Meine Forschung konzentriert sich auf das Verständnis des Umbaus der menschlichen Atemwege. Die menschlichen Atemwege dienen als Barriere gegen Umweltgifte, einschließlich Viren, Luftverschmutzung und Tabakrauch. Diese Giftstoffe können die Atemwege verletzen, so dass sie sich verändern oder umgestalten und das Atmen erschweren.
Das Modellsystem umfasst nicht nur die Epithelzellen, die die Barriere bilden, sondern auch andere Zellen, die für die Homöostase der Atemwege wichtig sind, darunter Blutgefäßzellen und Immunzellen, die Makrophagen genannt werden. Zu den aktuellen experimentellen Herausforderungen gehört die Modellierung der menschlichen Lunge in einem in vitro Modellsystem. Die Gewinnung von primären Lungenproben ist schwierig und sie sind auch sehr schwer zu kultivieren.
Daher ist die Verwendung von aus Stammzellen gewonnenen Lungenatemwegszellen, die mit Endothelzellen und Makrophagen angereichert sind, der nächste Schritt, um diese Herausforderungen zu meistern. Beschichten Sie zunächst die apikale Seite von Polyester-Zellkultureinsätzen mit 3 Mikrometer Poren mit 4 Milligramm pro Milliliter extrazellulärer Matrixlösung (ECM). Pipettieren Sie die restliche ECM-Lösung heraus.
Legen Sie die Platte dann für 1 Stunde bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Übertragen Sie die Zellkultureinsätze mit einer sauberen Pinzette steril von der 12-Well-Platte in eine große Petrischale. Beschichten Sie anschließend die basolaterale Seite der Zellkultureinsätze mit ECM-Lösung.
Nachdem Sie die restliche ECM-Lösung abgepipettiert haben, stellen Sie die Petrischale in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um sie über Nacht zu trocknen. Der T75-Kolben mit iPSC-abgeleiteten Endothelzellen wird mit PBS gewaschen. Nach dem Aspirieren der Lösung werden 5 Milliliter trypsinähnliche Protease in den Kolben gegeben und 8 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.
Tippen Sie auf den Kolben, um sicherzustellen, dass sich die Endothelzellen lösen. Anschließend werden die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Fügen Sie 5 Milliliter Stoppmedium hinzu, um die Dissoziation zu stoppen.
Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 300 g. Sobald der Überstand aspiriert ist, wird das Zellpellet in 1 Milliliter Endothelkulturmedium mit 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor erneut suspendiert. Nachdem Sie 150.000 Zellen aliquotiert haben, resuspendieren Sie sie in 100 Mikrolitern Medium und pipettieren Sie sie mit der basolateralen Seite nach oben auf den invertierten Zellkultureinsatz.
Setzen Sie die Zellen vorsichtig in den Inkubator um und lassen Sie sie 3 Stunden lang ungestört. Geben Sie anschließend in einer 12-Well-Platte 1 Milliliter Endothelkulturmedium in jede Vertiefung. Nehmen Sie die Petrischale mit den Endothelzellen aus dem Inkubator.
Übertragen Sie die Zellkultureinsätze mit einer sauberen Pinzette vorsichtig in die Platte mit Endothelkulturmedien. Nachdem Sie visuell überprüft haben, ob die Endothelzellen anhaften, stellen Sie die Platte über Nacht in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Nachdem Sie Organoide aus dem EZM-Polymer isoliert und 15-20 Minuten lang trypsinisiert haben, fügen Sie 3 Milliliter Stoppmedium hinzu, um die Proteasereaktion zu stoppen.
Die Lösung mit einer P1000-Pipette resuspendieren und 5 Minuten lang bei 400 g zentrifugieren. Aspirieren Sie dann den Überstand aus den Organoiden der Atemwege und resuspendieren Sie die Organoide in 1 Milliliter Atemwegsexpansionsmedium mit 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor. Entnehmen Sie eine 10-Mikroliter-Probe für eine Hämozytometer-Zellzählung und legen Sie die restlichen Zellen während der Zählung auf Eis.
Anschließend werden 300.000 iPSC-abgeleitete Atemwegszellen in 500 Mikroliter Atemwegsexpansionsmedium pro 12-Millimeter-Zellkultureinsatz gesät. Entnehmen Sie die Platte mit Zellkultureinsätzen mit Endothelzellen aus dem 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Resuspendieren Sie iPSC-Atemwegszellen und pipettieren Sie 500 Mikroliter mit 300.000 Zellen in die apikale Kammer jedes Zellkultureinsatzes.
Legen Sie die Platte für 48 Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator und halten Sie die apikalen Zellen in Flüssig-Flüssigkeit-Bedingungen. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium von der apikalen Seite des Zellkultureinsatzes. Wechseln Sie das basolaterale Medium zu einer 1:1-Mischung aus Atemwegsdifferenzierungsmedien und Endothelkulturmedien.
Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Dissoziation von iPSC-abgeleiteten Makrophagen aus dem Kolben mit Hilfe eines Zellschabers. Bei 300 g 5 Minuten zentrifugieren.
Danach aspirieren Sie den Überstand. Dann resuspendieren Sie iPSC-Makrophagen in 1 Milliliter MAC-CM2-Medien. Entnehmen Sie eine 10-Mikroliter-Probe für die Zellzählung und legen Sie die restlichen Zellen während der Zählung auf Eis.
Nach der Zählung werden 300.000 Makrophagen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Das Röhrchen bei 200 g 5 Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation den Überstand aus dem Röhrchen pipettieren.
Entfernen Sie die Einsätze mit Co-Kulturen von Endothel- und Atemwegszellen aus dem Inkubator. 300.000 Makrophagen in 35 Mikrolitern MAC-CM2 auf die apikale Seite des Zellkultureinsatzes säen.
