Unterstützt von den National Institutes of Health Gewährung R01EY018144.

Ein. Produktion, Rückfaltung und HPLC Aufreinigung von Holo-RBP <ol><li> Transformieren BL-21cells mit dem pET3a Vektor beherbergen die cDNA für humanes RBP mit 6x His-Tag am N-Terminus. Wachsen die transformierten BL-21-Zellen in einem Schüttler bei 37 ° C in 40 ml LB-Medium mit Carbenicillin bis OD bei 600 nm erreicht, 0.5. Induzieren RBP Proteinexpression durch Zugabe von IPTG bis 1 mM. Wachsen die Bakterien bei 37 ° C weitere 5 Stunden. </li><li> RBP in E.coli produziert wird meist in unlöslichen Einschlusskörpern. Um Einschlusskörper, Pellet-Zellen bei 10.000 × g für 20 min anzureichern. Dann beschallen die Zellen auf Eis in 5 ml PBS mit Protease-Inhibitoren, durch zwei Zyklen von Gefrieren und Auftauen, gefolgt. Pellet nach unten die Einschlusskörper bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und halten Sie die Pellets auf Eis. </li><li> Solubilisierung des inclusion body Pellet durch Beschallung in 10 ml 7,5 M Guanidinhydrochlorid. Hinzufügen eines Hälfte des Volumens (5 ml) von 25 mM Tris-Puffer, pH 9,0 und DTT zu einer endgültigen concentration von 10 mM. Kräftig mischen Lösung auf einem Vortex-Mischer über Nacht bei Raumtemperatur vollständig zu reduzieren und zu denaturieren Proteine. </li><li> Zentrifugieren der Proteinlösung, um unlösliches Material zu entfernen bei 18.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Nach dem Spin, den Überstand in ein neues Röhrchen und das Reagenzglas auf Eis. </li><li> Planen vier Volumina (60 ml) von Rückfaltungspuffer (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM Cystin, 3,0 mM Cystein, 1 mM EDTA). Entgasen Rückfaltungspuffer. Bereiten auch 600 ul 10 mM Retinol in Ethanol unter dim rotes Licht. Halten Sie es im Dunkeln auf Eis. Sowohl die Rückfaltungspuffer und Retinol-Lösung müssen frisch zubereitet. </li><li> Abkühlen sowohl die Proteinlösung und die Rückfaltungspuffer auf Eis für mindestens 30 min. Höhere Temperaturen wahrscheinlich reduziert die Qualität der rückgefaltet RBP. 1 ml Rückfaltungspuffer zugetropft und 10 ul Retinol Lösung wiederum während Proteinlösung wird kräftig in einem Becherglas auf Eis gemischt. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Rückfaltungspuffer und Retinolzugegeben. Halten Rühren der Reaktionsflüssigkeit auf Eis im Dunkeln für 5 Stunden. </li><li> Abzentrifugieren der Neufaltungsreaktion bei 24.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Es ist wesentlich, um die Aggregate direkt nach dem Neufaltungsreaktion entfernen. </li><li> Konzentrieren die überstehende Lösung mittels Amicon Ultra 15 Konzentrator (MWCO 10 K) bis etwa 10 ml beträgt. Nicht konzentrieren die rückgefaltet Lösung mehr als dieser Ebene. Konzentrieren zu viel wird, um Proteinaggregation führen und senkt die endgültige Ausbeute und Qualität des korrekt gefalteten RBP. Verdünnen der konzentrierten Probe mit kaltem PBS auf 100 ml. Der Zweck dieses Schrittes ist es, die Komponenten in dem Neufaltungsreaktion, die mit Nickel stören Reinigung entfernen. </li><li> Drehe den Lösung noch einmal bei 24.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Es ist wichtig, einen Niederschlag zu entfernen. Den Überstand in zwei 50 ml Röhrchen, die jeweils 1 ml Ni-NTA Gülle, die mit PBS gewaschen wurde. Drehen werden die Röhrchen bei 4 ° C für eine Stunde. Inkubation verdünnte Lösung foder 1 h kann das Ausfällen von fehlgefalteten Proteinen, die entfernt werden müssen. </li><li> Spin down die Röhrchen bei 500 xg für 3 min. Überstand entfernen vorsichtig. Alles floating entfernt werden sollte. Kaltes PBS auf 30 ml für jede Röhre. Spin wieder und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis Sie nichts Beads im Röhrchen zu sehen. </li><li> Übertragen der Ni-NTA-Harz in einen leeren Spalte. Waschen Harz mit 20 Säulenvolumina 10 mM Imidazol, 500 mM NaCl in PBS. Eluieren His-RBP in 5 Säulenvolumen 100 mM Imidazol in PBS. Nicht speichern diese Lösung über einen längeren Zeitraum, und Einfrieren verringert die endgültige Ausbeute und Qualität. Für das beste Ergebnis, reinigen RBP mittels HPLC sofort. </li><li> Dialysieren His-RBP von der Ni-NTA-Harz gegen 25 mM Tris, pH 8,4, und 120 mM NaCl gereinigt. Ein Konzentrator kann auch für Puffer-Wechsels benutzt. Klare Proben für die HPLC durch Zentrifugation bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C direkt vor jedem Durchlauf. </li><li> Entschlacken Holo-RBP auf HPLC unter Verwendung einer Ionen-Austauschkolonne AX-300 durch einen NaCl-Stufengradienten (220 mM 12 min, 360 mM 15 min und 1000 mM 15 min) unter Verwendung von 25 mM Tris, pH 8,4 als mobile Phase mit 1 ml / min. Als NaCl-Konzentration ansteigt, wird Holo-His-RBP während apo-RBP freigegeben und fehlgefaltete RBP bleiben an die Säule gebunden (Abbildung 1). Wenn RBP Rückfaltung nicht getan ist optimal, fehlgefaltete RBP (zB fehlgefaltete RBP-I in Abbildung 1) kann die ganze Vorbereitung überwiegen. </li><li> Wiederherstellen der korrekt gefalteten Holo-RBP aus den Peak-Fraktionen bei 360 mM NaCl. Sorgfältig überwachen das Elutionsprofil von korrekt gefalteten und fehlgefaltete His-RBP. Bei 1.000 mM NaCl, fehlgefaltete meisten His-RBP freigelassen werden sollten. </li><li> Fraktionen, die Holo-RBP werden vereinigt, eingeengt, und gegen PBS über Nacht bei 4 ° C. Überprüfen Sie die endgültige Ausbeute und Qualität (330 nm/280 nm) durch Spektralphotometer. Korrekt gefalteten Produkt sollte eine 330 nm/280 nm Verhältnis etwas höher als 1 (Abbildung 1). </li><li> Um die Produktivität zue apo-RBP, fügen Sie ein gleiches Volumen Heptan zu den gereinigten Holo-RBP und vorsichtig mischen durch Drehen über Nacht bei 4 ° C. Zentrifuge bei 16.000 g für 10 min bei 4 ° C und vorsichtig übertragen die untere wäßrige Phase in ein neues Röhrchen (Vermeidung des Niederschlages an der Grenzfläche). Den Vorgang wiederholen, dreimal mit einer 3-stündigen Inkubation für jede. Überprüfen Absorption auf einer Nanodrop Spektralphotometer sicherstellen, dass die 330 nm Peak hat in den Hintergrund Ebene verringert. </li></ol> 2. Echtzeit-Überwachung der Stra6-katalysierten Retinol Release and Retinol Loading <ol><li> Blockieren eines schwarzen 96-Well-Microfluor-2 Platte (Thermo Scientific) mit 200 ul Blocker Casein (Pierce) über Nacht bei 4 ° C, um unspezifische Anhaften von Holo-RBP auf den Kunststoff zu vermeiden. Blocker Casein bietet die beste Sperrwirkung der alle Sperren Lösungen, die wir getestet. </li><li> Membranen frisch aus Zellen, die Stra6 oder Kontrolle Zellen hergestellt werden gewaschen mit PBS und durch eine Hamilton-Spritze (Gasti übergebenght # 1710) 6 mal, um eine gleichmäßige Suspension in PBS erzeugen. Wir verwenden typischerweise Membranen von 1/100 bis 1/20 der Zellen auf einer 100 mm Schale pro Reaktion gezüchtet abgeleitet. </li><li> Waschen Sie die beschichteten Wells der Microfluor-2 Platte einmal mit 200 ul PBS. Man kühlt die Platte auf Eis vor Zugabe Membransuspension (50 ul pro Vertiefung). </li><li> Echtzeit-Überwachung von Retinol Fluoreszenz gemessen mittels Fluoreszenz Optik des POLARstar Omega (BMG Labtech) mit dem Anregungsfilter 320EX und dem Emissionsfilter 460-10. Das Programm wird auf dem Endpoint-Lesemodus eingestellt. Die Tafel-Modus kann auch verwendet werden, um einen zeitlichen Verlauf gemessen werden, wenn die Zeitintervalle nicht variiert. Das Signal von jedem Zeitpunkt ist der Durchschnitt von 10 Messungen (Orbital Mittelung mit einem Durchmesser von 2 mm) und die Verstärkung bei 1800 gesetzt. Die Platte wird für 10 sec bei 500 UpM mit doppelseitigem orbitalen Schütteln vor jeder Messung geschüttelt. </li><li> Um die Retinol-Release-Assay zu starten, werden die Vertiefungen einmal mit dem Endpoint Lesen m lesenode vor Holo-RBP (typischerweise 1 pM Endkonzentration) bei 0 min zugegeben. Sobald Holo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich alle 5-10 min für 1-3 Stunden überwacht. Um das Retinol Belastung Assay, all-trans-Retinol (typischerweise 1 uM Endkonzentration) gestartet wird den Brunnen unter dim rotes Licht aufgenommen. Die Platte wird einmal vor apo-RBP bei 0 min zugegeben wird gelesen. Sobald apo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich alle 5-10 min für 1-3 Stunden überwacht. </li><li> Nachdem alle Messungen durchgeführt werden, laden Sie die Rohdaten (Beispiel in Abbildung 2 gezeigt) aus dem Omega Data Analysis Software (BMG Labtech) in Microsoft Excel für die Datenanalyse. Jeder Zeitpunkt erzeugt eine Datei, die die Messwerte aller experimentellen Bedingungen enthält. Zum Beispiel, wenn es 20 Zeitpunkte sind, zu festigen 20 Dateien in eine Excel-Datei für die Datenanalyse. </li><li> Zur Datenanalyse, werden die Fluoreszenzsignale vor der Zugabe von Retinol oder Holo-RBP bei 0 min als ein Hintergrundsignaled subtrahiert von den endgültigen Fluoreszenzsignale zu allen Zeitpunkten. Obwohl die Hintergrundsignale niedrig zu Retinol Fluoreszenz in Holo-RBP verglichen werden, Subtrahieren der Hintergrund eliminiert den Einfluss der unspezifischen Lichtstreuung durch die Membranen und macht es möglich, auf der Fluoreszenz von Retinol Holo-RBP oder Retinol hinzugefügt bei 0 min konzentrieren. </li></ol> 3. Echtzeit-Überwachung der Stra6-katalysierten Transport von Retinol Von Holo-RBP um CRBP-I <ol><li> Retinol-EGFP ist eine neue Fluoreszenz-Resonanz-Transfer (FRET)-Paar, das vor kurzem 41 gegründet. Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP an EGFP-CRBP-I wird in Echtzeit durch Messung Retinol-EGFP überwacht FRET. EGFP-CRBP-I-Fusionsprotein mit 6 × His-Tag (EGFP-CRBP-I) in Säugetierzellen hergestellt und wird auf Ni-NTA-Harz vor dem Experiment gereinigt. EGFP-CRBP-I kann in PBS mit Proteaseinhibitoren für eine kurze Zeit bei 4 ° C gelagert Alternativ kann das Fusionsprotein is in 80 ° C in kleinen Aliquots eingefroren. </li><li> Vor den Reaktionen, bereiten eine blockierte Microfluor-2 Platte und Membranen wie oben beschrieben. Waschen der beschichteten Wells der Platte Microfluor-2 einmal mit 200 ul PBS vor der Zugabe von Membransuspension (50 ul pro Vertiefung). </li><li> Real-time Retinol-EGFP FRET gemessen mit POLARstar Omega mit dem Anregungsfilter 320EX und den Emissionsfilter 460-10 und 510-10 mit gleichzeitiger Duell Emissionsfluoreszenz Optik. Das Programm wird auf dem Endpoint-Lesemodus eingestellt. Die Tafel-Modus kann auch verwendet werden, um einen zeitlichen Verlauf gemessen werden, wenn die Zeitintervalle nicht variiert. Das Signal von jedem Zeitpunkt ist der Durchschnitt von 10 Messungen (Orbital Mittelung mit einem Durchmesser von 2 mm) und die Verstärkung bei 1800 pro Kanal. Die Platte wird für 10 sec bei 500 UpM mit doppelseitigem orbitalen Schütteln vor jeder Messung geschüttelt. </li><li> Die Reaktionen, EGFP-CRBP-I (typischerweise 1 pM Endkonzentration) gestartet wird zu den Vertiefungen zugegeben. Die Platte wird auf Lesence mit dem Endpoint-Lesemodus, bevor Holo-RBP wird bei 0 min zugegeben. Sobald Holo-RBP hinzugefügt wird, wird die Reaktion kontinuierlich durch Messung überwacht jeden 5-10 min für 1-2 Stunden. </li><li> Nachdem alle Messungen durchgeführt werden, laden Sie die Rohdaten (Beispiel in Abbildung 3 dargestellt) aus der Omega Data Analysis Software an Microsoft Excel zur Datenanalyse wie oben beschrieben. </li><li> Retinol-EGFP FRET wird durch die dynamische Änderung im Verhältnis der Akzeptor / Donor Emissionspeaks 47 berechnet. Die Gleichung 41, um dieses Verhältnis zu berechnen ist [(510 -510 t b) / (-460 460 t b)], worin T 510, 510 b, 460 t und 460 b repräsentieren Emissionen bei 510 nm nach der Initiierung der Reaktion ( t = Zeitpunkt), wird bei 510 nm vor Retinol oder Holo-RBP zugegeben (b = Hintergrund), bei 460 nm nach der Initiierung der Reaktion (t = Zeitpunkt), und bei 460 nm vor Retinol oder Holo-RBP angefügt (b = Hintergrund), jeweils. </li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir teilen hier eine optimierte RBP Produktion Protokoll, weil RBP Produktion und Reinigung Verfahren kritisch zu generieren korrekt gefaltet RBP sind. Angesichts der Möglichkeit von falsch gefalteten Spezies RBP und das Vorhandensein von Spurenmengen von bakteriellen Proteinen, auch bei HPLC gereinigten RBP bakteriell gebildete, ist es hilfreich zu nativem RBP aus Serum zu verwenden, um eine Aussage bezüglich RBP bestätigen. Urin RBP, welches kommerziell erhältlich ist, ist ein komplexes Gemisch von vielen Arten vo...

Vitamin A ist ein organisches Molekül, das essentiell für das Überleben der Menschheit und das reibungslose Funktionieren fast aller menschlichen Organen. Vitamin A-Derivate (Retinoide) in verschiedenen biochemischen und zellulären Ereignisse, einschließlich der Erfassung von Licht zum Sehen 1,2 und der Regulation der Genexpression und Proteintranslation während der Embryonalentwicklung und in adulten Geweben 3-6 teilzunehmen. Obwohl Retinol hat die Fähigkeit, systemisch diffundieren, kam Evolution mit Plasma Retinol bindendes Protein, ein spezifischer Trägerprotein für Vitamin A im Blut eine hohe Effizienz und Spezifität zu erreichen und Toxizität mit zufälligen Diffusion 7-10 einhergehen, zu vermeiden. Ein Rezeptor mit hoher Affinität, die RBP bindet und nimmt Vitamin A wurde in den 1970er Jahren 11-13 vermutet. Trotz Beweise in drei Jahrzehnten von der Existenz des RBP-Rezeptor 14-31 angesammelt, wurde der Rezeptor-Hypothese seit vielen Jahren aufgrund der existenc diskutierte einer falschen Definition von Holo-RBP. Die korrekte Definition von Holo-RBP ist, dass es die hohe Affinität 1:1-Komplex aus Retinol und RBP ist. Wiederholte Extraktion von Holo-RBP durch organische Lösungsmittel ist notwendig, um apo-RBP produzieren. Diese Definition wird von fast allen Labors studieren RBP 7,9,32-35 oder die RBP-Rezeptor 14-31,36-42 verwendet. Die falsche Definition von Holo-RBP, die verwendet werden, um die Existenz der RBP-Rezeptor zu widerlegen wurde, ist die akute Mischung aus freien Retinol mit apo-RBP. Da die Funktion des Rezeptors in RBP Vitamin A Aufnahme von Holo-RBP ist Retinol von Holo-RBP freisetzen würde die RBP-Rezeptor keine Rolle spielen, wenn Retinol Aufnahme Retinol frei zu beginnen (wie durch die falsche Definition von Holo vorgeschlagen -RBP). Die jüngste Identifizierung von RBP Rezeptors als multitransmembrane Domain Protein namens STRA636 und seine Funktion in Vitamin A-Aufnahme von Holo-RBP 36-43 dringend spricht gegen die Hypothese, dass RBP nichtbenötigen einen Rezeptor an Vitamin A. Detaillierte Analysen zeigten, dass Stra6 9 Transmembrandomänen mit dem N-Terminus extrazellulär lokalisiert und C-Terminus lokalisiert intrazellulär 40 weist liefern. Das zwischen Transmembran 6 und 7 ist ein wesentlicher RBP Bindungsdomäne 39. Stra6 ist sowohl LRAT und CRBP-I in Vitamin A-Aufnahme von Holo-RBP verbunden, aber weder LRAT noch CRBP-I ist absolut für eine verbesserte Stra6 Aktivität 41 erforderlich. Stra6 Fähigkeit zu Retinol Release von Holo-RBP katalysieren ist der Schlüssel zu ihrer Vitamin-A-Aufnahme-Aktivität 41. Durch das Abstützen auf Stra6 seiner Retinol freisetzen kann Vitamin A Lieferung durch RBP transportieren Vitamin A, um Zellen in den peripheren Geweben mit hoher Spezifität und Effizienz zielen. Die kritische Bedeutung des Holo-RBP Definition und Vorbereitung wird nicht nur durch die historische Debatte über die Existenz der RBP-Rezeptor dargestellt, sondern auch durch drei verwandten letzten Papiere auf Holo-RBP Definitionen dif Basisschiedenen von der ursprünglichen und korrekte Definition 44-46. Das erste Papier verwendet den Holo-RBP-Definition, die verwendet werden, um die Existenz der RBP-Rezeptor zur Untersuchung der RBP-Rezeptor 44 missbilligen wurde. Die zweite und dritte Papieren kam mit einer dritten Definition von Holo-RBP daß sie noch weniger wahrscheinlich Retinol untersucht werden, um eine ordnungsgemäße Anlage mit RBP 45,46 bilden. Diese Studien vorbereitet 3 H-retinol/RBP durch Mischen Holo-RBP (auch nicht apo-RBP) mit 3 H-Retinol. Da dieser Test nicht über 3 H-retinol/RBP gebildet und entfernte nicht übermäßigen freien 3 H-Retinol 45,46, es ist nicht ein Assay für 3 H-Aufnahme aus Retinol 3 H-retinol/RBP, sondern eine freie 3 H-Retinol Diffusionsassay. Es wurde zuvor daß Stra6 verbessert nicht zelluläre Aufnahme von Retinol frei von LRAT 38 oder CRBP-I 41 gezeigt. Praktisch alle Retinol zwangsläufig im Blut RBP und es keinen nachweisbaren free Retinol. Eine Hauptfunktion des RBP Rezeptor zu Retinol Release von Holo-RBP katalysieren während Retinol-Aufnahme von Holo-RBP 41. Wenn das Retinol künstlich freigesetzt wird oder in der freien Form mit 45,46 beginnen, wird die RBP-Rezeptor nicht erforderlich. Die drastisch unterschiedliche Ergebnisse aus der freien Retinol Diffusionsassay erhalten, um Tests auf richtig vorbereiteten Holo-RBP zeigen, dass die richtige Zubereitung von RBP Basis gegenüber ist entscheidend für seine funktionellen Assays. RBP kann aus menschlichem Serum 41 gereinigt werden, aber das Verfahren ist aufwendig, und die Ausbeute ist gering. Ein alternativer Ansatz ist die RBP in E. produzieren coli. Weil E. coli nicht in der Lage, richtig zu falten Säuger sezernierten Proteinen mit mehr als einem Paar von Disulfidbindungen wie RBP, ist es wesentlich, refold Rbp und reinigen das korrekt gefaltete Protein. Falsch gefaltete Proteine ​​nicht nur anders korrigiert gefalteten RBP in verschiedenen Tests verhalten,aber auch dazu führen, Proteinaggregation während der Lagerung. Aus dem gleichen Grund wird apo-RBP nur aus hochwertigem Holo-RBP hergestellt. Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll zur Herstellung von hochwertigen RBP 100% mit Retinol durch bakterielle Expression, Rückfaltung und HPLC-Reinigung geladen. HPLC-Reinigung entfernt nicht nur falsch gefaltete RBP aber auch erhebliche bakterielle Kontamination, die schwere Artefakte verursachen kann, wenn RBP in der Signaltransduktion Assays verwendet wird. Wir beschreiben auch zwei empfindliche Echtzeit-Monitoring-Techniken zu Retinol Transport per Stra6 studieren. Beide Techniken sind abhängig von hoher Qualität RBP. Aus Platzgründen werden die klassischen Techniken der radioaktiven Retinoid-basierten und HPLC-basierte Vitamin-A-Aufnahme-Assays werden hier nicht beschrieben.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Guanidinhydrochlorid </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> Cystin </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> Cystein </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fischer </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Fischer </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> Retinol </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Fischer </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fischer </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazol </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> Heptan </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker Casein </td><td> Durchstechen </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 Konzentrator (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 Platte </td><td> Fischer </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze Gasdichte # 1710 </td><td> Fischer </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time analyses of retinol transport by the membrane receptor of plasma retinol binding protein

Vitamin A ist für das Sehen wichtig und das Wachstum / Differenzierung von fast allen menschlichen Organen. Plasma Retinol bindendes Protein (RBP) ist das Prinzip und spezielle Träger von Vitamin A im Blut. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Holo-RBP und zwei Echtzeitüberwachung Techniken, um den Transport von Vitamin A durch den hochaffinen Rezeptor RBP Stra6 studieren. Die erste Technik ist es möglich, eine große Menge an qualitativ hochwertigen Holo-RBP (100% mit Retinol-loaded) für Vitamin A Transport-Assays zu erzeugen. Hochwertige RBP ist essentiell für funktionelle Assays, weil fehlgefaltete RBP Versionen Vitamin A leicht und bakterielle Kontamination in RBP Vorbereitung kann Artefakte verursachen. Echtzeit-Überwachung Techniken wie Elektrophysiologie wurden kritische Beiträge zu den Untersuchungen von Membran-Transport gemacht. Die RBP rezeptorvermittelte Retinol Transport nicht in Echtzeit bis vor kurzem wurden analysiert. Der zweite hier beschriebene Technik ist der Grundl-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Freisetzung oder loading. Die dritte Technik ist die Echtzeit-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP, um zelluläre Retinol bindendes Protein I (CRBP-I). Diese Techniken bieten eine hohe Empfindlichkeit und Auflösung bei der Aufdeckung RBP Rezeptors Vitamin A-Aufnahme-Mechanismus.

Wir stellen Ihnen hier repräsentative Ergebnisse für Holo-RBP Produktion und Reinigung durch HPLC (Abbildung 1), Echtzeit-Analyse von Stra6-katalysierten Retinol Release von Holo-RBP und Retinol Laden in apo-RBP (Abbildung 2) und Echtzeit-Analyse Stra6-katalysierten Retinol Transport von Holo-RBP an EGFP-CRBP-I (Abbildung 3). Ohne Rückfaltung, hergestellt RBP in Bakterien fast vollständig fehlgefaltete aufgrund der Anwesenheit von vielen...

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Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Hier beschreiben wir eine optimierte Technik zur hochwertigen Vitamin A / RBP komplex und zwei Echtzeit-Monitoring-Techniken zu studieren Vitamin-A-Transport durch Stra6 die RBP-Rezeptor produzieren.

Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Hier beschreiben wir eine optimierte Technik zur hochwertigen Vitamin A / RBP komplex und zwei Echtzeit-Monitoring-Techniken zu studieren Vitamin-A-Transport durch Stra6 die RBP-Rezeptor produzieren.

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Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Forschung

Biologie

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Biochemische Rekonstitution der Steroid-Rezeptor • Hsp90-Protein-Komplexen und Reaktivierung der Ligandenbindung

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Autonom Bioluminescent Säugerzellen für die kontinuierliche und Echtzeit-Überwachung von Zytotoxizität

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Echtzeit-Messungen von Membranprotein: Rezeptor-Wechselwirkungen Mit Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...