We thank Lynette Henkel for her excellent support in performing the flow cytometric analysis. We thank Dr. Don Weldon and Dr. Victor Koong (Temecula, CA) for critical reading of the manuscript and helpful comments. This work was supported by grants from the German Research Foundation, KR-3770-7/1 and KR-3770-9/1 (M. K.), the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung, F/37/11 (M. K.), Dr. Rusche Research Grant 2014 from the Deutsche Stiftung f&#252;r Herzforschung and Deutsche Gesellschaft f&#252;r Thorax-, Herz- und Gef&#228;sschirurgie (M.-A. D.), and the Deutsches Zentrum f&#252;r Herz- und Kreislaufforschung S&#228;ule B Projekt, DZHK B 13-050A and DZHK B 14-013SE (M. K.).

1. Herstellung von Medien, Reagenzien und Zellkulturbedingungen <ol><li> Menschliche HEK 293 embryonale Nierenzellen <ol><li> Kultur HEK-293-Zellen (CRL-1573 ATCC) in DMEM / Ham F-12-Medium mit 5% FCS, L-Glutamin (2 mM) und Penicillin (100 U / ml) / Streptomycin (100 ug / ml) ergänzt. </li><li> Um den Durchgang der Zellen, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, fügen 0,05% Trypsin / EDTA und Inkubation für 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Transfer Zellen in eine 15-ml-Tube, Zentrifuge für 5 min bei 1200 UpM (300 × g) und übertragen Sie etwa 5x10 5 Zellen in ein frisches T25 Kulturflasche. </li></ol></li><li> Murinen embryonalen Fibroblasten (MEFs) <ol><li> 1 ml einer 0,1% igen Gelatinelösung, um einzelne 6-Vertiefungen und Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für 1 Stunde. Flüssigkeitsaufnahme und lagern bei RT bis zur Verwendung. </li><li> Kultur MEFs in DMEM, ergänzt mit 10% FCS, L-Glutamin (2 mM), L-Glucose (4,5 g / l), Natriumpyruvat (1 mM) und Penicillin (100 U /ml) / Streptomycin (100 ug / ml) auf Gelatine-beschichteten 6-Well-Platten. </li><li> Verteilen MEFs in 6-Well-Platten und lassen Sie sie bis zur Konfluenz wachsen. Hinzufügen Mitomycin (5 ug / ml) für 2,5 h auf Zellen arretieren. Absaugen Medium, waschen Sie die Zellen zweimal mit kompletten MEF Medium und 3 ml MEF Medium zu jedem 6-well. Diese Zellen dienen als Feeder-Schicht für Maus und Schwein iPS-Zellen. </li></ol></li><li> Kultur von Maus-ES und iPS-Zellen <ol><li> Maus-ES-Kulturmedium herzustellen, zu ergänzen DMEM-Medium mit 15% FCS, L-Glutamin (2 mM), L-Glucose (4,5 g / l), MEM nicht-essentiellen Aminosäuren (1X), β-Mercaptoethanol (0,1 mM) und Leukämie-Hemmfaktor (1,000 U / ml). </li><li> Spülen Sie 6-Wells mit Wachstum verhaftet MEFs einmal mit serumfreiem DMEM, 2 ml Maus-ES-Mediums und Maus-iPS-Zellen (20% der Zellen einer konfluenten Schale). Jeden Tag Wasch Zellen einmal mit serumfreiem DMEM und 2 ml frischem Maus-ES-Medium. </li><li> Um den Durchgang der Zellen, waschen Sie jedes Well einmal mit serumfreiem DMEM, fügen 00,25% Trypsin / EDTA und Inkubation für 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Übertragungszellen in einen 15-ml-Röhrchen, Zentrifuge 5 min bei 1200 rpm (300 x g), Die Zellen in 500 &amp; mgr; l Maus-ES-Medium und Zugabe von 100 ul der Suspension auf 2 ml Maus-ES-Medium in eine frische 6 Vertiefungen mit einer MEF Feeder-Schicht. </li></ol></li><li> Kultur von Schweine iPS-Zellen <ol><li> Schweine iPS Medium herzustellen, ergänzen DMEM / Ham-F-12-Medium mit 20% KO Serum, L-Glutamin (2 mM), MEM nicht-essentiellen Aminosäuren (1x), β-Mercaptoethanol (0,1 mm), und Penicillin (100 U / ml) / Streptomycin (100 ug / ml). Man filtriert durch ein 0,22 um Filter und bei 4 ° C für 2 bis 3 Wochen. Bei der ersten Verwendung, fügen bFGF (10 ng / ml Endkonzentration). </li><li> Spülen Sie 6-Wells mit Wachstum verhaftet MEFs einmal mit serumfreiem DMEM / Ham-F-12 und 1,5 ml Schweine iPS mittleren und Schweine-iPS-Zellen (10% der Zellen einer konfluenten Schale). Jeden Tag Wasch Zellen einmal mit serumfreiem DMEM / Ham-F-12 und 1,5 ml frisches Schweinefleisch iPS Medium. </li><li> Zur Vorbereitung Dissoziationspuffer hinzuzufügen 2,5% Trypsin, Collagenase IV (10 mg / ml), K.-o.-Serum (20%) und CaCl 2 (1 mM), um Ca 2+ -freier PBS. Wasche die Zellen zweimal mit PBS und Inkubation mit Dissoziationspuffer für 5 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Übertragungszellen in einen 15-ml-Röhrchen, Zentrifuge 5 min bei 1200 rpm (300 x g). </li><li> Resuspendieren Schweine iPS-Zellen in 500 ul frischem Schweinefleisch iPS Medium und 50 &amp; mgr; l der Suspension auf 1,5 ml Schweine iPS-Medium in einem frischen 6 Vertiefungen mit einer MEF Feeder-Schicht. Jeden Tag Wasch Zellen einmal mit serumfreiem DMEM / Ham-F-12 und 1,5 ml frisches Schweinefleisch iPS Medium. </li></ol></li><li> Feeder-freie Kultur des menschlichen iPS-Zellen <ol><li> Auftauen Originalflasche, die die Basalmembran der Zubereitung bei 4 ° C und verdünnt mit eiskaltem Serum-freiem DMEM / Ham-F-12 auf 8 mg / ml, aliquoten und bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Tauwetter ein Aliquot der Basisment Membranpräparation bei 4 ° C und mit eiskaltem Serum-freiem DMEM / Ham-F12 (90 ug / ml) zu verdünnen. Pipette 1 ml dieser Lösung wird in 3 cm Kulturschalen und gut mischen, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Siegel Gerichte mit Parafilm und bei 4 ° C bis zu einer Woche. Vor der Verwendung für die Zellkultur inkubiert Geschirr für 30 min bei 37 ° C oder 3 Stunden bei Raumtemperatur, um eine Polymerisation der Basalmembran Herstellung ermöglichen. </li><li> Saugen Sie Medium aus Gerichten mit der Basalmembran Zubereitung beschichtet und waschen zweimal mit serumfreiem DMEM / Ham-F-12. 1,5 ml E8 Medium in die Kulturschale und Human iPS (10% der Zellen einer konfluenten Schale). Jeden Tag Wasch Zellen einmal mit serumfreiem DMEM / Ham-F-12 und 1,5 ml frisches Medium E8. </li><li> Um den Durchgang der Zellen, spülen Geschirr zweimal mit PBS und 1 ml PBS / 0,5 mM EDTA. Das Geschirr Inkubation für 5 min bei RT. Überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Hinweis: Wenn die Kolonien beginnen, runden und appear, um Löcher, die sie für die Übertragung bereit sind zu haben. </li><li> Saugen Sie die Flüssigkeit, fügen Sie 1,5 ml E8 Medium und nehmen Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren. Übertragungszellen in ein 15 ml-Röhrchen, Zentrifuge 5 min bei 1200 rpm (300 x g), resuspendieren in 500 &amp; mgr; E8 Medium und 50 ul der Suspension zu 1,5 ml E8 Medium in einem frischen Kulturschale mit der Basalmembran Zubereitung beschichtet . </li></ol></li></ol> 2. Design von Target-Sequenzen über Artgrenzen Borders <ol><li> Auswählen des Referenz Menschen, Mäusen und Schweinen cDNA-Sequenzen der Zielgene (GAPDH, NANOG, GDF3) und führen eine CLUSTAL Multisequenz-Alignment-Analyse. Hinweis: Dadurch werden die homologen Sequenzen zwischen den Arten anzugeben. <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für mehrere Ausrichtung: Lückenstrafe (fest) 10, Lückenstrafe (unterschiedlichen) 5, Übergangsgewichtung 0, Spalttrennung Strafe Bereich 8% Identität für die Verzögerung 40, um eine maximale Anzahl von Iterationen durchzuführen 3. </li></ol></li><li> Senden gewünschten Zielsequenzen an den Hersteller (siehe Tabelle der Materialien) für die Sonden Konstruktion und Fertigung. Hinweis: Der Hersteller bestätigt dann die Kompatibilität der gewünschten mit der Technologie-Sequenz. Falls gewünscht Sequenz nicht kompatibel ist, wird der Hersteller alternativer Sequenzen vor. <ol><li> Sicherzustellen, dass die homologen Regionen, die verwendet werden können als potentielle Abfangstrang Sequenzen eine Länge von 27 bp. Anmerkung: Es ist ratsam, mehrere Nanoteilchen mit unterschiedlichen Abfangstränge für eine ausgewählte Zielgens zu bestellen als nur der Real zellulären Experiment wird ein definitiver Beweis der Funktionsfähigkeit einer einzelnen Sequenz zu ergeben. Daher wurden zwei verschiedene Sequenzen für GAPDH und GDF3 ausgewertet, während drei verschiedene Nanopartikel wurden getestet, um NANOG Ausdruck auszuwerten. Ihre Lage und die genauen Sequenzen wurden an anderer Stelle 17 erschienen. Der Hersteller kommerziell produziert die NanOpGegenstände mit gewünschten Sequenzen und stellt sie in lyophilisierter Format. </li></ol></li></ol> 3. Rekonstitution der Nanopartikel und Zusatz Zellkulturen <ol><li> Speichern lyophilisierten Nanopartikel nach Eingang bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Rekonstituieren Nanopartikel durch Zugabe von 50 &amp; mgr; l doppelt destilliertes Wasser, das eine Endkonzentration von 100 nM ergibt. Nach der Rekonstitution store Nanopartikel bei RT im Dunkeln. Anmerkung: Unter dieser Bedingung sie für mindestens ein Jahr stabil sind. Lagerung der rekonstituierten Proben bei 4 ° C kann sich negativ auf die Stabilität. </li><li> Pre-Verdünnung des Nanopartikels Stammlösung mit PBS auf eine Konzentration von 2 (HEK 293-Zellen) oder 8 nM (iPS und ES-Zellen) am Tag der Anwendung. Anmerkung: Diese Konzentration ist 20-fach höher als die Endkonzentration in der Kulturschale. In ES-Zellen und iPS-Zellen, 400 pM von Nanopartikeln induziert ein Fluoreszenzsignal unter dem Mikroskop leicht nachweisbar. Für HEK 293 Zellen, acONZENTRATION von 100 pM ist ausreichend. </li><li> Pipette 12,5 ul vorverdünnt Nanopartikel zu einer 24-Well enthält 237,5 ul vollständigen Zellkulturmedium. Für Brunnen in verschiedenen Größen, passen die Volumina. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Nanopartikel zu gewährleisten. Die Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre über Nacht inkubieren (O / N) bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag analysiert Zellkulturen zur genspezifischen Cy3-Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 546 nm (Emission 575 - 640 nm) unter einem Fluoreszenzmikroskop. Der benötigte, um eine ausreichend starke Fluoreszenz zu erhalten, können auf dem Zelltyp und dem Zielgen abhängen Periode. In diesen Experimenten wurde diese zwischen 16 und 20 Stunden nach der Anwendung der Sonde gesehen. </li></ol> 4. Bezeichnung des Cy3 Positive Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Wachsen HEK 293 oder Maus-ES-Zellen unter Verwendung der Bedingungen in Abschnitt 1.1 oder 1.3 angegeben, respectively. Einen Tag vor der FACS-Analyse hinzuzufügen GAPDH-spezifischen Nanopartikel in unterschiedlichen Konzentrationen an HEK 293-Zellen (siehe 6A) und bei 400 pM bis ES-Zellen murinen. Die Zellen O / N in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Analyse von Zellkulturen für die genspezifische Cy3 induzierte Fluoreszenz unter einem Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Trennen HEK 293 Zellen, wie unter Punkt 1.1.2 angegeben. Zentrifuge, übertragen in 200 ul eiskaltem PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA (FACS-Puffer) in ein 1,5-ml-Tube und resuspendieren. Halten Zellen Dunkeln auf Eis, bis Durchflusszytometrieanalyse. </li><li> Trennen murine ES-Zellen, wie unter Punkt 1.3.3 angegeben. Zentrifuge, Transfer in ein 1,5-ml-Tube und resuspendieren in 200 ul eiskaltem PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA. Halten Zellen Dunkeln auf Eis, bis Durchflusszytometrieanalyse. </li><li> Drücken Sie die Zellen durch ein 30 um-Filter, um die Zellaggregation zu verhindern und fügen Propidiumiodid (2 ug / ml Endkonzentration) 2 minvor der FACS-Analyse, um tote Zellen auszuschließen. </li><li> Um Cy3-positiven Zellen ersten Hierarchie Tore auf dem FSC-A / SSC-eine Teilmenge eingestellt zu analysieren, die FSC-H / FSC-W-Untergruppe und die SSC-H / SSC-W Teilmenge. Verwenden Sie die Vorwärts- und die Seitenstreuung, um Zelltrümmer und Zellen, die nicht zerstreut sind auszuschließen. Ausschließen toten Zellen durch ihre Propidiumiodidfärbung Anzeige von PE gegen PE-Texas Red. Führen Sie die abschließenden Sortier Tor auf Cy3-PE-positiven Zellen (Abbildung 4). </li></ol>

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HL hat die Nanopartikel aus EMD Millipore Corporation erhalten kostenlos. Alle anderen Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nanoteilchen, welche die sichere Auswertung der intrazellulären Genexpression direkt in lebenden Zellen aus verschiedenen Säugetierarten mit diversen histogenetischen Herkunft unter einem Fluoreszenzmikroskop ermöglichen. Dieser Ansatz hat eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu anderen veröffentlichten Verfahren. Zunächst der Forscher nicht in Bezug auf entweder das Zielgen oder Zelltyp beschränkt. Alle Antikörper-basierten Nachweisverfahren sind auf ein einzelnes Epitop beschränkt. Obwohl fluoreszierende molekulare Signale können auch für ein breites Spektrum von Genen entwickelt werden, erfordert dieses Verfahren die Dissoziation der Zellen und anschließende Nukleofektion 15. Im Gegensatz dazu wird die Anwendung der genspezifischen Nanopartikel keine Manipulation der Zielzelle, die die Nanopartikel aktiv von Endozytose verschlingt erforderlich. Während der anschließenden Passage der Goldteilchen nach verlassen der Zellen, und die Kultur kann in downstrea verwendet werdenm Experimenten. Dennoch hat auch die Technologie immer noch einige Einschränkungen. Einige Marker sind offensichtlich nicht nachweisbar aufgrund ihrer Kohlenhydrat Natur wie SSEA-1 oder TRA-1-81 20. Derzeit ist eine große Anordnung von Nanopartikeln im Handel erhältlich. Diese Teilchen wurden für ihre Funktionalität in zellulären Experimenten vorgetestet worden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, kundenspezifische Sonden, die über Artgrenzen Grenzen verwendet werden können, zu entwickeln. Wenn nach einem solchen Annäherung oder beim Entwerfen einer Sonde für ein neues Ziel-Gen hat man sich bewusst sein, dass die Funktionalität eines in silico vorhergesagten Sonde muss sorgfältig in vitro untersucht werden können. Die NANOG-SF3 Sonde, die eine 100% Homologie zu der Sequenzhomologie zeigten überhaupt nicht arbeiten, während NANOG-SF1 mit einem fehlgepaarten Basen im murinen und Schweine-Sequenz erzeugt einen schönen Fluoreszenzsignal. Eine andere Frage bezieht sich auf die effiziente Aufnahme der Nanopartikel. Die Partikel gebendie Zellen durch Endozytose ein Verfahren, das durch die Größe der Nanopartikel 21 beeinflusst, wird der Zelltyp und der Differenzierungsstatus 22 und die zelluläre Fähigkeit zum phago- zuführen und Makropinozytose 23. Die optimale Konzentration, eine befriedigende Fluoreszenzsignal zu erhalten, muss für jede einzelne Anwendung oder Zelllinie getestet werden. Zu diesem Zweck sollte das erste Experiment immer die Anwendung der Aufnahmesteuerung, die Kompatibilität der Sonden innerhalb der Zelltypen und Kulturbedingungen, bevor sie zu Ziel-spezifischen Nachweis von Genexpression zu bewerten. Ein kritischer Punkt, um zuverlässige Ergebnisse bei der Anwendung dieses Protokolls auf eine neue Zelllinie oder Zellpopulation ist die Einbeziehung von geeigneten Kontrollen zu erhalten. Die immer fluoreszierende Aufnahme Kontrolle zeigt einen Hinweis, welche Konzentrationen von Nanopartikeln wird eine ausreichende Fluoreszenzsignal in der Zielzellpopulation zu induzieren. Die Fluoreszenz zu bewerten müssend am nächsten Tag wie das Signal wird mit der Zeit 17 verblassen. Gleichzeitig die Verschlüsselungssteuerung ohne ein Gegenstück in der eukaryontischen Genom an einer gleichen Konzentration aufgetragen muß eine vernachlässigbare Hintergrundsignal hervorzurufen. Als dritte Steuer ist es ratsam, ein Nanopartikel spezifisch für ein Housekeeping-Gen (zB GAPDH, β-Actin) zu verwenden. Diese Nanopartikel dienen als positive Kontrolle, dass der Ansatz kann verwendet werden, um spezifische Gen-Expression in den ausgewählten Zielzellpopulation zu detektieren. Wenn diese Kontrollen drehen zufrieden kann man erwarten, zuverlässige spezifische Fluoreszenzsignale unter Verwendung spezifisch für andere Zielgene Nanopartikeln erhalten. Die Konzentration der verwendeten Nanopartikel können ebenfalls kritisch sein, da sie gezeigt haben, herunterregulieren die Zielsequenz 24. Dieser Effekt erfordert jedoch viel höhere Konzentrationen (5 nM) als die in den hier beschriebenen Experimenten (400 pM) dargestellt verwendeten Konzentrationen. Bei dieser Konzentration die nanoflares nicht beeinträchtigen Zielgen-mRNA oder Proteinniveaus und hohen Konzentrationen von 2 nM die Proliferation von HEK293 und murine ES-Zellen 17 nicht beeinträchtigen. Darüber hinaus fand eine ganze Genom-Expressionsanalyse zeigen keine signifikanten Veränderungen in der Genexpression 25. Daher bei Konzentrationen bis zu 1 nM die nanoflares sollte nicht zeigen alle wichtigen Nebenwirkungen. Eine sehr vielversprechende Anwendung dieser Technologie ist die Möglichkeit, eine gegebene Zellpopulation, welche von einem spezifischen Gen markiert ist etikettieren. In jüngerer Zeit wurden genspezifische Nanopartikel erfolgreich verwendet worden, um selektiv färben Live ventrikulären Myozyten 26, Subpopulationen von Melanomzellen 27, Monozyten 28 und Kleinhirnzellkulturen 29. Solche fluoreszenzmarkierten Zellpopulationen können sortiert und mittels Durchflusszytometrie als lebende Zellen gereinigt werden. In der Onkologie ist es vorstellbar, Live-metastatischen Tumorzellen in Tiermodellen zu isolierenauf der Basis ihrer Expression von CEA, für die Suche nach potentiellen Metastasen fördernde Gene oder Zielstrukturen wertvollsten. Wir haben kürzlich gezeigt, dass tatsächlich umprogrammiert murine iPS Kolonien können in situ mit Nanog -spezifischen Nanopartikel auf der Basis der detektierten Fluoreszenzintensität 17 identifiziert werden. Daher könnte die Identifikation der wirklich neu programmiert iPS Kolonien auf Hochdurchsatz-Plattformen, die Roboter-Fluoreszenzdetektion und Kommissionierung Geräte verwenden, um die vielversprechendsten Kolonien zu identifizieren durchgeführt werden. Diese Technologie scheint geeignet zu sein, in vielen Forschungsbereichen, um spezifische zelluläre Subpopulationen wählen und es scheint möglich, die Nanopartikel in Hochdurchsatz-Plattformen gelten. Zusammenfassend stellt dieses Protokoll einen neuartigen Ansatz unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Nanopartikel, die den Nachweis von intrazellulären Genexpression direkt in lebenden Zellen ermöglicht. Diese Technologie kann ein wertvolles Instrument, um zu reinigen, ausbauen und weitere Zeichen seinize seltenen Zellpopulationen in vielen Forschungsbereichen.

Im Jahr 2006 wurde ein neuer Ansatz beschrieben somatischen Zellen in einem pluripotenten Zustand neu zu programmieren. Vorabsiebung einer Anordnung von potentiellen Reprogrammierungsfaktoren murine Fibroblasten konnten sogenannte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), die durch retrovirale Transduktion und die Überexpression von vier Transkriptionsfaktoren erfolgreich umgewandelt werden (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Anschließend wurde diese Technik effektiv mit somatischen Zellen von verschiedenen Säugetierspezies, einschließlich Menschen, 2, 3 Affen, Ratten, 4, 5 Hunde, Schafe und Schweine 6 7 reproduziert worden. Darüber hinaus modifiziert Protokolle Weglassen oder Austausch des potentiell onkogenen Transkriptionsfaktor c-myc veröffentlicht wurden 8, 9. Unabhängig von der Anfangs Umprogrammierung Ansatz die wahre Pluripotenz der wachsenden Kolonien muss bestätigt werden, eine mühsame und zeitraubende Aufgabe. Ein Hauptnachteilder Mehrheit dieser Analysen ist, dass sie nicht an lebenden Zellen durchgeführt werden. Etabliert Pluripotenz Faktoren wie OCT4, SOX2, NANOG oder REX1 repräsentieren Transkriptionsfaktoren im Zellkern befindet und deren Nachweis erfordert Fixierung der Zellen vor der für die RT-PCR-Analyse 10 Immunhistochemie oder Zelllyse. - 12 Danach werden diese Zellen für die Zukunft verloren Experimente Replika-Kulturen jeder Kolonie erforderlich ist. Somit ist eine Technologie zur Pluripotenz an lebenden Zellen analysieren, sehr wünschenswert. Verschiedene Ansätze können in der Tat direkt an lebenden Zellen unter Verwendung von Antikörpern, die gegen membranbasierten Antigene durchgeführt werden (z. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluoreszierende Farbstoffe berichtet an alkalische Phosphatase 13 oder kleine Moleküle, die spezifisch zu markieren embryonale Stammzellen zu erkennen (ES) und iPS-Zellen 14. Allerdings könnten die Antikörper dennoch negativ auf die Zellen und jede Method auf eine einzige Pluripotenz Marker beschränkt. Schließlich Fluoreszenz Molecular Beacons, Dual-Antisense-Oligonukleotide mit Haarnadelstrukturen, die Live-Färbung von Zellen zu ermöglichen, wurden beschrieben, 15. Obwohl dieser Ansatz für viele Gene angewendet werden, erfordert die Technik Nukleofektion einer Einzelzellsuspension, die nicht für wachsende iPS Kolonien. Ein paar Jahre her Gen-spezifischen Nanopartikel wurden beschrieben, um Survivin Expression in menschlichen SKBR3 Brustkrebszellen 16 zu analysieren. Diese Handschrift beschreibt ein neues innovatives Konzept für die Erfassung Pluripotenzmarker in Live-ES und iPS-Zellen durch die Verwendung von Gold-Nanopartikel-Konjugate. Diese Nanopartikel bestehen aus einer zentralen Goldpartikel mit einem gekoppelten Abfangstrang Durchführung der komplementären RNA-Sequenz und ein Cy3-markiertem Reporterstrang. Das Fluoreszenzsignal des Reporterstrang wird von der zentralen Goldpartikel abgeschreckt. Darüber hinaus empfiehltNanopartikel dienen als negative und positive Kontrollen, bzw. (Abbildung 1). Für eine Anwendung, die Nanopartikel sind einfach zu dem Kulturmedium (Abbildung 2) aufgenommen und in die Zellen über Endozytose (Abbildung 3). Wenn die Ziel-RNA exprimiert wird, verdrängt es das Reporterstrang, der dann ein Fluoreszenzsignal emittiert. Dieses Verfahren erfordert keine Manipulation der Zielzelle und die Expression des Zielgens kann optisch unter einem Fluoreszenzmikroskop direkt in lebenden Zellen verfolgt werden. Ferner kann die Technik auf jeden gewünschten Ziel-Gens zwischen den Arten bei iPS Zellen angewendet werden, und somit kann in vielen verschiedenen Forschungsgebieten verwendet werden. Schließlich durchflusszytometrischen Analysen ermöglichen die Identifikation und Anreicherung von Cy3-positiven Zellen.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/Ham&#39;s F12 medium with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG4815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with stable glutamine</td>
			<td>Biochrome GmbH</td>
			<td>FG0435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 107 409 001</td>
			<td>prevents cell division of MEFs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor (107 U/ml)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA (1x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>detaches adherent cell cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>supplement for human and porcine iPS cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>growth factor for human and porcine iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td>dissociation of pig iPS cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05940</td>
			<td>defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5 M</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartFlare Probes</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>customized item</td>
			<td>detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine (from porcine skin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6144</td>
			<td>enhances attachment of MEFs to surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (1 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td>labels dead cells in flow cytometric analyses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Aria Illu</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>A4544</td>
			<td>referred to as device 1 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navios</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>775213</td>
			<td>referred to as device 2 in Figure 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FloJo vX 10.0.7r2</td>
			<td>Treestar</td>
			<td></td>
			<td>software for analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of intracellular gene expression in live cells of murine, human and porcine origin using fluorescence-labeled nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

In einem ersten Versuch überprüft und fest der intrazellulären Nachweis spezifischer Genexpression in lebenden Zellen unter Verwendung von Nanopartikeln haben wir beschlossen, Pilotversuche mit einer konstitutiv exprimiert house-keeping-Gen (GAPDH) in der menschlichen HEK 293 Zellen durchzuführen. Die Konzentration der Nanopartikel in diesen Experimenten verwendet wurde entsprechend der Empfehlung des Herstellers gewählt. Die Zugabe eines GAPDH-spezifischen Sonde an das Kulturmedium in einer 100 pM Endkonzentration induziert eine klare Cy3-Fluoreszenz dieser Zellen, die sichtbar unter einem Fluoreszenzmikroskop nach O / N Inkubation (5A) war. Zwei Kontrollen wurden in diesen Experimenten eingeschlossen, um das Ergebnis zu untermauern. Eine Steuer besteht aus einem sogenannten &quot;scramble&quot; Nanopartikel wo der Reporterstrang keinen entsprechenden Sequenz in Säuger- oder eukaryontische Zellen. Der &quot;Wettlauf&quot; Nanopartikel bestimmt die unspezifische Hintergrund fluorescence aufgrund möglicher Sonde Zersetzung oder unvollständige Löschung der Fluoreszenz. Die Zugabe des Scramble-Sonde ergab eine nur geringe Fluoreszenzsignal, was vernachlässigbar ist (5B). Ein fest fluoreszierende &quot;Aufnahme&quot; control hilft, die Fähigkeit der Zellen, um die Nanopartikel durch Endozytose, die zwischen verschiedenen Zelltypen variieren können integrieren bestimmen. Diese positive Kontrolle Partikel produziert ein helles Fluoreszenzsignal in HEK 293 Zellen (5C). Somit wird die Machbarkeit der Technologie, um eine spezifische Fluoreszenzsignal eines intrazellulären Gen mit einem vernachlässigbaren Hintergrundsignal aufgezeichnet wurde bestätigt. Es muss erwähnt werden, dass die Differenz zwischen dem Hintergrundsignal und die spezifische Fluoreszenz mit der Zeit abnimmt. Die Hintergrund erhöht sich durch Zersetzung oder unvollständige Abschrecken zu sondieren, während die spezifische Fluoreszenz verblasst allmählich (5D). Die gleichen GAPDH-spezifischen Nanopartikelwurde in primären Fibroblastenkulturen von Maus, Schwein und Schaf Ursprungs 17 getestet. Diese Zellen erzeugen eine viel höhere Hintergrundsignal als HEK 293-Zellen, während die Ziel-spezifischen Fluoreszenz ziemlich schwach ist, möglicherweise aufgrund der relativ niedrigen proliferative Kapazität dieser Kulturen. Diese Pilotexperimente veranlasste uns, diese Technologie zum Nachweis von Pluripotenz Genexpression in iPS von verschiedenen Spezies ableiten, verwenden. Hierzu NANOG und GDF3 analysiert wurden, die beide dafür bekannt, in pluripotenten Zellen 18 ausgedrückt werden. Auf den ersten iPS-Zellen aus Schwanzspitze Fibroblasten eines Nkx2.5 Herz Enhancer transgene Mauslinie 19 abgeleitet wurden untersucht. Für beide Gene ein starkes Fluoreszenzsignal erhalten wurde (6A) und einer vernachlässigbaren Cy3-Fluoreszenz des Scramble-Kontrolle (Daten nicht gezeigt). Ähnliche Ergebnisse wurden für Mensch und Schwein iPS-Zellen (Abbildung 6 erhaltenB und C). Wichtig ist, dass das Fluoreszenzsignal in der IPS Kolonien beschränkt und nicht die als Feeder-Schicht für Maus und Schwein iPS (siehe Pfeile in Figur 6A und C) verwendeten Fibroblasten etikettieren. Die Analyse NANOG Genexpression zeigte auch, daß nicht jede Sequenz in silico vorhergesagten &quot;gut&quot; ist schließlich zweckmäßig. Eines der drei Ausführungen eines NANOG spezifischen Nanopartikel induziert fast kein Fluoreszenzsignal vergleichbar mit der von der Verschlüsselungssteuer trotz einer 100% Sequenzübereinstimmung in murinen iPS-Zellen (6D). Ein ähnliches Ergebnis wurde auf iPS-Zellen von Mensch und Schwein Ursprungs gewonnen mit dieser Sonde (Daten nicht gezeigt). So können Nanopartikel verwendet werden, um Pluripotenz Genexpression über Artgrenzen Grenzen erkennen, während die Funktionalität jedes einzelnen gestaltet Sonde muss im Voraus beurteilt werden kann. Die vielversprechenden Ergebnisse der in situKennzeichnung von lebenden Zellen in Zellkulturschalen veranlasste uns, die Genexpression quantitativ mittels Durchflusszytometrie analysiert. Zu diesem Zweck wurden GAPDH -spezifischen Nanopartikeln an abgestuften Konzentrationen zugesetzt, um 293 Monoschichten, um die Markierungseffizienz innerhalb der Zielzellpopulation zu vergleichen HEK. Wie durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt eine erweiterte Cy3-induzierte Fluoreszenz wurde mit der geringsten Konzentration, verglichen mit Zellen, die die Nanopartikel nicht erhalten gesehen. Ansteigende Konzentrationen der Nanopartikel induziert eine deutlich konzentrationsabhängigen Fluoreszenz von HEK 293-Zellen in situ (7A). Aussetzen dieser Zellen zu einer durchflusszytometrischen Analyse bestätigte die konzentrationsabhängige Markierungseffizienz. Die Frequenz des Cy3-positiven Zellen deutlich erhöht (mehr als das Siebenfache), wenn die höchste Konzentration von Nanopartikeln aufgebracht werden (7B). In weiteren Experimenten ES-Zellen aus dem Nkx2.5 HerzEnhancer transgene Mauslinie 19 wurden verwendet, um die Expression von Genen Pluripotenz durch Durchflusszytometrie analysiert. Pilotversuche mit 400 pM der positiven Aufnahme Kontrolle ergab eindeutig Cy3 positive Live-ES-Kolonien unter dem Mikroskop und Durchflusszytometrie erfasst fast 40% der Cy3-positiven Zellen (7C). Dagegen vergleichbare unbehandelte Zellen etwa 0,1% der Zellen, die mit dem Scramble-positiv gefärbt behandelt wurden (Daten nicht gezeigt). Ebenso ist der Zusatz von speziellen für GAPDH Nanog und GdF3 Nanopartikel induziert einen deutlichen Fluoreszenzsignals in einzelne Kolonien in der Zellkulturschale. Die Frequenz des Cy3-positive Zellen für GAPDH, wie durch Durchflusszytometrie bestimmt war vergleichbar mit jener für beide Pluripotenz Gene (7C) zu sehen. Dieses Ergebnis ist zu erwarten, wie Nanog und GdF3 sollen auch der konstitutiv in pluripotenten ES-Zellen exprimiert werden. Somit können diese Daten eindeutig indihin, dass Zellen, die ein bestimmtes Gen exprimieren, können durch durchflusszytometrische Analysen identifiziert werden, qualitativ und durch ihre relative Menge. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Struktur der Nanopartikel. (A) Struktur eines genspezifischen Nanopartikels. (B) Scramble Nanopartikel (Negativkontrolle). (C) Uptake Nanopartikel (positive Kontrolle). Von Lahm et al. 17 angepasst ist, mit Genehmigung von Wiley nachgedruckt. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig2.jpg" /> Abbildung 2: Anwendung von Nanopartikeln zu Zellkulturen Ein richtig verdünnte Lösung von Nanopartikeln wird einfach in das Kulturmedium pipettiert.. Nach O / N Inkubation genspezifischen fluoreszierenden Zellen unter af sichtbaren<html> luorescent Mikroskop. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig3.jpg" /> Abb. 3: Aktive Aufnahme von Nanopartikeln durch Zellen über Endozytose (A) Zellen aktiv zu verschlingen die Nanopartikel durch Endozytose (B) Ziel-mRNA bindet an die Capture-Strang und verdrängt die fluoreszierenden Reporter.. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig4.jpg" /> Abbildung 4: Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie. (A) Strategie für die HEK 293 Zellen. (B) Strategie für die Maus-ES-Zellen. Die Daten wurden unter Verwendung von Vorrichtung 1 zum HEK 293-Zellen oder Vorrichtung 2 für Maus-ES-Zellen gewonnen und wurden anschließend durch ein Software-Tool (siehe Tabelle der Materialien) analysiert. /53268fig5.jpg &quot;/&gt; Fig. 5: Analyse von GAPDH -Ausdruck in HEK 293 Zellen A GAPDH-spezifischen Nanopartikel wurde zu den Zellen bei 100 uM (Endkonzentration) (B zugegeben und die Fluoreszenz wurde nach O / N Inkubation aufgezeichnet (A) GAPDH-spezifischen Nanopartikel.. ) Scramble (Negativkontrolle). (C) Uptake (positive Kontrolle). (D) Kinetik der Jagt und Aufnahme Kontrolle. Fluoreszenz wurde in den angegebenen Zeitpunkten nach der Zugabe des GAPDH-spezifischen Nanopartikel bestimmt. Skalenbalken stellen 50 &amp; mgr; M. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig6.jpg" /> Abb. 6: Analyse von Pluripotenz Genexpression in iPS-Zellen von verschiedenen Arten Nanopartikel spezifisch für NANOG oder GDF3 wurden zu den Zellen bei 400 pM hinzugefügt (final concentration) und Fluoreszenz wurde nach O / N Inkubation A) Murine iPS-Zellen B) Menschliche iPS-Zellen erfasst. (. (. (C) Porcine iPS-Zellen. Pfeile in (A) und (C) zu benennen, nicht markierten Fibroblasten-Feeder-Schicht-Zellen. (D) Fluoreszenz-in-Maus-iPS-Zellen nach der Zugabe des NANOG-design SF3 Nanopartikel. Skalenbalken stellen 50 &amp; mgr; M. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/53268/53268fig7.jpg" /> Abbildung 7: Nanopartikel-markierter lebenden Zellen durch Durchflusszytometrie identifiziert werden. (A) Die mikroskopische Ansicht des Cy3 positive HEK 293-Zellen nach Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von Nanopartikeln. (B) Die Häufigkeit der Cy3-positive Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt. (C) Live-Färbung von Maus-ES-Zellkolonien und die Bestimmung der Häufigkeit von Cy3 positive Zellen. Nanopartikel wurden hinzugefügtbei einer Endkonzentration von 400 pM. Skalenbalken stellen 50 &amp; mgr; M.

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Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

detection-intracellular-gene-expression-live-cells-murine-human

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Aufrufe.  Technische Universität München. This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species. 

Serie: Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakterielle Gene Expression Analysis Using Microarrays

Forschung

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Ein Allel-spezifische Gene Expression Assay zur Funktionsanalyse Grundlage genetischer Verbände testen

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...