. </li><li> Inkubieren Transwell Platte bei 37 ° C und 7% CO 2 in Luft-Atmosphäre. Legen Sie die Platte in einem Brutschrank, wo physische Störungen minimal sein wird. Um die Effizienz der Polarisation zu verbessern, nicht stapeln Platten auf der jeweils anderen. </li><li> Um Kulturen zu halten, bis polarisiert und bereit, in den Experimenten zu verwenden, vollständig ersetzen Medium in Transwells, wie in den Schritten 2,10 bis 2,13 beschrieben. Medium sollte vollständig drei Tage nach sie in Transwells subkultiviert ersetzt werden, und dann auf einem alternierenden Zyklus zwischen dem vierten und dann dritten Tag nach der letzten Fütterung, bis die Zellen vollständig polarisiert sind. </li><li> Warm EMEM-10% in einem Wasserbad auf 37 ° C. </li><li> Vorsichtig absaugen Medium von Transwell-Einsätze. Mit einem Kapillarpipette an einer Vakuumfalle mit einem leichten Vakuum, oder mit einem Standard 1 ml Pipette Aspirat Mediums aus zellfreien Vertiefungen A1 und D1, dann von Vertiefungen ausgesät, zunächst Entfernen apikalen Mediums von allen Vertiefungen und then Entfernen basolateralen Medium aus allen Wells. Berühren Sie nicht einfügen Membranen während Absaugen Medium. </li><li> Hinzufügen 200 ul EMEM-10% auf die apikale Kompartiment von zellfreien Vertiefungen A1 und D1, dann in die Vertiefungen ausgesät, Leiten des Mediums in die apikale Kompartiment mit der Seite des Einsatzes, um die Pipettenspitze zu führen. Fügen Sie nicht Mediums direkt auf Zellen, und berühren Sie nicht die Einlage Membran. </li><li> Fügen Sie 600 ul EMEM-10% auf den basolateralen Kompartimenten. Um die Einführung der Luftblasen in die basolateralen Kompartimenten verhindern, fügen Mediums zu jedem durch Abwinkeln der Pipette gegen die Wand jedes Abteil und langsam freisetzenden das Medium in das Bohrloch. </li></ol> 3. Auswertung Resistance Entwicklung von Calu-3 LCC Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur Technik. <ol><li> Bewerten transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) von Calu-3 LCC 30 min nachMedium ändert; die Auswertung nach jedem Mediumwechsel durchgeführt werden können, falls gewünscht. Führen Sie Messungen unter sterilen Bedingungen. Beginnen Messungen mit der zellfreie Kontrollvertiefungen A1 und D1 (die Zuschnitte) an Baseline-Messungen zu erhalten, und weiterhin mit Messungen für jede Vertiefung. <ol><li> Unter sterilen Bedingungen übertragen die STX2 Elektrode auf eine 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 70% Ethanol in sterilem Wasser und 15 min sterilisiert. </li><li> Kalibrieren und testen Sie die voltohmmeter für die Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Nehmen Sie die Elektrode aus dem Ethanol, an der Luft trocknen 5-10 sec, und spülen Sie die Elektrode mit sterilen EMEM-10%. </li><li> Stellen Sie den Modus-Schalter des voltohmmeter, um den Widerstand Einstellung, und schalten Sie ON. </li><li> Sanft die Elektrode in einer der drei Anschlüsse, die Zugriff zu erlauben in die basolaterale Kompartiment einer Transwell Kultur. Die Elektrodenspitze so dass der längere Vorsprung nur leicht berührt den Boden der äußeren Wanne und bleibt vertikal,und die kürzere Blei im Gewebekulturmedium der apikalen Kammer, ohne den Einsatz Membran. </li><li> Drücken Sie &quot;Measure R&quot;-Taste, und warten Sie für das Lesen zu stabilisieren. Wiederholen für die anderen zwei Ports für jede Vertiefung und Aufzeichnen der Messungen von allen drei Anschlüssen, also insgesamt aus drei Messungen pro Vertiefung. Weiter, um den Widerstand für alle Vertiefungen der Zellen zu messen. </li><li> Die Elektrode durch Tränken 5 bis 10 min in 70% Ethanol, Spülen in sterilem dH 2 O und Trocknen gründlich. In der Originalverpackung aufbewahren. </li><li> Berechnen des Widerstands jedes Wells, unter Verwendung von Gleichung 1. Ω Ist = Ω Probe - Ω blank, Gleichung 1 wo Ω Probe ist die durchschnittliche Messung von einem seeded gut und Ω blank ist die durchschnittliche Messung von der 2 Brunnen, A1 und D1, die Einsätze und mittlere, aber keine Zellen. </li><li> Berechnen Sie die Flächeneinheit Widerstand, mit Equation 2. Ω tatsächlichen × effektiven Membranfläche = Ω × cm 2, Gleichung 2 wo die effektive Membranfläche beträgt 0,33 cm 2 für 24-Well-Transwell-Einsätze. </li></ol></li><li> Überprüfen, ob Polarisation ist durch Durchführen einer sekundären Assay vollständig, Messen Natriumfluorescein passive Diffusion zwischen den apikalen und basolateralen Kompartimenten, auf ein bis drei Transwell Kulturen. Die Vertiefungen für den Assay verwendet Natriumfluorescein ist unmittelbar nach Beendigung des Tests zu verwerfen. <ol><li> Planen nicht fluoreszierenden Puffer (118 mM NaCl; 4,75 mM KCl; 2,53 mM CaCl 2 · 2H 2 O; 2,44 mM MgSO4; 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 in sterilem Wasser; Sterilfilter mit 0,45 um Filtrationsvorrichtung ). Bereiten Natriumfluorescein bei 1 mg / ml in nicht-fluoreszierenden Puffer, Sterilfilter, in Alufolie wickeln und bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Warm, um Raum-temperaturre vor der Verwendung. </li><li> Nach Abschluss Widerstandsmessungen, vorsichtig Mediums aus beiden basolateralen und apikale Kammern von einem bis drei einzelnen Transwell Kulturen. </li><li> Spülen Transwell Kulturen. Sanft hinzuzufügen 600 ul sterilem Raumtemperatur Dulbeccos PBS (D-PBS) in die basolateralen Kompartimenten und 100 ul sterilem Raumtemperatur D-PBS zu den apikalen Kompartimenten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig D-PBS aus Brunnen. Fügen Sie 600 ul sterilem nicht-fluoreszierenden Puffer zu den basolateralen Kompartimenten. Fügen Sie 100 ul sterilem 1 mg / ml Natrium-Fluorescein an die apikalen Fächern. </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 1 Stunde. CO 2 ist während dieser Inkubationszeit erforderlich. </li><li> Während der Inkubation, bereiten Sie einen Natriumfluorescein Standardkurve zwischen 20 pg / ml und 0 pg / ml, mit nicht-fluoreszierenden Puffer Natriumfluorescein verdünnen. Planen mindestens 8 verschiedenen Konzentrationen von Natriumfluorescein, die jeweils in einem Endvolumen von mindestens 600 ul. HaltenStandardkurve Verdünnungen von leichten bis zu seiner Absorption messen geschützt. </li><li> Übertragen der nicht-fluoreszierenden Probe aus dem Puffer basolaterale Kompartiment jedes Tests zu einem separaten Transwell sauberes Röhrchen für die Analyse. Nehmen Sie den Test Transwells verwendet, um passive Natriumfluorescein Diffusion aus der Platte zu prüfen und zu verwerfen. Bringen Sie die Platte mit den restlichen Transwells in den Inkubator. </li><li> Zeigen 100 ul jeder Standardlösung in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Flachboden-Platte. </li><li> Bereiten Sie drei Verdünnungen von jedem basolateralen Probe (1:2, 1:20 und 1:50) in nicht-fluoreszierenden Puffer und 100 ul jeder unverdünnten Probe und jeder Verdünnung, in zweifacher Ausfertigung, in eine 96-Well-Flachbild- Bodenplatte. </li><li> Maßnahme Probenabsorption auf einem ELISA-Plattenlesegerät bei 486 nm oder 490 nm beträgt. </li><li> Bestimmung der Konzentration von Natrium-Fluorescein im basolaterale Kompartiment durch Vergleich der Absorption der Proben gegen die Absorptionswerte für die Natriumfluorescein strAndard Kurve. </li></ol></li></ol> 4. Infizieren Polarized Calu-3 LCC mit Respiratory Virus Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur-Technik, einer Sicherheitsstufe geeignet für das Virus verwendet wird. <ol><li> Verdünnte Virus in serumfreiem EMEM so daß gewünschte Inocula in 100 ul wäre. </li><li> Waschen der Zellen in serumfreiem EMEM. Vorsichtig absaugen Medium aus allen Vertiefungen, die Beseitigung der apikalen Medium dann den basolateralen Medium. Mit einem Kapillarpipette an einer Vakuumfalle mit einem leichten Vakuum, oder mit einem Standard 1 ml Pipette Aspirat Mediums aus zellfreien Vertiefungen A1 und D1, dann von Vertiefungen ausgesät, das Entfernen des ersten apikalen Mediums von allen Vertiefungen, und dann Entfernen der basolateralen Medium aus allen Wells. Berühren Sie nicht einfügen Membranen während Absaugen Medium. <ol><li> Je 100 ul serumfreiem EMEM zum apikalen Abteil zellfreie Vertiefungen A1 und D1 und dann zu ter Vertiefungen ausgesät, Leiten Mediums in die apikale Kompartiment mit der Seite des Einsatzes, um die Pipettenspitze zu führen. Fügen Sie nicht Medium direkt auf Zellen, und berühren Sie nicht die Einlage Membran. </li><li> Hinzufügen 600 ul serumfreiem EMEM der basolateralen Kompartimenten. Hinzufügen zu jedem Medium Transwell durch Abwinkeln der Pipette gegen die Wand der Kammer und das langsam freisetzende Mittel in das Bohrloch. </li><li> Vorsichtig absaugen serum-freiem Medium aus Brunnen. </li></ol></li><li> Beginnend mit infizierten oder Mock-infizierte Brunnen, fügen Sie entsprechende Virus-Verdünnungen zur apikalen Kompartiment Transwells. Für nicht infizierten Vertiefungen werden 100 ul serumfreiem EMEM zum apikalen Kammer geeigneter Transwells zum Schein infiziert Vertiefungen werden 100 ul virusfreie Präparation in serumfreiem EMEM zum apikalen Kammer geeigneter Transwells verdünnt und für Virusinfektion, verdünnter Virus in serumfreiem EMEM und 100 ul der apikale Kammern geeigneter Transwells. </li><li>Fügen Sie 600 ul serumfreiem EMEM allen basolateralen Kompartimenten. </li><li> Bei 37 ° C und 7% CO 2 für 2 Stunden. </li><li> Absaugen Medium aus Brunnen, zuerst von infizierten und Mock-infizierte Brunnen, dann von infizierten Brunnen. Entfernen apikalen Überstände erstens durch basolateralen Überstände gefolgt. </li><li> Ersetzen Medium mit 200 ul EMEM-10% in den apikalen Fächern und 600 ul EMEM-10% in den basolateralen Kompartimenten. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+culture+conditions+to+develop+an+in+vitro+pulmonary+permeability+model.">Optimisation of culture conditions to develop an in vitro pulmonary permeability model.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 21, 1215-1219 (2007).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmaceutical research. 23, 1482-1490 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Beim Aufbau Calu-3 LCC in Transwell Einsätze können Zellen überhaupt nicht polarisieren, oder nicht vollständig polarisiert, wie durch eine definierte TEER ≥ 1000 Ω x cm 2 und ≤ 1% Natrium Fluoresceinfarbstoff Äquilibrierung zwischen den apikalen und basolateralen Kompartimenten. Zusätzlich kann Calu-3-Zellen in LCC vollständig polarisieren, aber TEER können inkonsistent zwischen Messungen. Obwohl Schwankungen TEER Messungen von Calu-3 LCC normalen von Tag zu Tag sind, werden einmal vollständig polarisiert, dramatische Schwankungen in TEER nicht zu erwarten, bis die Kultur natürlich mit dem Alter abnimmt, was kann so wenig wie 5 Wochen oder so lange wie 12 Wochen nach der Aussaat. Die Fähigkeit von Calu-3 LCC zu polarisieren hängt teilweise wie Zellen subkultiviert werden beibehalten und vor Einsatz in der Transwell-System. Zellen, die über 90% Konfluenz als Monolayer während Subkultivierung geworden, die vor mehr als 10 mal aus gefrorenen Vorrat subkultiviert, oder die haben nichten mit frischem Medium in regelmäßigen Abständen zugeführt sind weniger wahrscheinlich, vollständig zu polarisieren, und beliebige Polarisation ist wahrscheinlich schnell sinken. Unvollständige oder völliges Fehlen der Polarisation kann auch auf eine Veränderung der Material-und Porengröße von Transwells für Calu-3 LCC verwendet zugeschrieben werden, und viel zu viel Variation in Transwells ähnlicher Zusammensetzung und die Porengröße kann auch Auswirkungen auf Polarisation. Größere Porengrößen ermöglichen Calu-3 durch die Transwell Membran in der basolateralen Kompartiment wachsen, Verhinderung der Kultur aus polarisieren. Ein Fehlen der Polarisation kann auch durch bakterielle Wachstum, angedeutet durch getrübte Kulturmedium, das anschließende Aufteilung der Tight Junctions zwischen Calu-3-Zellen führt. Variable TEER Messungen von Calu-3 LCC kann durch mechanische Störungen der Calu-3 LCC Zellmonoschichten, die Einsätze oder die Platten selbst verursacht werden. Medium Änderungen und TEER-Messungen sollten ohne Pipettenspitzen oder elektro durchgeführt werdende führt die Berührung der Zellen. Während der Durchführung dieser Operationen ist darauf zu vermeiden Einführen von Luftblasen in den apikalen und basolateralen Kompartimenten, die die Fähigkeit des voltohmmeter um Widerstand detektieren stören wird. Die Fähigkeit des voltohmmeter Resistenz in einem Kulturmedium, das tatsächlich polarisierten detektieren kann auch durch Protein Anhaftungen an den Elektrodenleitungen begrenzt. Dieser Aufbau kann unter leichtem Schleifen entfernt werden, oder kann durch Ersetzen der Elektrode behoben werden. Sobald Calu LCC-3 vollständig zu polarisieren und das nicht mehr TEER zunehmende sind Calu LCC-3 zur Verwendung als ein in vitro-Modell zur Charakterisierung Host Lungenepithelzellen Zellantworten auf Atemwegsinfektion bereit. Dieses System erlaubt eine bessere Charakterisierung der Erreger gerichtete Reaktion auf gegenüber Monoschicht kultivierten Zelllinien Lunge traditionell zur respiratorischen Erreger wie A549 und HEp-2-Zellen zu untersuchen, mit den zusätzlichen Vorteilen Calu-3 LCC being schneller zu entwickeln, leichter erhältlich und billiger zu erzeugen als primäre, polarisierten, differenzierten NHBE. Ähnlich NHBE, polarisiert Calu-3 zeigen, tight junction Bildung und produzieren Schleimstoffe. Doch im Gegensatz zu NHBE, nicht polarisierte Calu-3-Zellen nicht in Schichten von Basalzellen und Flimmerepithel cylindrischen Epithelzellen differenzieren, und nur wenige polarisierten Calu-3-Zellen zu entwickeln Zilien Fortsätze 19. So, obwohl nützlich für die Prüfung polarisierte Reaktionen der Atemwege Epithelzellen der Atemwege Beleidigung, sind polarisiert Calu-3 LCC nicht ein ideales Modell der Atemwege Entwicklung oder Umgestaltung in Reaktion auf Atemwege Beleidigung oder Verletzung zu untersuchen. Schleim Produktion von kultivierten Zellen in vitro kann Auswirkungen auf zellulärer Infektiosität sowie Freisetzung von infektiösen Viren und Virus-Ausbreitung in einem polarisierten Modell und einen direkten Vergleich der Schleimproduktion zwischen polarisierten Calu-3 LCC und polarisiert, differenzierte NHBE wurde nicht berichtet . A549 und HEp-2-Zellen are Kultur leichter als Calu-3-Zellen, jedoch im Gegensatz Calu-3 LCC, bilden sie keine polarisierten Kulturen, wenn auf Transwell Einsätze gewachsen, und sind somit nicht ideale Modelle zur Untersuchung in vitro die Reaktionen der polarisierte Epithelzellen der Atemwege Virusinfektion .

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENZIEN </td></tr><tr><td> Calu-3 </td><td> ATCC </td><td> HTB-55 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin - 0,02% EDTA </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Eagle Minimum Essential Medium (EMEM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 07-00100DK </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td> Hitze-Inaktivierung, 56 ° C, 30 Min. </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren 100X (10 mM) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11140 </td><td> Lagerung bei 4 ° C im Dunkeln </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> EMEM-10% FBS (EMEM-10%) </td><td></td><td></td><td> Supplement EMEM mit hitzeinaktiviertem FBS bis 10% Serum, steril-Filter </td></tr><tr><td> EMEM-20% FBS + Ergänzungen (EMEM-20% + S) </td><td></td><td></td><td> Supplement EMEM um Endkonzentrationen: hitzeinaktiviertes FBS, 20%; 1X Aminosäuren; 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES; sterilen-Filter </td></tr><tr><td> 24-Well-Platten Transwell </td><td> Corning Costar </td><td> 3472 </td><td> 3 um Porengröße, Polyester </td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15250 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma </td><td> E7023 </td><td> Bereiten Sie sich 70% unter Verwendung von sterilen dH 2 O </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (D-PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> Nicht-fluoreszierenden Puffer </td><td></td><td></td><td> 118 mM NaCl;4,75 mM KCl; 2,53 mM CaCl 2 · H 2 O; 2,44 mM MgSO4; 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 in sterilem Wasser; sterilen-Filter </td></tr><tr><td> Natriumfluorescein </td><td> Sigma </td><td> 6377 </td><td> 1 mg / ml in sterile nicht-fluoreszierenden Puffer; sterile-Filter, vor Licht schützen; bei 4 ° C bis zu 6 Monaten </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> Voltohmmeter </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> STX2 Elektrode </td><td> World Precision Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ELISA-Reader </td><td></td><td></td><td> Für die Messung von A 486 oder A 490 </td></tr></tbody></table>

establishing a liquid-covered culture of polarized human airway epithelial calu-3 cells to study host cell response to respiratory pathogens in vitro

Die apikalen und basolateralen Oberflächen Epithelzellen der Atemwege nachzuweisen direktionale Antworten auf Erregers Exposition in vivo. So, ideal in vitro Modellen zur Untersuchung zellulärer Reaktionen auf Atemwegspathogene polarisieren, bilden apikalen und basolateralen Oberflächen. Ein solches Modell ist normale menschliche Bronchialepithelzellen (NHBE) differenziert. Jedoch erfordert dieses System Lungengewebe Proben, Fachkenntnisse Isolierung und Kultivierung epithelialer Zellen aus Gewebe, und die Zeit, um ein Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche Kultur erzeugen. Calu-3-Zellen, aus einer menschlichen Bronchien Adenokarzinom abgeleitet sind eine alternative Modell zur Untersuchung der Reaktion von proximalen Atemwegsepithelzellen die Atmungsorgane Insult 1, pharmakologischen Verbindungen 2-6 und 7-9 bakterielle und virale Pathogene, einschließlich Influenzavirus, Rhinovirus und schwere akute respiratorische Syndrom - assoziierte Coronavirus 10-14. Kürzlich, we gezeigt, dass Calu-3-Zellen anfällig Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Infektion in einer Weise, die mit NHBE 15,16 sind. Hier stellen wir ausführlich die Einrichtung einer polarisierten, flüssige verschneiten Kultur (LCC) von Calu-3-Zellen, die sich auf die technischen Details des Anbaus und der Kultivierung Calu-3-Zellen, die Aufrechterhaltung Zellen, die in LCC kultiviert wurden, und wir, die Verfahren zum Durchführen von respiratorischen Virusinfektionen des polarisierten Calu-3-Zellen. Um eine gleichbleibend zu erhalten polarisierten Calu-3 LCC, Calu-3-Zellen müssen vor Kultivierung in Transwell Einsätze subkultiviert werden. Calu-3 Monolayerkulturen sollte unter 90% Konfluenz zu bleiben, sollte subkultiviert weniger als 10-mal aus gefrorenem Lager ist, und sollten regelmäßig mit frischem Medium versorgt werden. Einmal in Transwells kultiviert, muss Calu-3 LCC mit Vorsicht behandelt werden. Unregelmäßige Medienwechsel und mechanische oder physikalische Unterbrechung der Zellschichten oder Platten negativ beeinflussen Polarisation fürmehrere Stunden oder Tage. Polarisation wird durch Auswertung transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) überwacht und durch Auswertung des passiven Äquilibrierung von Natriumfluorescein zwischen den apikalen und basolateralen Kompartimenten 17,18 verifiziert. Sobald TEER Plateaus bei oder über 1.000 Ω × cm 2, Calu-3 LCC einsatzbereit, um zelluläre Reaktionen auf Atemwegspathogene untersuchen.

Wenn sie als Flüssigkeit bedeckten Kulturen (LCC) in Transwell Kultursystemen gezüchtet, wie in Abbildung 1, Calu-3-Zellen polarisieren, Entwicklung deutliche apikalen und basolateralen Flächen dargestellt. Nach dem hier beschriebenen Verfahren, erreicht der transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) von Calu-3 LCC ein Plateau bei oder über 1000 Ω x cm 2 innerhalb von 3 Wochen nach der Aussaat, von denen ein Beispiel in 2 gezeigt wird. Die engen Verbindungen zwischen polarisierten Zellen gebildet zu verhindern passive Äquilibrierung von kleinen Molekülen zwischen den apikalen und basolateralen Kompartimenten. Somit wird eine modifizierte Natriumfluorescein Äquilibrierung Assay verwendet werden, um Polarisation des Calu-3 LCC 15,17,18 bestätigen. Da der TEER von Calu-3 Zellmonoschichten in LCC zunimmt, nimmt die Menge von Fluorescein, die passiv äquilibriert in das basolaterale Kompartiment. Sobald der TEER beträgt 1.000 Ω x cm 2, wobei die Menge von Fluorescein, die in äquilibriertzur basolateralen Abteil ≤ 1%, wie in Abbildung 3 gezeigt, daher sind Calu-3 LCC als vollständig polarisiert ist, wenn der TEER ≥ 1000 Ω · cm 2. Der Gipfel TEER Messung von Calu-3 LCC kann von Experiment zu Experiment variieren. Allerdings, wenn TEER-Werte Plateau für einen bestimmten Experiment, kann ein vollständig polarisiert, nicht infizierten Calu-3 LCC für fünf stabilen bis 12 Wochen nach der Aussaat. Fehlen Resistenzentwicklung in Transwell-kultivierte Calu-3 kann von verschiedenen Faktoren, wie in Tabelle 1 dargelegt verursacht werden. Sobald der TEER von Calu-3 LCC Plateaus bei oder über 1000 Ω x cm 2, ist das Modell nun verwendet, um zu untersuchen Atemwegsepithelzellen Zellantworten auf Atemwegspathogene einschließlich Respiratory Syncytial Virus (RSV). Die Exposition gegenüber RSV führt zu einem raschen Rückgang im polarisierten Kultur Integrität im Vergleich zu einem Mock-Infektion von Zellen (Abbildung 4). Abbildung 1. Querschnittsdarstellung der Transwell-kultivierten Zellen. Zellen werden auf der apikalen Oberfläche des Einsatzes Membran gewachsen. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig2.jpg" /> Abbildung 2. Entwicklung des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) und Polarisation Calu-3-Zellen nach dem Aussäen in Transwell-Einsätze. Zu jedem Zeitpunkt wird TEER als Median Ω x cm 2 ± SEM von 32 unabhängigen Vertiefungen aus einem repräsentativen Experiment. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig3.jpg" /> Abbildung 3. Passive Gleichge<html> brierung von Natriumfluorescein in das basolaterale Kompartiment Calu-3 Zellmonoschichten gehemmt als Zellen polarisiert zu werden. kumulierten Daten aus vier unabhängigen Experimenten dargestellt. Jeder Datenpunkt stellt einen einzelnen Messung. <img alt="Abbildung 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50157/50157fig4.jpg" /> Abbildung 4. RSV-Infektion von polarisiertem Calu-3 LCC beschleunigt einen Rückgang der Monoschicht Integrität. Polarisierte Calu-3-Zellen wurden mit RSV-A2 mit einer MOI = 1 am Tag 0 infiziert und Polarität wurde für 8 Wochen nach der Infektion überwacht. Ein repräsentatives Experiment gezeigt. Die Daten sind als Median Widerstand 8 unabhängige Wells pro Infektion ± SEM pro Zeitpunkt vorgestellt. * P &lt;0,05 zwischen Mock-und RSV-A2-infizierten Kulturen, wie durch den Student-t-Test ermittelt. Wegen &quot;&gt; <tbody><tr><td> Ausgabe </td><td> Auflösung (s) </td></tr><tr><td> Widerstand ist nicht messbar </td><td><ul><li> Entfernen Sie alle Luftblasen in den Vertiefungen </li><li> Verwenden Calu-3-Zellen, die aus gefrorenen Lager wurden weniger als 10 Mal subkultiviert </li><li> Lassen Sie keine Calu-3-Zellen auf 100% Konfluenz in Monolayer Subkultur zu erreichen </li><li> Überprüfen, ob die Zellen wachsen nicht auf den Kunststoff deutlich unterhalb des Einsatzes (was anzeigt, dass die Zellen durch die Poren des Einsatzes gewachsen) </li><li> 2-3 Wochen nach der Aussaat für die vollständige Entwicklung von Resistenzen </li><li> Überprüfen Sie die Zusammensetzung und Porengröße von Einsätzen verwendet werden, bei Bedarf ändern (empfohlen Polyester Einlage, 0,3 um Porengröße, keine Beschichtungen siehe Materialien für Details) </li><li> Prüfen Sie die Qualität der Elektrode, Schleifen sanft angesammelt Proteine ​​von der Spitze entfernen und ersetzen falls nötig </li><li> Überprüfen Medium für bakterielles Wachstum </li></ul&gt; </td></tr><tr><td> Widerstand entwickelt, aber voller Polarisation (≥ 1.000 Ω × cm 2) wird nicht erreicht </td><td><ul><li> Zusätzliche Zeit für die Polarisation zu entwickeln (manchmal dauern kann bis zu 4 Wochen) </li><li> Verwenden Calu-3-Zellen, die aus gefrorenen Lager wurden weniger als 10 Mal subkultiviert </li><li> Lassen Sie keine Calu-3-Zellen auf 100% Konfluenz in Monolayer Subkultur zu erreichen </li><li> Durchweg ersetzen Medium in Transwell Kulturen, abwechselnd zwischen dem dritten und vierten Tag nach vorheriger Fütterung </li><li> Kultur nur Zellen auf Einsätze, die in den äußeren Reihen von Platten gelegt werden </li><li> Verwenden Sie eine andere Menge von Transwell-Einsätze </li></ul></td></tr><tr><td> Zellen vollständig zu polarisieren, aber der Widerstand ist nicht konsistent von einer Lesung zur nächsten </td><td><ul><li> Nicht stören oder stapeln Platten im Inkubator </li><li> Nicht zu Vibrationen in der Biosicherheitswerkbank während Transwell plates gehandhabt werden </li><li> Entfernen Sie alle Luftblasen in den Vertiefungen </li><li> Bitte nicht stören die Zellschicht mit Pipettenspitzen beim Medienwechsel oder die Durchführung TEER Lesungen </li><li> Verwenden Sie 200 ul Medium in der apikale Kompartiment, geringere Lautstärke kann zu instabilen TEER Messwerten führen </li><li> Prüfen Sie die Qualität der Elektrode, Schleifen sanft angesammelt Proteine ​​von der Spitze zu entfernen, und falls nötig ersetzen </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Fehlersuche Probleme, die bei der Kultivierung Calu-3-Zellen in Transwells entstehen können. Mehrere Faktoren tragen zu Vollpolarisation von Calu-3-Zellen in flüssigem bedeckten Kulturen, die am ehesten von denen in dieser Tabelle markiert werden.

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Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Die Erkenntnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die Ansichten der Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

22.3K Aufrufe.  Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Die Erkenntnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die Ansichten der Centers for Disease Control and Prevention.

Serie: Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

Abgeleitet von Maus und Mensch primäre gastrische Epithelzellen Monolayer Kultur for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...