Forschung zur Erblindung verhindern; Experimentelle Unterstützung von Takayuki Nagasaki; Diese Forschung entspricht der ARVO Statement für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Visual Research. KJW durch die NIH Zuschüsse 5T32EY013933 und 5T32DK007647-20 unterstützt. VBM wird durch NIH K08EY020530 unterstützt.

Ein. Montieren Sie Geräte für den subretinalen Injektion <ol><li> Kauf oder eine 100 Mikrometer Durchmesser Nadel aus einer Glaskapillare. Dies kann manuell mit Hilfe eines P-97 Sutter Pipette Abzieher oder ähnliche Ausrüstung durchgeführt werden. Das Ende des Kapillarrohrs wird erhitzt und gezogen werden kann, bis er den gewünschten Durchmesser (100 um) erreicht. Ein kleinerer Durchmesser Nadel kann für die Gentherapie-Vektoren verwendet werden, jedoch ist dies die empfohlene Durchmesser für Zellinjektion ohne Schädigung der Zellen oder des Auges. Verglichen mit Stahlnadeln weist das Glas Kapillarnadel einen sehr feinen, jedoch stumpfe Spitze, zur Visualisierung der Injektionsflüssigkeit und Zugang zum Subretinalraum ohne retinalen Brechen ermöglichen. Reinigen Sie diese gezogen Nadeln bei Bedarf unter Verwendung von 70% igem Ethanol, und speichern Sie in einem sterilen Behälter. A 15 cm sterile Gewebekulturschale mit Klebeband, um die Nadeln in Position zu halten ist eine Art und Weise, halten die Injektionsnadeln abgedeckt und in einer sterilen Umgebung um. An diesem Punkt, komplete den Aufbau innerhalb des chirurgischen Raum, in dem das Verfahren stattfindet. Am einfachsten ist es, alle Geräte im Operationssaal zu allen Zeiten, damit es zu bleiben steril zu halten, vor allem, wenn dieses Verfahren innerhalb einer Barriere Anlage durchgeführt wird. </li><li> Anzusaugen Silikon in die Injektionsnadel und Auswerfen der Silikon um eine Beschichtung entlang der Innenwände der Nadel zu verlassen. Die Silikonbeschichtung maximiert den Durchtritt von Zellen und Viren durch die Nadelbohrung, die ansonsten zu den inneren Wänden würde Glaskapillare kleben. </li><li> Erhalten etwa 8 cm Länge von sterilen Kunststoffschlauch durch Schneiden eines 25 ¾-Gauge Blutentnahme mit Luer-Lock an dem Punkt eingestellt direkt nach der Nadel (Entfernen der Nadel aus der Schläuche). </li><li> Füllen Sie eine 1 ml Sub-Q 26 5/8-gauge Slip-Spitze Spritze mit steriler Kochsalzlösung und entfernen Sie die Nadel aus der Spritze. </li><li> Befestigen der Injektionsnadel an dem abgeschnittenen Ende des Kunststoffschlauchs und befestigen die Spritze mit dem Luer-Lock an dem anderenEnde. </li><li> Anzusaugen steriler Kochsalzlösung, um die toten Raum in der Rohrleitung und Kapillarnadel Ausschleudern einige Kochsalzlösung durch die Nadel, um sicherzustellen, dass sie korrekt ohne Leckage befestigt füllen. Weiter aspirieren eine kleine, ungefähr 1 ul Luftmenge in die Spitze der Injektionsnadel. Dadurch wird die Salzlösung aus der Injektionsflüssigkeit zu trennen und einen visuellen Hinweis, der das Ende der Injektionsflüssigkeit während der chirurgischen Prozedur. Das Injektionsgerät sollte auf einer sauberen Oberfläche hinunter mit 70% Ethanol während der chirurgischen Prozedur abgewischt gehalten werden. Außerdem sollten alle Einrichtung während der chirurgischen Prozedur verwendet sowohl vor und nach mit 70% Ethanol gereinigt werden, für die Ausnahme der Injektionsnadeln, die bereits steril gehalten und einsatzbereit sein sollen. Diese Nadeln sollten nach der Operation beseitigt werden, und nicht wieder verwendet werden. </li><li> Schließlich anzusaugen Injektionslösung, enthaltend die gewünschte verpackte Gentherapie viralen Vektor oder Stammzellen. Dies kann geschehen durchAufnehmen der Injektionslösung in einem sterilen Pipettenspitze, dann Pipettieren der Lösung auf die Oberfläche eines sterilen Zellkulturschale. Die Lösung kann nun problemlos in die Injektionsnadel mit der Spritze abgesaugt werden kann. Die benötigte Menge wird abhängig vom Alter des Maus variieren. Für unsere Zwecke verwenden postnatalen Tag 5 Mäusen, die mit 0,5 bis 0,8 ul Injektionsflüssigkeit injiziert werden kann. Kleinere Mengen, 0,5 ul oder weniger, für jüngere Mäusen und größere Mengen, wie 1 ul verwendet werden kann, kann für erwachsene Mäuse verwendet werden. Der virale Titer oder Anzahl der Zellen benötigt, um basierend auf den Virus / Zellen injiziert und ihre gewünschten Zielgewebe bestimmt werden können, da zu viele virale Partikel oder Zellen in einem kleinen Volumen der Toxizität für die Zellen der Netzhaut führen. In dem Video zur Visualisierung, haben wir 1,5 ul, eine größere Menge an Farbstoff als notwendig, um in das Auge injiziert verwendet. </li></ol> 2. Zugriff auf den subretinalen Raum <ol><li> Innerhalb des sterilen OP-Raum,stabilisieren oder zu betäuben die Maus nach dem örtlich genehmigten Umgang mit Tieren Protokoll, das durch das Alter der Maus variieren. Gemeinsame Anästhesie für erwachsene Mäuse umfasst die Verwendung von Gas oder einem Isofluran intraperitoneale Injektion von 0,1 ml/10g Körpergewicht Ketamin (100 mg / ml) und Xylazin (20 mg / ml) in steriler Kochsalzlösung. Für perinatalen Mäusen, gehören gemeinsame Anästhesietechniken die Verwendung von Isofluran Gas oder cryoanesthesia (Hypothermie). Alle Anästhesietechniken muss von Ihrem lokalen IACUC Ausschuss vor genehmigt werden. Wir verwenden typischerweise postnatalen Tag (P) 5 Mäusen, obwohl ähnliche Techniken an Mäuse im Alter von P0 oder an erwachsenen Mäusen angewendet werden können. Der chirurgische Eingriff kann erst beginnen, wenn die Maus nicht mehr bewegen die Gliedmaßen und reagiert nicht mehr auf Prisen Fuß. Für perinatalen Mäusen, werden sie merklich heller in der Farbe, da der Blutfluss verlangsamen, eine andere Taste, um zu wissen, dass sie vollständig unter Narkose sind. </li><li> In perinatalen Mäusen, verwenden Vannas geraden Schere make eine ungefähre 1,5 mm Inzision entlang der geschlossenen Lidspalte. Seien Sie vorsichtig bei der Vertiefung, wo das Auge natürlich in die Zukunft öffnet geschnitten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Lider heilen und öffnen Sie richtig bei der Entwicklung der Maus. Chirurgische Klinge kann für diesen Zweck verwendet werden, obwohl wir Vannas Schere da sie das Risiko von Punktieren des Auges während dieser Vorgang weniger bevorzugen. In dem Video wurden die Schere direkt Punktion und Schnitt entlang der Lidrand verwendet. Beim Lernen dieser Technik sollte verwendet werden, um die Zangen Augenlids vor dem Schneiden heben und das Risiko der Beschädigung des Auges werden. </li><li> Auseinanderziehen die Augenlider mit gebogenen Kornzange das Auge proptose und kneifen die Augenlider leicht unterhalb des Auges zu halten proptosed zur Injektion. Wenn der Deckel Einschnitt in Schritt zwei gemacht zu groß ist, wird das Auge schlüpfen wieder unter den Deckeln und damit eine ausreichende Belichtung während der Injektion. Für erwachsene Mäuse, mit leichtem Druck um die Augen mit drEssing Pinzette halten kann das Auge für die Injektion proptosed. </li><li> Machen Sie eine kleine Sklera Einschnitt am oder hinter dem Globus Äquators durch Kratzer auf der Oberfläche mit einem 15-Grad-Mikrochirurgie Klinge. Dieser Einschnitt sollte nur groß genug, um die Spitze der Injektionsnadel passieren, aber nicht größer als die. Falls gewünscht, kann eine kleine, spitze Nadel wie einer Akupunkturnadel verwendet, um dieses Einschnitts in den subretinalen Raum anstelle der Mikrochirurgie Klinge herzustellen. In dunkel pigmentierten Tieren wird eine dunkelbraun-pigmentierten Gewebebereich (die Aderhaut-Netzhautpigmentepithels) sichtbar an der Stelle des Einschnitts. In leichteren pigmentierte oder Albinomäusen, kann eine chirurgische Markierungsstiftes zur Spitze der Klinge Mikrochirurgie, um eine Tinte, die den Ort Inzisionsstelle gehandhabt werden können. Wenn klar (Glaskörper) Flüssigkeit Rückflüsse aus dem Inzisionsstelle wurde die Klinge gelegt zu tief und trat in den Glaskörperraum und die therapeutische Viren oder Zellen die intravitreale Raum während der Injektion geben. Für visualizatiauf Zwecke haben wir den Einschnitt zu diesem Punkt in dem Video. Es ist immer noch möglich, eine subretinale Injektion in diesem Fall zu vervollständigen, aber die Netzhautablösung durch die Anwesenheit der Injektionsflüssigkeit verursacht möglicherweise nicht vollständig in dieser Maus zu heilen. Daher muss darauf geachtet werden, nur die äußere Oberfläche des Auges und nicht durch die Retina vor der Injektion geschnitten werden. </li><li> Schieben Sie die Injektionsnadel in die Inzisionsstelle und fördern sie parallel zum äußeren Auges Wand, um den subretinalen Raum geben. Vorrücken zu nahe an der Außenwand oder zu tief innerhalb des Auges wird die Einspritzung in der falschen Stelle zu lenken. Das beste Verfahren zu verstehen, ob die Nadel in der richtigen Position ist, um die Technik zu praktizieren. Üben auf leicht pigmentiert oder Albinomäusen kann helfen, präzise und genaue Injektionen in den subretinalen Raum zu machen. Dies liegt daran, dass die Nadel und der Einspritzfluid sichtbar ist innerhalb dieser Augen. </li><li> Wenden Sie leichten Druck auf den Spritzenkolben und seinGin Injektion des gewünschten Fluids. Wenn die Nadel korrekt in den subretinalen Raum gestellt wird, moderate Gegendruck zu spüren sein. Wenn die Nadel in den Glaskörper, wird es deutlich weniger Gegendruck und möglicherweise etwas Fluid Rückfluß während der Injektion sein. Wenn eine erhebliche Gegendruck, halten die Nadel an Ort und Stelle für mindestens weitere 15 Sekunden vor dem Entfernen der Nadel langsam. Dies ermöglicht es dem hohen Augeninnendruck zu entzerren anstelle des Rückfluss des eingespritzten Virus oder Zellen wieder aus der Einschnittstelle. Ein Teil der Luft und Kochsalzlösung kann in den subretinalen Raum aufgrund des erhöhten Drucks während der Injektion benötigt injiziert werden. Es sollte darauf geachtet, nicht über injizieren Luft oder Kochsalzlösung, da es bündig kann das injizierte Virus oder Zellen aus dem Auge werden. Es ist auch möglich, dauerhafte Netzhautablösung aus dem Vorhandensein von zu viel Flüssigkeit in den subretinalen Raum injiziert verursachen. Zur Visualisierung wurde überschüssiger Farbstoff und Luft injiziert into die subretinalen Raum in dem Video. Es ist deutlich zu sehen, wie ein Teil des Farbstoffes Rücken wird gespült werden aus dem subretinalen Raum, wenn zu viel eingespritzt wird, sondern auch, wie die Luftblase im subretinalen Raum bleibt und nicht in den Glaskörper verschwinden. Dies wurde verwendet, um zu betonen, dass diese Injektionen alle innerhalb der richtigen Stelle des Auges waren, so kann man visualisieren, wie die Nadel den Einschnitt Website eingeben. Alle Injektionen in den subretinalen Raum zu einer vorübergehenden Netzhautablösung aufgrund des Vorhandenseins der Injektionsflüssigkeit. Wenn die Injektion Verfahren korrekt abgeschlossen ist, wird diese temporäre Netzhautablösung innerhalb von 24 Stunden und Mäuse heilen kann für alle weiteren Experimente verwendet werden. Das Auge kann bleiben für etwa eine Woche wegen des chirurgischen Eingriffs weich, so dass eine zweite Einspritzung während dieser Zeit sollte vermieden werden. </li><li> Für neugeborenen Mäusen, verwenden Sie die gebogenen Dressing Pinzette vorsichtig die Augen hinter den Lidern und in die Umlaufbahn. Es kann nützlichfür eine Minute, um zu ermöglichen, um das Virus innerhalb des subretinalen Raumes absetzen und nicht dazu führen, dass aus der Einschnittstelle gespült werden, wenn sanftes Drücken des Auges zurück in seine Umlaufbahn. Nach der Operation eines Tropfens 0,5% Bupivacain (Marcain) bis 0,25% in steriler Kochsalzlösung aus einer 25-Gauge-Nadel verdünnt können an der Injektionsstelle platziert werden. Mäuse zeigen keine offensichtlichen Anzeichen von Leiden nach subretinale Chirurgie und die Verwendung von Bupivacain als langwirksame aktuelles Analgetikum ist seit den letzten drei Jahren reichlich. Mäuse sollten immer nach dem chirurgischen Eingriff überwacht werden, um auf Anzeichen von Stress suchen; wie Infektionen, Schwellungen oder einer Abnahme der normalen täglichen Aktivitäten der Maus. Wenn diese auftreten, sollte der Tierarzt benachrichtigt und weitere Schmerzmittel wie Buprenorphin (0,05 mg / kg) kann als eine intraperitoneale Injektion verabreicht werden. </li><li> Wake the mouse aus der Narkose nach örtlich genehmigten Umgang mit Tieren Protokoll. Die Maus sollte auf einer Heizplatte p gehalten werdenad beizubehalten normale Körpertemperatur, wie es aus der Narkose aufwacht. Der chirurgische Eingriff sollte weniger als fünf Minuten in Anspruch nehmen, nicht mitgerechnet die Zeit für die Maus auf die Anästhesie unterziehen. Daher ist ein Heizkissen nicht während des eigentlichen Verfahrens notwendig, kann aber benötigt, während man das Erlernen der Technik, da das Verfahren eine längere Zeit dauern könnte. Die Maus sollte nicht wieder in einem sauberen Käfig gelegt werden, bis sie begonnen hat sich zu bewegen auf seine eigenen. Für Neugeborene wird sanften Fuß drückt ihnen helfen, in vollem Umfang von der Narkose erholen, und sie sollten ihre rosa Farbe und Bewegung, bevor sie wieder mit der Mutter gelegt zurückzugewinnen. Mäuse sollten im Laufe der Zeit auf Anzeichen von Stress überwacht werden, da zuvor aufgeführten. </li></ol>

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	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Video-Technik enthält Anweisungen zum Ausfüllen des subretinalen Injektion chirurgischen Eingriff erfolgreich, und sicherzustellen, dass die Gentherapie-Vektor oder Stammzellen in der Lage erforderlich sind, um effizient behandeln die Augenerkrankung platziert werden. Diese Technik erlaubt die Targeting von Retinazellen wie RPE oder Photorezeptoren, da es die Gentherapievektoren oder Stammzellen abgeleiteten Geweben stellt sich in der Nähe dieser Zellen. Frühere Verfahren involviert intravitreale Injektionen,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 0,8-1,10 x 100 mm Kapillarrohr (Glas) </td><td> Kimble Glass, Inc. </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge kann stattdessen verwendet werden. Catalog # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td> Silikon </td></tr><tr><td> Dubecco die Phosphate Buffered Saline mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; Blutentnahme-Set </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Sub-Q 265/8G Slip-Tip Spritze </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5-10 ul Finnpipette II Adjustable-Volume Pipetten </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 ul Natürliche abgeschrägten Spitzen </td><td> USA Scientific, Inc. </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 Stereomikroskop </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Style Behandelte Polystyrol Zellkultur Schale </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Gerade Schere </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Gebogene Pinzette mit Serrations Delicate </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 Grad Mikrochirurgie Knife </td><td> Wilsam Ophthalmic Corp </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacain (Carbostesin) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

Der Verlust der Sehkraft betrifft etwa 3,4 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und wird voraussichtlich in den kommenden Jahren zu erhöhen. 1 Kürzlich, Gentherapie und Stammzelltransplantationen sind zu den wichtigsten therapeutischen Ansätzen zur Behandlung von Blindheit infolge degenerativer Netzhauterkrankungen. Verschiedene Formen der autologen Transplantation für altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), wie Iris Pigmentepithel-Transplantation haben ermutigende Ergebnisse erzeugt und klinischen Studien am Menschen sind für andere Formen der Gen-und Stammzelltherapie begonnen. 2 Dazu gehören RPE65 Genersatz Therapie bei Patienten mit angeborenen Amaurose Leber und einem RPE Zelltransplantation Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) in Stargardt-Krankheit. 3-4 Da es mittlerweile Gentherapievektoren und Stammzellen für die Behandlung bei Patienten mit retinalen Erkrankungen ist es wichtig zu überprüfen, diese mögliche Therapien im Tiermodell vor geltenING sie in Studien am Menschen. Die Maus ist ein wichtiges wissenschaftliches Modell zur Prüfung der therapeutischen Wirksamkeit von Vektoren für die Gentherapie und Stammzelltransplantation in die Augen. 5-8 In diesem Video Artikel präsentieren wir eine Technik, um Vektoren für die Gentherapie oder Stammzellen in den subretinalen Raum zu injizieren die Maus Auges minimiert Beschädigung des umgebenden Gewebes.

Eine Zeichnung der Maus Auge mit großen Strukturen als Referenz bezeichnet gezeigt, mit Pfeilen Darstellung der Standorte für beide intravitrealen und subretinale Injektion chirurgischen Eingriffen (Pfeilspitzen, Abbildung 1). Gentherapie-Vektoren, wie das lacZ lentiviralen Vektor (Figur 2), kann unter Verwendung dieser Positionen injiziert werden. Zusätzlich können Stammzellen, wie embryonalen Stammzellen der Maus (Abbildung 3), auch an diesen Stellen in d...

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Diese Operationstechnik veranschaulicht die Injektion von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum des Auges Maus.

Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

32.9K Aufrufe.  Columbia University. Diese Operationstechnik veranschaulicht die Injektion von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum des Auges Maus.

Serie: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

High-Efficiency Transduktion von Liver Cancer Cells von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 Vektoren

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Forschung

Medizin

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

A Novel Surgical Ansatz intratracheale Verabreichung von Wirkstoffen in einem Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

Subretinale Transplantation von MACS gereinigten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die adulte Maus-Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor,

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...