Dieses Protokoll dient dazu, die Eintrittsbarriere für Zellkulturexperimente zu senken und ermöglicht es Forschern, adhärente Zellmonoschichten, die in dynamischen mikrofluidischen Umgebungen kultiviert wurden, zu bewerten und zu charakterisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sowohl die qualitative als auch die quantitative Bewertung von Zellmonolageneigenschaften ermöglicht, um als Grundlage für weitere monolagenabhängige Experimente zu dienen. Diese Methode ermöglicht die Rekapitulation eines Alveolarepithels in vitro und ermöglicht so die Erforschung der dynamischen Reaktionen während des akuten Atemnotsyndroms (ARDS) sowie der beatmungsinduzierten Lungenschädigung (VILI).
Rufen Sie zunächst ein einkanaliges Flussarray ab. Reinigen Sie die Oberfläche des Deckglases in einem Ultraschallbad. Tauchen Sie das Deckglas fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in Poly-D-Lysin.
Anschließend bei 60 Grad Celsius 30 Minuten trocknen. Als nächstes bringen Sie doppelseitige Klebstoffe in Mylar-Abstandshaltern an. Laserschneiden Sie wie im Manuskript beschrieben auf das Deckglas und achten Sie darauf, dass die Kanalausschnitte exakt ausgerichtet sind.
Kleben Sie ein rechteckiges Deckglas auf den untersten Klebestreifen. Verwenden Sie die abgezogenen Klebepapiere, um die noch freiliegenden Klebstoffteile abzudecken. Üben Sie nach Abschluss der Montage festen und gleichmäßigen Druck auf die Konstruktion aus.
Spülen Sie den Kanal mit einer Spritze, die mit deionisiertem Wasser gefüllt ist. Sterilisieren Sie das Kanalgehäuse 30 Minuten lang in einem UV-Sterilisator. Behandeln Sie den Kanal mit einer sterilen Technik mit einer in PBS hergestellten humanen Fibronektinlösung und inkubieren Sie ihn mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Bereiten Sie in der sterilen Laminar-Flow-Haube die NCI H441-Zellsuspension mit RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS vor. Verwenden Sie 0,25 Milliliter dieser Zellensuspension, um den Kanal und einen Teil der Anschlüsse zu füllen. Überprüfen Sie mithilfe der Hellfeldmikroskopie, ob die Zellen gleichmäßig in den Kanälen verteilt sind.
Fügen Sie den Medienbehälter und den Absperrhahn zum Kanal hinzu. Beginnen Sie mit der Kultivierung des Kanals bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Verwenden Sie eine programmierbare Spritzenpumpe, um verbrauchte Medien aus dem Kanal und frische Medien aus einem sterilen Medienreservoir, das am Kanaleinlass befestigt ist, in den Kanal zu saugen.
Verdünnen Sie in einem chemischen Abzug eine 4%ige Formaldehydlösung zu DPBS, um eine 1%ige Lösung herzustellen, und lagern Sie sie in einem entsprechend gekennzeichneten Röhrchen. Bereiten Sie die 2%ige Formaldehydlösung auf ähnliche Weise vor. Die Formaldehydlösungen werden in entsprechend gekennzeichnete Fünf-Milliliter-Spritzen umgefüllt.
Ziehen Sie 20 Milliliter DPBS in eine separate 20-Milliliter-Spritze, die für die Waschschritte verwendet wird. Entfernen Sie anschließend den mikrofluidischen Kanal aus dem Kulturgerät und befestigen Sie ihn im Chemikalienabzug. Um die Fixier- und Färbevorrichtung zusammenzubauen, befestigen Sie ein Segment des Transferschlauchs an der seitlichen Öffnung eines Drei-Wege-Absperrhahns über die männliche Luer-Verriegelung an den Schlauchtüllenadapter.
Schließen Sie dann den Absperrhahn an die Einlassöffnung des Durchflussarrays an. Befestigen Sie ein weiteres Segment des Transferschlauchs mit dem gleichen Schlauchtüllenadapter an der Auslassöffnung des vorhandenen Absperrhahns. Befestigen Sie schließlich die freien Enden beider Transferrohre, die jetzt als Abfallleitungen gekennzeichnet sind, in einem für Chemikalien und biologische Gefahren geeigneten Abfallbehälter.
Stellen Sie sicher, dass der Absperrhahn die Einlassöffnung des Durchflussbereichs blockiert, und spülen Sie die Abflussleitung mit DPBS. Drehen Sie dann den Absperrhahn, um die Abfallleitung zu verstopfen, und waschen Sie die Zellen langsam mit zwei Millilitern DPBS. Schieben Sie langsam zwei Milliliter 1%iges Fixiermittel durch den Kanal.
Lassen Sie es fünf Minuten einwirken und wiederholen Sie es mit 2%Fixiermittel. Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit frischem DPBS, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie die 0,1%ige Saponinlösung wie im Manuskript beschrieben vor.
Ziehen Sie zusätzliches DPBS in eine 20-Milliliter-Spritze für den Einsatz in den Waschschritten. Decken Sie das Rohr mit Alufolie ab. Fügen Sie der 0,1%-Saponinlösung das filamentöse Aktin-Färbe-Phalloidin-Reagenz und ein Nukleus-Färbe-Hoechst-Reagenz hinzu.
Übertragen Sie dann die Lösung in eine mit Folie überzogene Spritze. Spülen Sie die Abfallleitung mit einer kleinen Menge Permeabilisierungs- und Färbelösung. Geben Sie dann zwei Milliliter der Lösung in den mikrofluidischen Kanal.
Decken Sie den Kanal mit Alufolie ab, um das Licht zu blockieren. Spülen Sie die permeabilisierende Lösung nach 30 Minuten zweimal für jeweils fünf Minuten mit zwei Millilitern DPBS aus, bevor Sie den Kanal vorsichtig trocknen. Geben Sie mit einer Mikropipette eine minimale Menge eines weich abbindenden Anti-Fade-Eindeckmittels in den mikrofluidischen Kanal und achten Sie darauf, dass die Unterseite vollständig bedeckt ist.
Versiegeln Sie dann das Ende des Kanals. Überprüfen Sie mit einem Hellfeldmikroskop schnell die Integrität der Zellschicht, bevor Sie den Kanal in einem Behälter aufbewahren, um ihn vor Licht zu schützen. Testen Sie die Bildgebungspositionen, indem Sie Referenzscans und Z-Stapel erstellen, bis die gewünschten Bildparameter und -bedingungen erfüllt sind.
Verwenden Sie die Grundplatte des Flow-Arrays als Referenz und konstruieren Sie Z-Stapel an verschiedenen Stellen entlang der Länge des Kanals. Analysieren Sie schließlich Querschnittsdaten, Tiefenkartendaten und andere relevante Merkmale, um die Eigenschaften der Zellschicht zu bewerten. Der erfolgreiche Einsatz der Technik wird in der mikrofluidisch-dynamischen Kulturumgebung durch Bildaufnahme mindestens einen Zentimeter vom Ein- und Auslass demonstriert.
In einem repräsentativen Kulturdauerexperiment wurde eine erfolgreiche Monolagenproduktion beobachtet, wenn die Zellen 24 Stunden lang kultiviert wurden. Bei einer Kultivierung über einen Zeitraum von 48 Stunden wurde jedoch eine unerwünschte Mehrschichtbildung festgestellt. Die Daten, die von jedem der fünf mikrofluidischen Kanal-Imaging-Standorte gesammelt wurden, zeigen auch den Zusammenhang zwischen einer längeren Kulturdauer und einer vergrößerten Querschnittsfläche, was darauf hindeutet, dass innerhalb von 48 Stunden nach der Kultur eine ungleichmäßige Schichtbildung oder ein übermäßiges Wachstum auftritt.
Es wurde die Tiefenkarte einer zentralen Stelle innerhalb des mikrofluidischen Kanals erstellt, die für 24 Stunden kultiviert wurde, was für die qualitative Bewertung von Schichteigenschaften nützlich ist. Die drei wichtigsten Aspekte dieses Protokolls sind die richtige Kanalkonstruktion, genaue Kultur- und Medienflussbedingungen und die sorgfältige Verwendung des Fixierungs- und Färbeapparats. Im Anschluss an dieses Verfahren können parallel andere Methoden verwendet werden, um die experimentelle Durchführbarkeit der hergestellten Zellmonoschichten zu validieren, wie z. B. die elektrische Zellsubstrat-Impedanzsensorik, ECIS, oder der transepitheliale elektrische Widerstand, TEER.
