Wir wollen die Unterstützung der Universität von Chicago Abschnitt der Urologie von Dr. Arieh Shalhav führte, und der Direktor der Urologischen Forschung Dr. Carrie Rinker-Schaeffer anzuerkennen. Wir würden auch gerne die Unterstützung der Universität von Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCCC) von Dr. Michelle Le Beau führte zu bestätigen. Wir arbeiten auch mit den Experten der technischen Hilfe des Human Tissue Resource Center Core Facility Dr. Mark Lingen führte, und der Unterstützung von Leslie Martin und Mary Jo Fekete danken. Wir danken auch der Core Facility Immunhistochemie von Terri Li laufen. Diese Arbeit wurde von der University of Chicago Department of Surgery, die Abteilung für Urologie finanziert, ein American Cancer Society Institutional Research Grant (ACS-IRG, # IRG-58-004), ein Krebs-Center Support Grant (P30 CA14599); Der Brinson Foundation, die Alvin Baum Family Fund; The University of Chicago Cancer Research Foundation Frauen Platine; S. Kregel wird von einem HHMI unterstützt: Med-in-Grad Fellowship (56006772) und ein Krebs-Biologie Ausbildung Grant (T32-CA09594). Schließlich möchten wir Robert Clark, Dr. VenkateshKrishnan und Nathan Stadick für ihre kritische Beurteilung des Manuskripts danken.

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der University of Chicago Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC, Protokoll-Nummern 72066 und 72231) zugelassen. Jede Operation wurde unter Vollnarkose durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen wurden, nicht so lange leiden. Die menschlichen embryonalen Stammzellen Linie WA01 (H1; NIH-registration # 0043) wurde von WiCell (Madison, WI) und kultivierten erworben über den Einzug-unabhängiges Protokoll mit mTeSR1 Medien (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC). ES-Zellen wurden innerhalb von zehn Durchgängen Auftauen verwendet. 1. Isolation des Sinus urogenitalis aus Maus oder Ratte Embryonen <ol><li> Euthanize eine Zeitfahr-schwangeren Maus (Tag 17,5) oder Ratte (Tag 18,5) durch die Inhalation von CO 2 für 5 min. Der Tod wird durch die Einstellung der Vitalfunktionen in der Ratte bestätigt. Dann brechen den Hals menschlich. Die rbei an dieser Stelle eingeschläfert. Sprühen Sie 70% Ethanol, um die Bauchhaut und Flanken zu sterilisieren. Schneiden Sie die Bauchhaut und Muskelschichten und dann schneiden die Gebärmutter, trennen Sie die Ratte Embryonen aus der Fruchtblase, und schnitt die Nabelschnur. Übertragen Sie die Embryonen in einem 50 ml Falcon Röhrchen mit eiskaltem Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) und halten auf dem Eis. Föten werden durch Enthauptung mit chirurgischer Schere eingeschläfert. </li><li> Setzen Sie den Embryo in 100 mm Petrischale. Halbieren des Embryos mit einer Schere in der Höhe des Nabels (1A). Entfernen Sie den Magen und Dünndarm. Reveal die Eierstöcke in den weiblichen Embryo und Hoden in der männlichen Embryo (Abbildung 1B und 1C). (Die Eierstöcke sind am kaudalen Pole der Nieren. Die Hoden sind etwa in Höhe der Blase). In diesem Entwicklungsstadium, isoliert UGSM sowohl von männlichen und weiblichen Embryonen zu induzieren vermag eine Prostataepithelzellen Linie in Gegenwart von Host sindTestosteron. 4 Nach diesem Entwicklungsstadium Zeitpunkt beginnt jedoch Prostatahyperplasie Knospen bilden in den UGSM und Isolierung von reinem UGSM ist sehr herausfordernd. 4 </li><li> Unter dem Dissektionsmikroskop, schneiden die Bauchdecke in der mittleren Zeile mit Vannas Schere, um die Blase und hinteren Bauchwand freizulegen. Free the oberen Genitaltrakt von Anhängen (bei männlichen Embryonen, schneiden Sie den Harnleiter, Urnierengang und Müller-Gang; in weiblichen Embryonen, schneiden Sie den Harnleiter und Müller-Gang). Befreie die Blase aus der Nabelschnur. Cut Schambein und unverblümt getrennt von der vorderen Wand des Sinus urogenitalis mit Dumont feine Spitze Pinzette. Schließlich trennt die hintere Wand des Urogenital-Sinus aus dem Rektum. Schneiden Sie den Sinus urogenitalis mit der Blase am unteren Ende (aus der Harnröhre) und speichern Sie die Sinus urogenitalis en bloc (mit der Blase) in eiskaltem HBSS. </li></ol> 2. Trennung des Sinus urogenitalis Mesenchym <ol><li&gt; Entfernen Sie die Blase aus dem Sinus urogenitalis unter dem Dissektionsmikroskop (1D). </li><li> Übertragen Sie die Sinus urogenitalis einem Falcon-Röhrchen mit 1% Trypsin in Calcium (Ca 2 +) und Magnesium (Mg 2 +) kostenlos HBSS. Das Röhrchen wird in einem Kühlschrank bei 4 ° C für 75 min. </li><li> Entfernen Sie die Trypsin und Trypsin neutralisiert mit 10% fötalem Bovin Serum (FBS) in DMEM/F12 Medium. </li><li> Sorgfältig necken die klebrige mesenchymalen Hülse von der epithelialen Rohr mit einer Nadel oder Dumont feine Spitze Pinzette (Aufrechterhaltung der epithelialen Röhre intakt verringert die Chancen der Epithelzellen Kontamination des Mesenchym, dies kann in Nagetier Drüsen führen bilden zusammen mit Ihrem Stammzellen abgeleiteten menschlichen Drüsenepithel) (1D). 12 </li><li> Übertragen UGSM in ein neues Falcon-Röhrchen mit DMEM/F12-Medium + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep, 0,5 mg / ml) + 1% Non-Essential Amino Acids (NEAA) zzgl. 1 nM R1881. Place das Rohr in einem Brutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 über Nacht. </li><li> Zentrifuge das Gewebe bei 200 xg und den Überstand verwerfen. Waschen mit Phosphatpuffer Saline (PBS) (nicht stören das Gewebe Pellet). </li><li> In 0,2% Kollagenase (in DMEM/F12) zu resuspendieren des Gewebes. Inkubation in 37 ° C unter leichtem Schütteln für 1 Stunde. </li><li> Energisch Wirbel die Verdauung Gewebe dreimal, bis es homogen einzellige Mischung wird und fügen DMEM/F12-Medium + 10% FBS + 1% P / S + 1% + 1 nM R1881 NEAA die Kollagenase neutralisieren. </li><li> Zentrifuge bei 200 xg und dann waschen durch erneute Aussetzung der UGSM Zellen in HBSS, und wiederholen dreimal vollständig waschen UGSM. Schließlich auszusetzen mesenchymalen Zellen in DMEM/F12 und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder Zellzählung Gerät. </li><li> Dissociate hES-Zellen kultiviert mit Feeder-freies Protokoll mit mTeSR1 Medien (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) unter Verwendung eines Accutase Verdauung (Millipore; Billerica, MA). Waschen Sie die hES-Zellenwährend der log-Phase ihres Wachstums in warmen DMEM/F12-Medium, dann fügen warmen 1x Accutase Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 15-20 min, bis einzelne Zellen gleichmäßig losgelöst von Kolonien sind. In die gleiche Menge definiert 1x Trypsin Inhibitor (Invitrogen; Grand Island, NY), um die Accutase neutralisieren und sanft Pipette auf und ab zu mischen und brechen Zellklumpen. Pipette Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 3 min bei 200 xg und resuspendieren Zellpellet in DMEM/F12-Medium. Reaktionsgefäßständer für 3 min bei 200 xg erneut und entfernen Sie den Überstand, dann in kaltem HBSS oder DMEM/F12 resuspendieren auf gewünschte Lautstärke. </li><li> In hES-Zellen mit 1:2,5 Verhältnis von hES / mesenchymalen Zellen. 3 Dies wird eine zelluläre Zusammensetzung von 1E 5 UGSM Zellen mit 4E 4 hESCs pro 10 ml Injektionslösung (eine einzelne Ratte UGS Regel ergibt etwa 2E 6 mesenchymalen Zellen) sein. Zentrifuge bei 200 xg für 5 min und dann den Überstand verwerfen. Mit 75% Matrigel (BD Biosciences Re-suspend,San Jose, CA; mit 25% kaltem HBSS für eine einfachere Handhabung) und legen Sie den Schlauch in Eis für Sub-Nierenkapsel Injektion. </li></ol> 3. Transplantation von Gewebe Rekombinante Unterhalb der Nierenkapsel <ol><li> Bereiten Sie eine sterile OP-Bereich. </li><li> Anesthetize einen männlichen athymischer Maus mit Ketamin / Xylazin ip; verwenden eine frische Mischung mit einem Verhältnis von 01.01.08 Ketamin: Xylazin: Kochsalzlösung. Dosierung beträgt 100 mg / kg Ketamin und 2,5 mg / kg Xylazin sein. Tiere reagieren nicht auf einer Zehe-Prise sollte vollständig unter 20-30 min. </li><li> Chirurgisch bereiten die Maus durch Rasieren das OP-Gebiet (wenn nicht mit einem nackten Maus), Reinigung mit drei abwechselnden Tücher von 70% Alkohol, gefolgt von betadine Lösung und Anlegen eines Operationstuch. </li><li> Setzen Auge Feuchtigkeit Salbe (Altalube Augensalbe) an den Augen der Maus Austrocknen zu verhindern während der Narkose. </li><li> Während der Operation werden Atemfrequenz und Körpertemperatur der Mäuse beobachtet. Die Atemfrequenz shoULD stabil sein und gewartet werden innerhalb 40-90 Atemzüge / min. Die Körperkerntemperatur wird mit Beobachtung der Farbe der Schleimhäute und der rosa Fußsohlen überwacht. </li><li> Machen Sie einen 1,0 cm langen Hautschnitt längs auf der Rückseite. Fahren Sie mit der Bauchdecke in einer 0,5 cm Längsschnitt geschnitten. </li><li> Drücken Sie vorsichtig die Niere aus dem Bauch und halten die Niere Oberfläche feucht mit Tropfen steriler Kochsalzlösung. </li><li> Sanft Punktion der Nierenkapsel mit einem leeren 27-Gauge-Injektionsnadel. Eine sehr flache Punktion genügt. Diese werden, wo Sie Ihre stumpfen Nadel einsetzen, um Ihren zellularen Mischung injizieren. </li><li> Füllen Sie eine 28-Gauge-Nadel stumpf Spritze mit 10 ul Ihr Handy Mischung. Langsam legen Sie die Einstichstelle und dringen in die Nierenparenchyms um einen Bereich unterhalb der Nierenkapsel zu erreichen. Anschließend werden 10 ul der zellulären Mischung, um einen Bolus auf die Niere unter der Nierenkapsel zu bilden. Zurücknahme der Nadel. </li><li> Bringen Sie die Niere zur abdominal Hohlraum. Sichern Sie die Muskelschicht des Bauchfells mit 4-0 Nylonnaht. </li><li> Schließen Sie die Haut mit jeder Naht oder Grundnahrungsmittel. </li><li> Reinigen Sie das Blut aus der Haut mit steriler Kochsalzlösung. </li></ol> 4. Postoperative Analgesie und Überwachung <ol><li> Injizieren Sie das Tier mit Buprenorphin (0,1 mg / kg alle 12 h) oder Ketoprofen (3-5 mg / kg in Kochsalzlösung alle 12 h), um postoperative Schmerzen, und 1 ml 37 ° C zu halten Kochsalzlösung ip das Tier warmen verwalten und Austrocknung zu verhindern. </li><li> Setzen Sie das Tier in einem Käfig sauber und legen Sie sie an einem milden Heizkissen. </li><li> Senden Sie die Tiere zurück zu Tierraum sobald sie das Bewusstsein wieder zu erlangen und sind innerhalb des Käfigs zu bewegen. </li><li> Beachten Sie das Tier täglich für unerwartete Anzeichen von Krankheiten und Infektionen für die folgenden drei Tage. Die Mäuse werden mit der Beobachtung von Aktivitäten in Käfigen einschließlich Zugriff auf Nahrung und Wasser 1 Tag postoperativ überwacht. Wenn die Mäuse weniger Aktivitäten anzuzeigen, ist Ketoprofen intraperitoneal adwieder einmal ein Tag diente. </li><li> Entfernen Sie die Haut Klammern oder Nähte 2 Wochen nach der Operation. </li><li> Xenograft Gewebe können bereits nach 8 Wochen nach der Operation entnommen werden. Xenografts können in vivo abgebildet werden mit Kleintier-Ultraschall (2A) und fixierten Geweben kann geschnitten und gefärbt für verschiedene Proteine ​​mittels Immunhistochemie (Abbildung 3). </li></ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterospecific+induction+of+prostatic+development+in+tissue+recombinants+prepared+with+mouse,+rat,+rabbit+and+human+tissues.">Heterospecific induction of prostatic development in tissue recombinants prepared with mouse, rat, rabbit and human tissues.</a> Differentiation. 24, 174-180 (1983).</li><li>Van der Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+CD133+in+Normal+Human+Prostate+Stem+Cells+and+Malignant+Cancer+Initiating+Cells.">The Role of CD133 in Normal Human Prostate Stem Cells and Malignant Cancer Initiating Cells.</a> Cancer Res. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Van der Griend, D. J., Konishi, Y., De Marzo, A. M., Isaacs, J. T., Meeker, A. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-label+centromere+and+telomere+FISH+identifies+human,+rat,+and+mouse+cell+contribution+to+Multispecies+recombinant+urogenital+sinus+xenografts.">Dual-label centromere and telomere FISH identifies human, rat, and mouse cell contribution to Multispecies recombinant urogenital sinus xenografts.</a> Prostate. 69, 1557-1564 (2009).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Ludwig, T. 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S., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+normal+macrophages+from+human+embryonic+stem+(hES)+cells+for+applications+in+HIV+gene+therapy.">Derivation of normal macrophages from human embryonic stem (hES) cells for applications in HIV gene therapy.</a> Retrovirology. 3, 24 (2006).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-efficiency+system+for+the+generation+and+study+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 340-345 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt mit der Arbeit vorgestellt.

Tissue Rekombination unter Verwendung UGSM ist eine unglaublich nützliche Technik, um die Entwicklung der Prostata und die molekularen Ereignisse, die zu Prostatakrebs Einleitung zu untersuchen. Der induktive Potential UGSM hat für zahlreiche Anwendungen in der Forschung Prostata eingesetzt, dazu gehören die Verbesserung Tumor der Prostata-Zelllinien und Tumoren nehmen, Studium Stroma-Epithel-Wechselwirkungen und bilden cross-species Prostata Rekombinanten 7,17-20 richtige Vorbereitung von UGSM. jedoch ist...

Es gibt einen enormen Bedarf für eine bessere menschliche Modellsysteme von Prostatakrebs. Insbesondere wäre relevanten menschlichen Modellsysteme von normalen, gutartigen Prostata-Gewebe, die genetisch manipuliert werden, um direkt zu erkennen, die Rolle von spezifischen Genen in der Einleitung von Prostatakrebs kann unglaublich informativ. Das Aufkommen der genomischen Ära hat zahlreiche Gene, die eine Rolle bei der Entstehung von Krebs haben können, identifiziert. Ein Mangel an experimentellen menschlichen Modellsystemen jedoch stark beeinträchtigt unsere Fähigkeit, funktionell zu testen und zu charakterisieren Kandidat Prostatakrebs Suszeptibilitätsgene. Ein ideales Modellsystem wäre die rasche und schnelle funktionelle Analysen von Krebs Suszeptibilitätsgene in Kombination mit geeigneten transgenen Tiermodell zu erleichtern. Darüber hinaus würde eine solche menschlichen Modell zu ermöglichen molekulare Charakterisierung der Mechanismen der Signalisierung Prostatakarzinogenese zur Entdeckung und Validierung von neuartigen Therapien zurProstatakrebs verhindern Bildung. Menschliche embryonale Stammzellen (HES) bilden können menschliche Prostata-Gewebe als Xenotransplantate. 2006 Taylor, et al. Berichtet, dass HES induziert werden, um Prostata-Epithelzellen in vivo zu bilden, wenn mit Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym (UGSM) innerhalb eines Zeitraums von 8-12 Wochen wieder kombiniert werden. 1 Diese Studien wurden liegen vorangehende basierend das Cunha Labor zeigen, dass die Nager embryonalen UGSM fördern können Prostatahyperplasie Differenzierung von Stammzellen und embryonalen epithelialen Zellpopulationen in vivo. 2,3 Die Prostata entwickelt sich aus einer embryonalen anlagen bezeichnet die Sinus urogenitalis (UGS), und vor dem embryonalen Tag 17 (Maus E17 ; Tag E18 in der Ratte) die UGS kann entfernt werden und physisch aufgeteilt in Epithel (UGSE) und Mesenchym (UGSM) 4 Dieses Gewebe Rekombination Ansatz hat wesentlich unser Verständnis der Entwicklung und Prostata-Krebsentstehung, insbesondere verbessert.ly Wachstumsfaktor und hormonelle Signalwege und die molekularen Verhältnisse zwischen Prostata Stroma und Epithel. 5-8 Dieses Verfahren umfasst die ex vivo Kombination UGSM mit Stammzellen oder epithelialen Zellen aus den gleichen oder unterschiedlichen Arten und diese zellulären / Gewebe Rekombinanten implantiert gewachsen und Xenotransplantate innerhalb Mäusewirt. 4,9 Nach einer in vivo Wachstum enthält das Implantat Prostataepithelzellen Drüsenstrukturen in stromalen Gewebe eingebettet. Weitere Färbung durchgeführt werden, um festzustellen, ob solche Strukturen wirklich Prostata und des menschlichen Ursprungs sind. 10,11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>14170</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM/F12</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>11330</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>R1881</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>965-93-5</td>
 <td>Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEAA</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>11140</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pen-Strep Solution</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>15070</td>
 <td>100x stock</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matrigel</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KETASET (ketamine hydrochloride) </td>
 <td>Fort Dodge Animal Health</td>
 <td>NDC 0856-2013-01</td>
 <td>100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AnaSed (xylazine) </td>
 <td>VET-A-MIX, Inc.</td>
 <td>NADA 139-236</td>
 <td>20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>215240</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C2014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketoprofen </td>
 <td>Fort Dodge</td>
 <td>NDC 0856-4396-01</td>
 <td>100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Altalube eye ointment </td>
 <td>Altaire Pharmaceuticals, Inc.</td>
 <td>NLC 56641-19850</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leica MZ16 F Stereomicroscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td></td>
 <td>Any good dissecting scope can be used.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas spring scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15001-08</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>84855</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt)</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-02 </td>
 <td>Custom Needle </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol Prep Pads</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>06-669-62 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Gauze Pads</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-415-469 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2)</td>
 <td>MedVet International</td>
 <td>J392H </td>
 <td>Needle-in, dissolvable suture </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Autoclip 9 mm Wound Clips</td>
 <td>Becton Dickenson</td>
 <td>427631</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PVP Iodine Prep Pads</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>06-669-98 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissector scissor with blunt end</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14072-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont fine tip forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11252-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle holder with Scissor</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

formation of human prostate epithelium using tissue recombination of rodent urogenital sinus mesenchyme and human stem cells

Die Fortschritte bei der Prostatakrebs-Forschung ist stark durch die Verfügbarkeit von Menschen stammenden und Hormon-naiven Modell-Systeme, die unsere Fähigkeit zur genetischen und molekularen Ursachen Prostata-Erkrankungen Einleitung verstehen begrenzen begrenzt. Gegen die Entwicklung besserer Modellsysteme für das Studium der menschlichen Prostata-Krebsentstehung, haben wir und andere Vorteile der einzigartigen Pro-Prostata-induktiven Potenzial von embryonalen Nagetier Prostata Stroma genommen, genannt Sinus urogenitalis Mesenchym (UGSM). Wenn bestimmte pluripotenten Zellpopulationen wie embryonalen Stammzellen rekombiniert induziert UGSM die Bildung von normalen menschlichen Prostata-Epithelzellen in einem Testosteron-abhängigen Weise. Solch ein Modell menschlichen System kann verwendet werden, um zu untersuchen und experimentell testen die Fähigkeit der Bewerber Prostatakrebs Suszeptibilitätsgene in beschleunigtem Tempo im Vergleich zu typischen Nagetier transgenen Studien werden. Seit Menschliche embryonale Stammzellen (hES) können in Kultur genetisch modifiziert werden using induzierbare Genexpression oder siRNA knock-down-Vektoren vor Gewebe Rekombination erleichtert ein solches Modell Testen der funktionalen Folgen der Gene oder Kombinationen von Genen, die vermutlich fördern oder Vorbeugung einer Karzinogenese verwendet werden. Die Technik der Gewinnung von reinem Populationen UGSM Zellen, jedoch ist eine Herausforderung und Lernen erfordert oft jemand mit früheren Know-how, um persönlich zu unterrichten. Darüber hinaus kann der Impfung Zellgemischen unter der Nierenkapsel eines immungeschwächten Gastgeber technisch anspruchsvoll. Hier beschreiben wir veranschaulichen und ordnungsgemäße Isolierung UGSM von Nagetier Embryonen und Nierenkapsel Implantation von Gewebe Mischungen menschlichen Prostata-Epithel zu bilden. Ein solches Vorgehen, bei ihrer aktuellen Phase, erfordert in vivo xenografting von embryonalen Stammzellen; zukünftige Anwendungen könnten in vitro Drüse Bildung oder die Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzell-Populationen (iPS) umfassen.

Aufbauend auf den spannenden Bericht von Taylor et al. Hat unser Labor eine engrafting Protokoll über die gängigen H1 (NIH-designated WA01, genetisch männlich) mit menschlichen embryonalen Stammzellen Linie. 1 Diese Linie wurde konsequent für die Qualitätskontrolle getestet und entwickelt ist karyotypisch normalen 13 Wenn kultiviert angemessen, hES-Zellen aufrechterhalten, ausgebaut und kryokonserviert in einem undifferenzierten und pluripotenten Zustand mit einem Feeder-freie Kultur-...

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Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Um zu entwirren die frühesten molekularen Mechanismen Prostatakrebs Initiation, neuartige und innovative menschlich Systeme und Ansätze dringend benötigt werden. Das Potenzial der pre-Prostata Urogenitalsinus Mesenchym (UGSM) an pluripotenten Stammzellen Zellpopulationen induzieren die menschliche Prostata-Epithel zu bilden ist ein leistungsfähiges Werkzeug in Prostata experimentellen Forschung.

Formation of Human Prostate Epithel Mit Tissue Rekombination von Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym und menschlichen Stammzellen

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

formation-human-prostate-epithelium-using-tissue-recombination-rodent

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K Aufrufe.  University of Chicago. Um zu entwirren die frühesten molekularen Mechanismen Prostatakrebs Initiation, neuartige und innovative menschlich Systeme und Ansätze dringend benötigt werden. Das Potenzial der pre-Prostata Urogenitalsinus Mesenchym (UGSM) an pluripotenten Stammzellen Zellpopulationen induzieren die menschliche Prostata-Epithel zu bilden ist ein leistungsfähiges Werkzeug in Prostata experimentellen Forschung.

Serie: Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Stem Cell Transplantation in einem In-vitro- Simulierte Ischämie / Reperfusion-Modell

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Forschung

Medizin

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Präklinische Orthotopische Mausmodell der menschlichen Prostata-Krebs

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

Bewertung der menschlichen Fettgewebe mikrovaskuläre Funktion mit Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...