Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (NIH), um RCB, CA122985 und Prostata SPORE CA90386, und JMP, NIH T32 AG000260 &quot;Drug Discovery Ausbildung im Alter-Related Disorders&quot;, und von der Walter S. Und Lucienne unterstützt Driskill Graduate Program in Life Sciences an der Northwestern University. Wir würden auch gerne die Maus Phänotypisierung und Histologie-Labor und Pathologie Core Facility an der Northwestern Universität danken.

Für alle Verfahren, die Tiere, sind Protokolle, die von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Northwestern Universität genehmigt. Chirurgische Techniken und Tierpflegebedingungen wurden von Veterinärpersonal beobachtet und modifiziert, um Tier Stress oder Mortalität zu minimieren. Einzelne Organe können unterschiedliche Anforderungen haben, und es ist wichtig, mit IACUC und Tier Mitarbeiter arbeiten bei der Entwicklung und Ausführung dieser Operationstechnik. 1. Herstellung von Zellen zur Injektion <ol><li> Dieser Schritt sollte so nah wie möglich in die Ausgangsoperationen durchgeführt werden. Trypsinize Zellen für das Experiment verwendet, von der Platte zu entfernen und zu neutralisieren, mit Medien. Die PC3-M menschlichen PCa-Zelllinie, die stabil mit GFP transfiziert wurde erfolgreich für diese Experimente verwendet, aufgrund der schnellen Wachstumsbedingungen der PC3-M-Zellen. GFP wurde für eine weitere Erleichterung der Erfassung der Lungenmetastasen in der Lungengewebeproben und schnelle Bestimmung von MehrKrebszellen gegenüber Immunzellen in Kulturen aus Blut und Knochenmark zu zirkulierenden Tumorzellen zu identifizieren, erhalten. Wenn Modifizieren eines spezifischen Gens von Interesse, dann Erzeugung von stabilen Zelllinien mit dieser Genveränderung zuerst durchgeführt, gefolgt von einer Transfektion mit GFP. GFP wird, wenn die Funktion dieses Gens von Interesse zu verändern, kann es GFP weggelassen. Dadurch wird der Erfassungslungenmetastasen schwieriger, aber immer noch erreichbar. Wenn zusätzlich mit spezifischen Bildverarbeitungstechnologie unter Verwendung von fluoreszierenden Markern, wie Luciferase-Basis IVIS, andere fluoreszierende Proteine ​​können stattdessen verwendet werden. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 225 x g. </li><li> Isolieren 2,5 x 10 5 Zellen und Zentrifuge für 5 min bei 225 x g. </li><li> Überstand entfernen und resuspendieren Zellen in 20 ul steriler Kochsalzlösung. </li><li> Saugen Zellsuspension in einer 0,5-ml-Spritze mit einer permanenten 28 ½ G-Nadel (empfohlen: Kendall Monojet, wie andere Marken haben Probleme verursacht), sodass keine Luft in die Nadel along mit der Suspension. </li><li> Wickeln Spritze in sterile Folie und Lagerung auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ol> 2. Orthotopen Implantation von menschlichen Prostatakrebszellen <ol><li> Männlich 6-8 Wochen alte Balb / c Nacktmausmodell verwendet. Das ideale Körpergewicht der Maus für die Operation ist 19-21 g, und Mäusen erlaubt sein sollte, mindestens 18 g vor der Operation wachsen werden. Kleinere Tiere sind technisch schwieriger zu operieren. Größere Tiere dazu neigen, langsamer Kinetik des Tumorwachstums und der Metastasenbildung erfahren. Die Tiere sollten in der Tierhaltung mindestens eine Woche vor der Operation, um Stress zu minimieren Tier untergebracht werden. Je nach Versuchsanordnung kann medikamentöse Behandlung eine Woche vor der Operation zu beginnen. </li><li> Spritzen Sie vor der Operation Schmerzmittel gemäß den Anweisungen des Tieranlage. 0,1 mg / kg Körpergewicht subkutane Buprenex mit einer 30 ½ G-Nadel in eine 1 ml-Spritze angebracht ist, vorgeschlagen. </li><li> Zeigen Tiere in die Isofluran-Kammer und warten, bis Tiere sind voll einnesthetized. Kein Fuß-Reflex des Muskeltonus sei an dieser Stelle vorhanden sein. Diese Methode wird empfohlen, aber falls nicht verfügbar, können auch andere Methoden der Anästhesie gemäß den Anweisungen des Tieranlage verwendet werden. </li><li> Bewegen Tier aus der Isofluran Kammer in eine sterile Verfahren Kapuze. Zeigen Tier in die Nasenkegel Vorrichtung und wieder dafür sorgen, dass Tier ist unter Voll Betäubung bevor Sie fortfahren. </li><li> Desinfizieren unteren Bauchregion mit Betadine Scrub mit sterilen Wattekugeln, wischen Sie mit Alkohol zu wischen, und letzte Spray mit Betadine Lösung. Trocknen lassen. </li><li> Entweder mit einem sterilen Skalpell oder geschärft sterilen OP-Schere, eine niedrige Mittellinie Bauchschnitt von ca. 3-4 mm hergestellt wird. Heben Sie die Blase mit einer Pinzette und identifizieren Sie die Bauchlappen der Prostata. Diese beiden Nocken sind direkt unterhalb der Blase befindet. Einige Mäuse haben eine kleine Schicht von Fett für die Prostata, die sich sanft beiseite mit einem sterilen Wattestäbchen bewegt werden kann. Minimize alle Bewegungen von Organen und Muskulatur, wenn möglich. </li><li> Spritzen Sie 20 ul Volumen Zell-Lösung in die Prostata, die Minimierung Leckage und die Gewährleistung eine kleine Blase beobachtet. </li><li> Blase ersetzen und schließen Sie die Muskelschicht unter Verwendung von 4,0 resorbierbaren Vicryl Monofilamentnahtmaterialien in einem einfachen Muster unterbrochen. </li><li> Schließen Sie die Hautschicht mit steriler 9 mm Heftklammern. </li><li> Entfernen Tier von Isofluran-Narkose und zu überwachen, bis wach und normal bewegt. Legen Sie auf Heizkissen während Erholungsphase. </li><li> Wenn mehrere Operationen werden durchgeführt, zwischen Operationen, sauber alle Werkzeuge mit 70% Ethanol und sterilisieren mit einem Glasperlen Sterilisator. Lassen Tools vollständig vor dem nächsten Tier zu kühlen. Nähte, Watte oder sterile Tupfer nicht wiederverwenden. </li></ol> 3. Überwachung Tiere <ol><li> Verwalten Schmerzmittel auf Basis von Anweisungen des Tieranlage. 4 Stunden nach der Operation Verabreichung einer Dosis von subkutanen Meloxicam bei 1 mg / kg Körpergewicht usingen 30 ½ G-Nadel in eine 1 ml Spritze angebracht wird vorgeschlagen, gefolgt von einer zusätzlichen Dosis alle 12-24 Stunden für die nächsten 48 Stunden. </li><li> Staples kann von Tieren, 7-10 Tage nach der Operation entfernt werden, sobald die Wunde verheilt ist. </li><li> Überwachung der Tiergewicht, Nahrungsaufnahme, und tasten Mäusen Tumoren zweimal pro Woche bis zum Ende des Experiments. Frequenz erhöhen bis zu jeden zweiten Tag, wenn die Tumore sichtbar für Tiere unter erheblichem Tumorlast oder Zwang prüfen zu werden. Früher Tod von diesem Modell ist aufgrund der großen Primärtumorlast als primäre Tumoren können Harnfluss blockiert, so dass alle Tiere, die mit einem Verlust von mehr als 15% des Körpergewichts oder eines primären Tumors erreichen einen Durchmesser von 1,5 cm sollte sofort seziert werden verhindern Harnstauung und Tier Tod. </li><li> Monitor für zusätzliche Bereicherung der Tierumgebung. Der Stress der Operation erhöht Tierkämpfe. Die Zugabe von zwei Kunststoff-Hütten pro Käfig anstelle von einem und zusätzliches Verhaltenal-Anreicherung kann diese Vorfälle zu verringern. Diskutieren Sie mit Tierärzten Möglichkeiten an der Anlage werden die Tiere bei untergebracht. Angesichts der fehlenden Wimpern auf dieser Stamm von Mäusen, sind Hütten und Bereicherung aus Papier nicht zu empfehlen, da sie die Augen reizen. </li></ol> 4. Necropsy Verfahren <ol><li> Nach 4-6 Wochen sind Tumoren völlig offensichtlich und Tieren anfangen, Gewicht wegen der erhöhten Tumorlast zu verlieren. Die Tumoren können in der Regel ertastet werden und / oder offensichtlich sind. Nekropsie sei an dieser Stelle durchgeführt werden. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von Nembutal bei 260 mg / kg Körpergewicht mit einer 30-Gauge-Nadel ½ zu einer 1-ml-Spritze befestigt ist, und damit sich die Tiere völlig bewusstlos zu werden, ohne Zehenreflex oder Gegenwart Muskeltonus. </li><li> Sobald das Tier anästhesiert unter Verwendung von sterilen chirurgischen Schere oder einem Skalpell geschnitten horizontal über den Rumpf des Tieres direkt unter dem Brustkorb, dann senkrecht zu der Achselhöhle entlang der Seite des Tieres, Setzen das Herz. Führen einer terminalen Herzpunktion mit einer 30 ½ G-Nadel in eine 1 ml Spritze mit 4% Natriumcitrat in DPBS gespült, um die Gerinnung zu verhindern, erhalten wird, wie viel Blut wie möglich aus dem Tier befestigt. </li><li> Entfernen Sie die Lunge aus dem Tier, indem die Luftröhre mit chirurgischer Schere oder einem Skalpell und sofort in einer Gewebekultur Kassette und in 10% Formalin zu platzieren. </li><li> Entfernen Sie den primären Prostatatumor aus dem Tier durch individuelle Schneid keine Blutgefäße in den Tumor angebracht und die Gewährleistung keine zusätzlichen Organe wie die Samenleiter oder Samenblasen sind beigefügt. </li><li> Das Gewicht und die Größe des Tumors. Messen des Gewichts des Tumors in Gramm im Labormaßstab. Mit Sättel, messen Sie die Länge des längsten Durchmesser des Tumors in Zentimetern und die entsprechende senkrechte Achse. Multiplizieren Sie diese Werte, um die Tumorgröße zu erhalten. Je nach den geplanten Einsatz sofort schnappen Einfrieren in flüssigem Stickstoff, und / oder inan einer Gewebekassette in 10% Formalin. </li><li> Expose die Hüft-und Kniegelenke mit chirurgischer Schere oder einem Skalpell, und trennen Beingelenke, wobei darauf geachtet, den Oberschenkelknochen intakt zu halten. Entfernen Sie die Oberschenkelknochen aus dem Tier aufnehmen und in steriler Kochsalzlösung. </li><li> Erhalten Sie alle anderen Organen oder Materialien von Interesse, und entsorgen Tier nach Anweisungen Ihres Instituts. Insbesondere regionalen Lymphknoten-Metastasen neigen zu haben, neigen dazu, vergrößert werden, wenn sie zu beherbergen, und kann geerntet werden. Allerdings sollte darauf geachtet werden, wie dies durch Änderungen des hydrostatischen Drucks durch den chirurgischen Eingriff verursacht betroffen sein werden. </li></ol> 5. Verarbeitung und Immunfärbung von Lungengewebeproben <ol><li> Innerhalb von 24-48 Stunden der Platzierung Gewebe in 10% Formalin in PBS, betten die Lunge in Paraffin. </li><li> Abschnitt der Lunge bei 45 um Schritt Abschnitte unter 3.2 benachbarten 4 um Lungengewebeschnitten. </li><li> Wenn GFP-positive Zellen verwendet (empfohlen), Immunfärbung durchzuführenfür GFP. Wenn nicht, führen Sie Standard Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E)-Färbung. </li></ol> HINWEIS: Die Dako Envision + Kit in Kombination mit dem GFP-Antikörper von Invitrogen erfolgreich nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde, aber dies kann zu jeder Immunhistochemie Verfahren geändert werden. <ol start="4"><li> Ergebnis Metastasierung verblindet. Wenn GFP-positive Tumorzellen werden zusätzlich zu den mit großen und unverwechselbaren Kerne braun färben. Beim ersten Wertungs Metastasierung, konsultieren Sie einen Pathologen richtige Scoring zu gewährleisten, und verwenden Sie H &amp; E-gefärbten Lungengewebe, die Präsenz von Tumorzellen zu bestätigen, und nicht infiltriert Immunzellen. </li></ol> 6. Identifizierung von zirkulierenden Tumorzellen aus Blut und Knochenmark <ol><li> In allen von der Obduktion in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt Blut. Zentrifuge 5 min bei 800 x g. </li><li> Entfernen Sie die Plasma-und 1 ml ACK-Lysepuffer (154,95 mM Ammoniumchlorid, 9,99 mM Kalium Bicarbonate, 0,0995 mM EDTA). Das Blut bei Raumtemperatur 3-5 min zu sitzen. </li><li> Zentrifuge 5 min bei 800 x g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und 1 ml Zellkulturmedien, die Antibiotika. Hinzufügen von Zellen zu einem T75-Kolben mit 9 ml Zellkulturmedium. </li><li> Kulturzellen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 für 10 Tage, Prüfen auf das Vorhandensein von CTC alle 2-3 Tage. </li><li> Für Knochenmark, entfernen Sie alle Muskelgewebe aus Oberschenkelknochen mit einer Schere, einer Rasierklinge oder Skalpell. Entfernen der Enden der Knochen, möglichst nahe an den Enden wie möglich. </li><li> Verwendung einer 23 G-Nadel ¾ sanft ausgeworfen das Knochenmark aus den Oberschenkelknochen in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> In den 1 ml Zellkulturmedien und vorsichtig pipettieren, gut mischen. </li><li> Hinzufügen von Zellen zu einem T75-Kolben mit 9 ml Zellkulturmedium. </li></ol> 7. Molekulare Charakterisierung von Tumoren <ol><li> Für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Assays, Tumorproben, die Schnapp waren in flüssigem Stickstoff eingefroren werden zuerst auf Trockeneis pulverisiert und dann homogenisiert mit einem Gewebe-Homogenisator für 3-5 min mit 1 ml TRIzol. TRIzol Extraktion wird den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Reinige RNA mit dem RNeasy RNA Isolation Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Darstellende cDNA-Synthese und quantitative Echtzeit-PCR (qRT / PCR) unter Verwendung von TaqMan-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers wird empfohlen, aber kann für jede derzeit eingesetzten PCR-Verfahren modifiziert werden. </li><li> Für die Western-Blot-Assays, homogenisieren Gewebe mit einem Gewebe-Homogenisator für 3-5 min mit 1 ml Lyse-Puffer: PBS (137 mM NaCl, 10 mM Na-Phosphat, 2,7 mM KCl), 0,5% Triton X-100, 1 mM EDTA, 2,5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM β-Glycerophosphat, unter Zusatz von Protease-Inhibitor-Cocktail, Phosphat-Inhibitor-Cocktails 2 und 3, 10 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat. Das Zelllysat Gemisch wird in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. </li><li> Centrifuge Zelllysat Mischung für 10 min bei 13.000 x g. </li><li> Überstand entfernen und in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenrohr und erneut 10 min bei 13.000 x g zentrifugiert. Wenn die Zelltrümmer noch vorhanden ist, kann eine zusätzliche Zentrifugationsschritt durchgeführt werden. </li><li> Überstand entfernen und führen Sie eine Western-Blot nach normalen Laborbedingungen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

In diesem Beitrag stellen wir eine neue Maus-Modell der menschlichen PCa Metastasierung. In diesem Modell, das menschliche Prostatakarzinom-Zelllinien PC-3-M orthotop direkt in die Prostata von Balb / c-Mäusen ohne Thymus und Tumoren ließ 4-6 Wochen entwickeln implantiert. In der repräsentativen Ergebnisse Abschnitt zeigen wir Beispiele für Daten, die gesammelt werden können, einschließlich Mausgewicht und Nahrungsaufnahme, Tumorgröße und Gewicht, der molekularen Eigenschaften des Tumors und die Bildung von Metastasen in verschiedene Lunge. Zusätzlich kann eine Vielzahl von zusätzlichen Ausgangssignale in Abhängigkeit von bestimmten Forschungsinteressen untersucht werden. Ein Beispiel ist die Anwesenheit von CTC zum Blut und Knochenmark. Als CTC sind ein relativ seltenes Ereignis (wir beobachten, CTC in etwa 5-20% der Kontrolltiere), waren wir nicht überrascht, dass keiner der fünf Mäuse in diesen Experimenten entwickelt CTC. Unser Labor hat auch dieses Modell, um Veränderungen in der zellulären Adhäsion durch Messung der Zellkernmorphologie in der BestimmungProstatagewebe 10. Wir haben auch dieses Modell verwendet, um primäre Tumorproliferation und Apoptose Status auswerten mit Ki67 und TUNEL-Färbung des Prostatatumors 14. Zusätzlich zu der Vielzahl von Datenausgängen, die erhalten werden kann, kann dieses Modell verwendet, um die Auswirkungen der beiden Veränderungen in der Proteinexpression sowie niedermolekularer Therapeutika zu bestimmen. Im Vergleich zu vielen spontanen und induzierten Modelle des menschlichen Prostatakarzinom Metastasen, gibt es eine höhere Durchlaufzeit von 4-6 Wochen. Andere Modelle mit einer hohen Laufzeiten, wie Schwanzvene oder Interkardial Injektion Modelle, haben ihre Grenzen ohne Primärtumor, also nicht vollständig rekapituliert die Klinik metastatischen Kaskade. In unserem Modell sind Tumorzellen, die primäre Ort der Herkunft zu entkommen, geben und zu überleben, das Kreislaufsystem und implantieren in einem sekundären Standort. Dies bietet zusätzliche Schritte, bei denen eine therapeutische Intervention oder Änderung in der Proteinexpression konnte eine Wirkung zu liefern. Additional sollte das Vorhandensein des Primärtumors für die einfache Anwendung dieses Modells auf neue Imaging-Technologien wie Luciferase-basierte IVIS 16-17 ermöglichen. Trotz der Vielfalt der Vorteile dieses Modells gibt es auch einige Einschränkungen zu berücksichtigen. Eine wachsende Zahl von Studien zeigen die Bedeutung des Immunsystems in der Tumor-Mikroumgebung und der Entwicklung von Metastasen 18. In diesem Modell wird durch die Verwendung einer athymischen Nager, ist die Fähigkeit, die Wirkungen des Immunsystems Beurteilung nicht möglich. Eine zweite Einschränkung ist das Fehlen von Androgen Reaktions in PC3-M-Zellen. Bei der ersten Diagnose von PCa-Patienten häufig Androgen-Therapie wird als First-Line Behandlung zu unterziehen. Allerdings werden Patienten schließlich werden Androgen-resistenten Tumoren und beginnt wieder zu wachsen. Wie PC3-M-Zellen fehlt der Androgen-Rezeptor, dieses Modell misst nur die Effekte der medikamentösen Behandlung oder Protein-Modulation auf Post-Androgen resistent cancer. Das ist zwar eine Einschränkung, ist Androgen-responsive PCa derzeit gut überschaubar und hat eine Vielzahl von wirksamen Behandlungsmöglichkeiten und damit Androgen-resistenten Krebs geworden prominent sucht. Dieses Modell auch speziell verwendet einen Inzuchtstamm von Mäusen, die Maus zu Maus Variabilität minimiert. Allerdings kann dieser Stamm besonders die auf bestimmte Proteine ​​oder kleine Moleküle, so kümmern sollte bei der Extrapolation dieser Daten in die Klinik aufgenommen werden. Obwohl dieses Modell bietet eine effektive Messung der Wirksamkeit von Medikamenten in einer schnellen Lieferzeit von 4-6 Wochen, kann dies nicht berücksichtigen langfristige Medikamentendosierungseffekte. Nach längerer Exposition gegenüber vielen derzeit verfügbaren Behandlungen können Patienten mit medikamentenresistenter Krebs viele Jahre nach der Behandlung zurückkehren. Die schnelle Durchsätze dieser Technik nicht wirksam für die Modellierung der Fähigkeit eines Tumors gegen eine Behandlung zu ermöglichen. Jedoch mit der Modulation dieser ExExperiment kann behandlungsresistenten menschlichen Prostatakrebszellen implantiert werden, und die Wirksamkeit der zweiten Generation therapeutische Verhinderung PCa Tumorwachstum und Metastasierung kann modelliert werden. Außerdem, wenn eine Gruppe wurde versucht, die molekularen Veränderungen in einem Primärtumor über die Zeit zu untersuchen, wurde ein längerfristiges Modell wie der TRAMP-Modell wird wahrscheinlich effektiver für diesen Studien sein. Eine weitere Einschränkung dieses Modells ist die Verbreitung von verschiedenen Metastasen nur in Lymphknoten und Lunge der Tiere. Beide Seiten sind häufige und klinisch relevanten Websites der Metastasierung, wie von warmen menschlichen Autopsiestudien 19 demonstriert. Stellt jedoch klinisch Knochenmetastasen eine herausragende Merkmal des menschlichen PCa und damit Modelle rekapituliert dies von Interesse. Leider sind diese nur schwer in einem Maus-Modell zu rekapitulieren, mit sehr wenigen Modelle, die Knochenmetastasen ohne Schwanzvenen, intercardial Injektion oder direkte Implantation in20 bis auf die Knochen. Wenn somit gezielt auf den Knochen von entscheidender Bedeutung Versuchs kann ein anderes Modell effektiver. Allerdings ist dieses Modell auf den Knochen bieten ein gewisses Maß an Verkehr in der Form von Knochenmark zirkulierenden Tumorzellen. Trotz dieser Einschränkungen ist diese Technik ein leistungsfähiges Modell der menschlichen PCa. Die Möglichkeit, Effekte auf den Primärtumor als auch Metastasen-Bildung in einem kurzen Durchlaufzeit zu messen bietet eine Vielzahl von Anwendungen. Bei diesem Modell müssen die Zellen der primären Organ entkommen, geben Sie und überleben in den Blutkreislauf und Implantat in einem sekundären Standort, rekapituliert den Prozess beim Menschen. Die zusätzliche Messung der molekularen Eigenschaften des Primärtumors, Veränderungen der Zellmorphologie und das Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen eine große Atem von Informationen aus einem Modell. Dieses Verfahren kann sowohl im Rahmen der Wirkstoffsuche, sowie Änderungen in der Tumorbiologie Studie verwendet werden.

Prostatakrebs (Prostatakarzinom) ist die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Männern und die zweithäufigste Todesursache durch Krebs in den Vereinigten Staaten ein. Tod von PCa ist nicht auf die Bildung der Primärtumor, sondern die Bildung von Metastasen. Daher ist von großer Bedeutung Prävention von Metastasen bei Patienten. Mausmodelle von PCa bieten eine Vielfalt von Optionen, um kritische biologische Informationen über diese Krankheit aufzudecken. Eine Vielzahl von Mausmodellen der PCa existieren, die jeweils mit inhärenten Vorteile und Einschränkungen. Während die Frequenz des PCa bei Menschen hoch ist, ist natürlich vorkommenden PCa extrem selten in 2 Mäusen, trotz gleicher Gesamt Anfälligkeit von Mäusen, Krebs 3. Ein Nagetier Ausnahme ist die Entwicklung von PCa in Lobund Wistar-Ratten, die Raten von PCa von 90% nach 12 Monaten über die Induktion von Methylnitrosoharnstoff und Testosteron 4 erreichen können. Deshalb induziert Modellsystemen, wie dem TRAMP(Transgene Maus Adenokarzinom der Prostata) Modell werden üblicherweise verwendet. Die TRAMP-Modell kann Transgen-Expression spezifisch in der Prostata zu induzieren, und unterliegt den normalen Verlauf der PCa von Hyperplasie zu Prostatahyperplasie intraepitheliale Neoplasie (PIN) zu Lymph-und Lungenmetastasen 5-6. Diese Modelle bieten die Vorteile der Lage, das gesamte Spektrum der Tumorprogression sowie enthalten ein intaktes Immunsystem zu messen. Jedoch können die molekularen Ereignisse PCa Entwicklungswertes zwischen Mäusen und Menschen unterschiedlich und Korrelationen zwischen Maus und humanen klinischen Studien haben gezeigt Variabilität. Darüber hinaus sind diese beiden Modelle sind zeitaufwendig, als ein Beispiel der TRAMP-Modell benötigt ca. 28 Wochen, um Metastasen zu entwickeln. Bei der Untersuchung Metastasen, wird häufig ein Schwanz-Vene oder linken Herzkammer Einspritzmodell verwendet. Dieses Modell profitiert von schnellen Turnaround-Zeit, und kann zusätzlich messen die Anwesenheit von Knochen metastasist mit spezifischen Zelllinien und Bedingungen. Yang et al. Haben berichtet, dass subkutane Injektion von GFP-positiven PC3 Zellen weit verbreitet verursachen Knochenmetastasen 7 und Schwanzvenen und Interkardial Injektionen sind auch generiert Knochenmetastasen Entwicklung 9.8. Die Haupteinschränkungen dieser Modelle beziehen sich auf das Fehlen eines Primärtumors, die sich innerhalb der Prostata sich. Ferner für Modelle angewiesen auf Injektion von Krebszellen in den Kreislauf, umgeht dies die gesamte erste Hälfte der metastatischen Kaskade. Es schließt damit erste Schritte der Prüfung, einschließlich der Invasion durch die primäre Organ, das biologisch entscheidende Maßnahmen des metastasierten Transformation sind. Viele Aufsichtsbehörden von metastasierendem Transformation direkt auf frühen Zellinvasion. Frühe Schritte der metastatischen Kaskade bilden hohe Priorität Websites für therapeutische Targeting, wie einst Krebszellen verbreiten, dehnt klonalen Variante stark, wodurch biologische Erhöhungal Vielfalt und abnehm wirksamen therapeutischen Targeting. In einem Versuch, um viele der Einschränkungen dieser Modelle zu reagieren, hat unserem Labor eine orthotope Modell der menschlichen PCa in dem der menschliche PCa PC3-M-Zelllinie direkt in die Prostata von Balb / c-Mäusen ohne Thymus implantiert entwickelt. Nach 4-6 Wochen können Tumorgröße, Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) und Metastasen in der Lunge und Lymphknoten alle quantifiziert werden. Wir haben effektiv verwendet dieses Modell, um die Wirksamkeit zu bewerten 4 &#39;,5,7-Trihydroxyisoflavon (Genistein) die menschliche PCa 10 Metastasen hemmen. Nahrungsverbrauch von Genistein in Verbindung gebracht wurde, um in Prostata-Krebsmetastasen und Tod 11-12 abnimmt, aber bisher keine Studie hatte festgestellt, ob die Verabreichung von Genistein konnte PCa Metastasen bei Tieren oder Menschen zu verändern. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass die Behandlung mit Genistein die Anzahl der Lungenmetastasen stark reduziert. Darüber hinaus haben wir festgestellt Genistein alNamen die Aktivierung und Expression von mehreren wichtigen pro-metastatischen Proteine ​​im Primärtumor, einschließlich Focal Adhesion Kinase (FAK), p38 Mitogen-aktivierte Proteinkinase (p38 MAPK) und Hitzeschockprotein 27 (HSP27). Diese Ergebnisse entsprachen mit den Beobachtungen in der Klinik. Mit Blut aus den Mäusen erhalten, waren wir in der Lage, die Blutkonzentrationen von Genistein genau zu messen und zu beobachten, um diese ähnlich Spiegel bei Menschen mit regelmäßigen Nahrungsverbrauch von Genistein sein. Zusätzlich wurde eine Phase-II-Studie, die von unserer Gruppe durchgeführt, festgestellt, dass bei der Behandlung mit Genistein, Männer einen Rückgang der Prostatagewebe mRNA-Expression von Genen, die mit Zellinvasion und Metastasierung assoziiert, insbesondere Matrix-Metalloproteinase-Typ-2 (MMP-2) 13. Wir haben auch dieses Modell, um die Auswirkungen der veränderten Gen-Produkt-Expression in den Primärtumor auf die menschliche PCa Metastasierung 14 zu beurteilen. Der Tumor suppressor endoglin ist ein Mitglied der TGF-Superfamilie und unterdrückt menschlichen PCa zelluläre Invasion in vitro über Änderung der Smad Signal 15. Wir erweitern diese Studien, um die Wirkung auf die menschliche PCa endoglin Metastasen zu bestimmen. Stabile endoglin Knockdown, Vektorregelung oder endoglin Überexpression Zelllinien wurden in Mäuse implantiert. Endoglin Knockdown-Zellen zeigte die höchste Anzahl von Lungenmetastasen sowie CTC in 38% der Mäuse. Mäuse mit implantierten Steuervektor zeigte eine mittlere Antwort mit weniger Lungenmetastasen pro Maus und CTC in nur 18% der Mäuse. Hohe endoglin implantierten Mäuse zeigten fast vollständige Unterdrückung der Lungenmetastasen und vollständige Unterdrückung der CTC. Dies sind nur zwei Beispiele für die Vielzahl von Anwendungen hat diese Technik. Von der Wirkstoffentwicklung, Modellierung Veränderungen in der Molekularbiologie, bietet dieses Modell eine hohe Durchsatzverfahren zur Bewertung der Auswirkungen der verschiedenen Funktionen auf das Tumorwachstum und Maulwurfsondere Änderungen Gegenwart CTC und die Bildung von Metastasen verschiedene in der Lunge und Lymphknoten.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>309659</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>23 G 3/4 Precison Glide Needle</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>305143</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30 G 1/2 Precision Glide Needle</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Wipes</td>
 <td>Triad</td>
 <td>10-3001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>427630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clips, 9mm</td>
 <td>VWR</td>
 <td>15431-673</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Convertors Polyline Towel (Sterile)</td>
 <td>Cardinal Health</td>
 <td>3520</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>23-400-125</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curad Sterile Cotton Balls</td>
 <td>VWR</td>
 <td>500043-544</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4")</td>
 <td>VWR</td>
 <td>95039-192</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves</td>
 <td>Cardinal Health</td>
 <td>2D72PN70</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Germinator 500</td>
 <td>Cell Point Scientific</td>
 <td>SN 7030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle</td>
 <td>Tyco</td>
 <td>1180528012</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Medium Heating Pad </td>
 <td>VWR</td>
 <td>100229-094</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2")</td>
 <td>VWR</td>
 <td>94000-000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metric/English Vernier Caliper</td>
 <td>VWR</td>
 <td>19155-057</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27"</td>
 <td>Ethicon</td>
 <td>Z304H</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VetEquip Inhalation Anesthesia System</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Contact Your Animal Facility for Availability</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VWR Premium Tissue Cassettes</td>
 <td>VWR</td>
 <td>18000-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2")</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-440</td>
 <td></td>
 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Betadine Surgical Scrub</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>19-027132</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Buprenex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Controlled Substance - Obtain from Animal Facility</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dako DAB + Chromagen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K3468</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dako Envision Kit Protein Block</td>
			<td>Dako</td>
			<td>X0909</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95042-908</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Mayer</td>
			<td>MH580-2.5L</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Meloxican</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtain from Animal Facility</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nembutal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Controlled Substance - Obtain from Animal Facility</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rneasy RNA Isolation Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtain from Animal Facility</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Taqman Reverse Transcription Reagents</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N8080234</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

an orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis

Unser Labor hat eine neuartige orthotopen Implantation Modell der menschlichen Prostatakrebs (Prostatakarzinom) entwickelt. Als PCa Tod nicht auf den Primärtumor, sondern die Bildung von verschiedenen Metastasen, von hohem Wert ist die Fähigkeit, diese Fort effektiv modellieren vorklinisch. In diesem Modell werden die Zellen direkt in die Bauchlappen der Prostata in Balb / c-Mäusen ohne Thymus implantiert, und für 4-6 Wochen fortschreiten. Bei Experiment Beendigung kann mehrere verschiedene Endpunkte gemessen werden, wie z. B. Größe und molekulare Charakterisierung des Primärtumors, dem Vorhandensein und die Quantifizierung von zirkulierenden Tumorzellen in Blut und Knochenmark, und die Bildung von Metastasen in der Lunge. Neben einer Vielzahl von Endpunkten, bietet dieses Modell ein Bild von einer Fähigkeit, Zellen eindringen und die Flucht der Hauptorgel, geben Sie und überleben in das Kreislaufsystem und Implantat und wachsen in einem sekundären Standort. Dieses Modell wurde verwendet, um effektiv zu messen metastasiertemReaktion auf beide Änderungen in der Proteinexpression sowie der Reaktion auf kleine molekularer Therapeutika, in einer kurzen Bearbeitungszeit.

Für dieses Experiment zeigen wir eine repräsentative Gruppe von Mäusen während dieser chirurgischen Verfahren erhalten. Fünf Mäuse wurden mit GFP-positive M PC3-Zellen, die ein Steuervektor implantiert. Tumoren ließ man sechs Wochen lang wachsen, und dann wurden mehrere Parameter ausgewertet. In Fig. 1A und 1B zeigen wir die Änderung des Körpergewichts und der Nahrungsaufnahme bei Mäusen auf. Es gibt ein kleines Bad im Körpergewicht und Nahrungsaufnahme um das Datum der Operation wegen der Narkose. Im Verlauf des Experiments, Körpergewicht langsam zu postoperativen und beginnt gegen Ende des Experiments zurück als Tumorlast eine kritische Höhe erreicht, dann. Dies wird durch die Nahrungsaufnahme in diesen Mäusen abgestimmt. In den Fig. 2A und 2B sind Vertreter bezogen Tumorgrößen dargestellt. Einzelne Tumorgrößen variieren, aber im Durchschnitt wir Tumoren von etwa 1 Gramm zu erreichen, mitnormale Abweichung zwischen 0,5-1,5 g, und einer Tumorgröße von 1 cm 2, mit einem normalen Varianz von 0,5-1,5 cm 2. Obwohl die Größe der Tumoren variiert, diese nicht mit der Anzahl der resultierenden Metastasierung, beide in diesem Papier und unserer früher veröffentlichten Arbeiten 10 gezeigt korreliert. Jedoch von diesem Modell, kann die Wirkung der Arzneimittelbehandlung oder molekularen Veränderungen im Tumorgewicht und Größe zu bestimmen. Ein wichtiger Gesichtspunkt bei diesem Modell ist, wenn der entsprechende Endpunkt für das Experiment ist. In den Fig. 2C und 2D zeigen wir Veränderungen in Tumorgewicht und Tumorgrösse in einer bestimmten PC-3-M-Zelllinie, die stabil mit GFP und einer Steuervektor transfiziert 4 Wochen und 6 Wochen. In den letzten zwei Wochen stieg die durchschnittliche Tumorgewicht 2,7 fach, und die Tumorgröße 1,9 fache. Dies zeigt der Zusatz von 1-2 Zusatz Wochen auf das Experiment kann dramatisch beeinflussen Ergebnisse. Eine Vielzahl von Faktoren können das Wachstum der Tumoren, einschließlich alterdas Alter und die Größe von Mäusen, die Anzahl der Durchgänge der Zellen etc. empfehlen wir, nicht beendet, bis Experimenten sichtbar Tumoren werden in der Mehrzahl der Mäuse beobachtet. In den Figuren 3A-3C wird die Anzahl der Metastasen drei verschiedene Arten quantifiziert. In Fig. 3A ist die Gesamtzahl GFP-positiver Zellen menschlichen PCa dargestellt. In Fig. 3B ist die Anzahl der Zellorte oder Orte, an denen metastatische Ablagerungen vorhanden sind, gezeigt. Schließlich ist in Fig. 3C, die Anzahl der verschiedenen Metastasen, wie durch einen deutlich gebundene Gruppe von Zellen, die 5 oder mehr GFP-positive menschliche PCa Zellen definiert ist, angezeigt. Repräsentative Bilder von diesen verschiedenen Bedingungen sind in den Figuren 4A-4D gezeigt. In Fig. 4A ist eine einzelne Zelle bei 40-facher Größe mit einem Pfeil markiert. Beachten Sie die braune Färbung und große deutlichen Kernen. Eine benachbarte Lungen Abschnitt gefärbt mit H &amp; E-Färbungist in Fig. 4B gezeigt, was bestätigt, dass ohne GFP, ist die Detektion von Krebszellen noch gut erreichbar ist. Dieses Foto wird bei 40-facher Grße genommen, und die Zelle ist mit einem Pfeil markiert. In Figur 4C sind mehrere Loci unterschiedlicher Zellzahl bei 10-facher Grße angezeigt und jeder Locus mit einem Pfeil markiert. . Schließlich, in 4D, eine Anzahlung von 10 metastatischen Zellen gezeigt. Wie diese Methoden beeinflussen die Daten durch Unterschiede in der Maus 1 und Maus 3 dargestellt. Maus 1 hat eine niedrigere Gesamtzahl von Zellen in der Lunge, mit einem Durchschnitt von 21,5 Zellen pro Lungenabschnitt, im Vergleich zu Maus-3, die einen Durchschnitt von 700 Zellen pro Lungenschnitt hat. Hat Maus 3 jedoch weniger Loci, oder Orte, an denen Zellen vorhanden als Maus 1 sind. Maus 3 relativ wenigen Stellen von Metastasen, aber die Anzahl von Zellen pro Flächeneinheit sehr hoch bei 82 Zellen pro Loci durch mehrere sehr große Anzahl von Zellen Metastasen. Im Gegensatz Maus 1 hat mehr einzigartige Loci, aber deutlich fEwer Zellen pro Lage nur durchschnittlich zwei Zellen pro Lage. Diese verschiedenen Parameter können Licht auf die Kinetik der Zellen Handel in die Lunge und ihre Fähigkeit, zu wachsen beginnen und sich vermehren zu vergießen. Zusätzlich in 3D, zeigen wir Veränderungen in Gesamt metastatischen Zellen pro Lunge bei Mäusen an vier gegen 6 Wochen seziert. Wie in den 2C und 2D beschrieben wurde, sind wesentliche Änderungen im Tumorgewicht und-größe in der letzten zwei Wochen des Experiments beobachtet. Dies ist in Fig. 3D rekapituliert. Mäuse vier Wochen seziert zeigten keine Metastasen Entwicklung, während Mäuse, 6 Wochen zeigte metastatischen Zellen in allen Mäusen bewertet. Dies zeigt weiter die Bedeutung der Gewährleistung Nekropsien Mäuse sind in einem späten Stadium Endpunkt durchgeführt, um sicherzustellen, Bildung von Metastasen aufgetreten ist. Eine zusätzliche Messung in diesem Modell ist molekularen Veränderungen innerhalb der auftretende<html> Primärtumor. In Fig. 5A-5C zeigen wir beispielsweise drei qRT / PCR-Experimente Messung von drei Gene von Interesse in metastatischen Progression, Matrix-Metalloproteinase-Typ-2 (MMP-2), Matrix-Metalloproteinase-Typ 9 (MMP-9) und Hitzeschockprotein 27 (HSP27) jeweils. Jedes Gen von Interesse über qRT / PCR gemessen wird, kann mit dieser Technik nachgewiesen werden. Zusätzlich können Protein-Ebene unter Verwendung von Western-Blot-Verfahren quantifiziert werden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Beobachtete Körpergewicht und Nahrungsaufnahme bei Tieren. AB) Körpergewicht in Gramm oder durchschnittliche Lebensmittelverbrauch pro Maus pro Tag in Gramm, wird während des Experiments aufgezeichnet und in A gezeigt) und B) auf. fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50873/50873fig2.jpg &quot;/&gt; 2. Tumorgröße und Tumorgewicht in Einzel-und Gruppen von Mäusen. AB) Tumorgewicht in Gramm und die Tumorgröße in Zentimetern von fünf repräsentativen Kontrollmäuse und der Durchschnitt der fünf Mäuse am Ende von sechs Wochen quadriert in A gezeigt) und B) sind. CD) Ein Vergleich der Tumorgewicht in Gramm und Tumorgröße in Zentimetern zwischen Gruppen von Mäusen seziert Quadrat in vier bis sechs Wochen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50873/50873fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50873/50873fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig3.jpg" /> 3. Metastasierung in Einzel-und Gruppen von Mäusen. AC) Die durchschnittliche metastasierendem spread pro Lunge Abschnitt fünf einzelnen Mäusen und der Durchschnitt der fünf Mäuse am Ende von sechs Wochen entweder als Gesamtzahl der Zellen (A), des Orts von metastatischen Zellen (B), oder als getrennte Metastasierung von 5 + Zellen definiert sind eine klar definierte Cluster (C). D) Ein Vergleich der durchschnittlichen Anzahl der metastatischen Zellen pro Lunge Schnitt pro Maus zwischen Mäusen seziert an vier und sechs Wochen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50873/50873fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50873/50873fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig4.jpg" /> 4. Repräsentative Bilder der Lungenmetastasen. A) Ein einzelner GFP-positive Lungenzell bei 40X-Objektiv ist mit einem Pfeil. B markiert) Eine benachbarte LungenSchnitt von A), welches die gleiche Zelle unter H &amp; E-Färbung. c) ein Lungenabschnitt zu 10X-Objektiv mit sieben einzelnen Loci, die unterschiedliche Zahlen von Zellen. D) Eine deutliche Metastasierung bei 10X-Objektiv mit 10 Krebszellen eindeutig als eine Gruppe definiert. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50873/50873fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50873/50873fig5.jpg" /> 5. PCR-Analyse der drei metastasierendem Gene von Interesse. QRT / PCR wurde auf einzelnen Tumorproben von Mäusen nach sechs Wochen gesammelt durchgeführt. Relative mRNA-Transkript Konzentrationen von MMP-2 (A), MMP-9 (B) und HSP27 (C) gemessen, normiert auf GAPDH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50873/50873fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Dieses Modell der orthotopen menschlichen Prostatakrebs ermöglicht die Quantifizierung der Tumorgröße, zirkulierenden Tumorzellen und die Bildung von Metastasen in unterschiedlichen Lungen. Wie Zellen müssen das primäre Organ zu entkommen, in die Blutbahn, und implantieren in einem sekundären Standort dieses Modell effektiv rekapituliert das Szenario in den Menschen.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

an-orthotopic-murine-model-of-human-prostate-cancer-metastasis

Research

JoVE Journal

Medicine

35.0K Aufrufe.  Northwestern University.  Dieses Modell der orthotopen menschlichen Prostatakrebs ermöglicht die Quantifizierung der Tumorgröße, zirkulierenden Tumorzellen und die Bildung von Metastasen in unterschiedlichen Lungen. Wie Zellen müssen das primäre Organ zu entkommen, in die Blutbahn, und implantieren in einem sekundären Standort dieses Modell effektiv rekapituliert das Szenario in den Menschen. 

Serie: An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Einem orthotopen Modell des Murine Blasenkrebs

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Forschung

Medizin

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex process that can involve many tissue types, span variable time periods, and often occur deep within organs, making it difficult to investigate and quantify. In addition, the efficacy of the metastatic process is influenced by multiple steps in the metastatic cascade making it difficult to evaluate the contribution of a single aspect of tumor cell behavior. As a consequence, metastasis assays are frequently performed in experimental animals to provide a necessarily realistic context in which to study metastasis. Unfortunately, these models are further complicated by their complex physiology. The chick embryo is a unique in vivo model that overcomes many limitations to studying metastasis, due to the accessibility of the chorioallantoic membrane (CAM), a well-vascularized extra-embryonic tissue located underneath the eggshell that is receptive to the xenografting of tumor cells (figure 1). Moreover, since the chick embryo is naturally immunodeficient, the CAM readily supports the engraftment of both normal and tumor tissues. Most importantly, the avian CAM successfully supports most cancer cell characteristics including growth, invasion, angiogenesis, and remodeling of the microenvironment. This makes the model exceptionally useful for the investigation of the pathways that lead to cancer metastasis and to predict the response of metastatic cancer to new potential therapeutics. The detection of disseminated cells by species-specific Alu PCR makes it possible to quantitatively assess metastasis in organs that are colonized by as few as 25 cells. Using the Human Epidermoid Carcinoma cell line (HEp3) we use this model to analyze spontaneous metastasis of cancer cells to distant organs, including the chick liver and lung. Furthermore, using the Alu-PCR protocol we demonstrate the sensitivity and reproducibility of the assay as a tool to analyze and quantitate intravasation, arrest, extravasation, and colonization as individual elements of metastasis.

Using quantitative PCR, we demonstrate how the well-established chick CAM model can be used to quantitatively analyze the metastasis of human tumor cells to distant organs.

Quantitative Analyse von Krebs Metastasen mit einem Vogelembryo Modell

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

Kombination Strahlentherapie in einem orthotopen Maus Brain Tumor-Modell

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Einem orthotopen Blasentumor Modell und der Auswertung der intravesikalen Behandlung SÄRNA

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Ein orthotopen Mausmodell des Anaplastic Schilddrüsenkarzinom

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Ein orthotopen Blasenkrebs-Modell für Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Bioluminescent orthotopen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.