Name: subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye
Uploaded: 2012-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye at JoVE.com

Forschung zur Erblindung verhindern; Experimentelle Unterstützung von Takayuki Nagasaki; Diese Forschung entspricht der ARVO Statement für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Visual Research. KJW durch die NIH Zuschüsse 5T32EY013933 und 5T32DK007647-20 unterstützt. VBM wird durch NIH K08EY020530 unterstützt.

Ein. Montieren Sie Geräte für den subretinalen Injektion <ol><li> Kauf oder eine 100 Mikrometer Durchmesser Nadel aus einer Glaskapillare. Dies kann manuell mit Hilfe eines P-97 Sutter Pipette Abzieher oder ähnliche Ausrüstung durchgeführt werden. Das Ende des Kapillarrohrs wird erhitzt und gezogen werden kann, bis er den gewünschten Durchmesser (100 um) erreicht. Ein kleinerer Durchmesser Nadel kann für die Gentherapie-Vektoren verwendet werden, jedoch ist dies die empfohlene Durchmesser für Zellinjektion ohne Schädigung der Zellen oder des Auges. Verglichen mit Stahlnadeln weist das Glas Kapillarnadel einen sehr feinen, jedoch stumpfe Spitze, zur Visualisierung der Injektionsflüssigkeit und Zugang zum Subretinalraum ohne retinalen Brechen ermöglichen. Reinigen Sie diese gezogen Nadeln bei Bedarf unter Verwendung von 70% igem Ethanol, und speichern Sie in einem sterilen Behälter. A 15 cm sterile Gewebekulturschale mit Klebeband, um die Nadeln in Position zu halten ist eine Art und Weise, halten die Injektionsnadeln abgedeckt und in einer sterilen Umgebung um. An diesem Punkt, komplete den Aufbau innerhalb des chirurgischen Raum, in dem das Verfahren stattfindet. Am einfachsten ist es, alle Geräte im Operationssaal zu allen Zeiten, damit es zu bleiben steril zu halten, vor allem, wenn dieses Verfahren innerhalb einer Barriere Anlage durchgeführt wird. </li><li> Anzusaugen Silikon in die Injektionsnadel und Auswerfen der Silikon um eine Beschichtung entlang der Innenwände der Nadel zu verlassen. Die Silikonbeschichtung maximiert den Durchtritt von Zellen und Viren durch die Nadelbohrung, die ansonsten zu den inneren Wänden würde Glaskapillare kleben. </li><li> Erhalten etwa 8 cm Länge von sterilen Kunststoffschlauch durch Schneiden eines 25 ¾-Gauge Blutentnahme mit Luer-Lock an dem Punkt eingestellt direkt nach der Nadel (Entfernen der Nadel aus der Schläuche). </li><li> Füllen Sie eine 1 ml Sub-Q 26 5/8-gauge Slip-Spitze Spritze mit steriler Kochsalzlösung und entfernen Sie die Nadel aus der Spritze. </li><li> Befestigen der Injektionsnadel an dem abgeschnittenen Ende des Kunststoffschlauchs und befestigen die Spritze mit dem Luer-Lock an dem anderenEnde. </li><li> Anzusaugen steriler Kochsalzlösung, um die toten Raum in der Rohrleitung und Kapillarnadel Ausschleudern einige Kochsalzlösung durch die Nadel, um sicherzustellen, dass sie korrekt ohne Leckage befestigt füllen. Weiter aspirieren eine kleine, ungefähr 1 ul Luftmenge in die Spitze der Injektionsnadel. Dadurch wird die Salzlösung aus der Injektionsflüssigkeit zu trennen und einen visuellen Hinweis, der das Ende der Injektionsflüssigkeit während der chirurgischen Prozedur. Das Injektionsgerät sollte auf einer sauberen Oberfläche hinunter mit 70% Ethanol während der chirurgischen Prozedur abgewischt gehalten werden. Außerdem sollten alle Einrichtung während der chirurgischen Prozedur verwendet sowohl vor und nach mit 70% Ethanol gereinigt werden, für die Ausnahme der Injektionsnadeln, die bereits steril gehalten und einsatzbereit sein sollen. Diese Nadeln sollten nach der Operation beseitigt werden, und nicht wieder verwendet werden. </li><li> Schließlich anzusaugen Injektionslösung, enthaltend die gewünschte verpackte Gentherapie viralen Vektor oder Stammzellen. Dies kann geschehen durchAufnehmen der Injektionslösung in einem sterilen Pipettenspitze, dann Pipettieren der Lösung auf die Oberfläche eines sterilen Zellkulturschale. Die Lösung kann nun problemlos in die Injektionsnadel mit der Spritze abgesaugt werden kann. Die benötigte Menge wird abhängig vom Alter des Maus variieren. Für unsere Zwecke verwenden postnatalen Tag 5 Mäusen, die mit 0,5 bis 0,8 ul Injektionsflüssigkeit injiziert werden kann. Kleinere Mengen, 0,5 ul oder weniger, für jüngere Mäusen und größere Mengen, wie 1 ul verwendet werden kann, kann für erwachsene Mäuse verwendet werden. Der virale Titer oder Anzahl der Zellen benötigt, um basierend auf den Virus / Zellen injiziert und ihre gewünschten Zielgewebe bestimmt werden können, da zu viele virale Partikel oder Zellen in einem kleinen Volumen der Toxizität für die Zellen der Netzhaut führen. In dem Video zur Visualisierung, haben wir 1,5 ul, eine größere Menge an Farbstoff als notwendig, um in das Auge injiziert verwendet. </li></ol> 2. Zugriff auf den subretinalen Raum <ol><li> Innerhalb des sterilen OP-Raum,stabilisieren oder zu betäuben die Maus nach dem örtlich genehmigten Umgang mit Tieren Protokoll, das durch das Alter der Maus variieren. Gemeinsame Anästhesie für erwachsene Mäuse umfasst die Verwendung von Gas oder einem Isofluran intraperitoneale Injektion von 0,1 ml/10g Körpergewicht Ketamin (100 mg / ml) und Xylazin (20 mg / ml) in steriler Kochsalzlösung. Für perinatalen Mäusen, gehören gemeinsame Anästhesietechniken die Verwendung von Isofluran Gas oder cryoanesthesia (Hypothermie). Alle Anästhesietechniken muss von Ihrem lokalen IACUC Ausschuss vor genehmigt werden. Wir verwenden typischerweise postnatalen Tag (P) 5 Mäusen, obwohl ähnliche Techniken an Mäuse im Alter von P0 oder an erwachsenen Mäusen angewendet werden können. Der chirurgische Eingriff kann erst beginnen, wenn die Maus nicht mehr bewegen die Gliedmaßen und reagiert nicht mehr auf Prisen Fuß. Für perinatalen Mäusen, werden sie merklich heller in der Farbe, da der Blutfluss verlangsamen, eine andere Taste, um zu wissen, dass sie vollständig unter Narkose sind. </li><li> In perinatalen Mäusen, verwenden Vannas geraden Schere make eine ungefähre 1,5 mm Inzision entlang der geschlossenen Lidspalte. Seien Sie vorsichtig bei der Vertiefung, wo das Auge natürlich in die Zukunft öffnet geschnitten. Dadurch wird sichergestellt, dass die Lider heilen und öffnen Sie richtig bei der Entwicklung der Maus. Chirurgische Klinge kann für diesen Zweck verwendet werden, obwohl wir Vannas Schere da sie das Risiko von Punktieren des Auges während dieser Vorgang weniger bevorzugen. In dem Video wurden die Schere direkt Punktion und Schnitt entlang der Lidrand verwendet. Beim Lernen dieser Technik sollte verwendet werden, um die Zangen Augenlids vor dem Schneiden heben und das Risiko der Beschädigung des Auges werden. </li><li> Auseinanderziehen die Augenlider mit gebogenen Kornzange das Auge proptose und kneifen die Augenlider leicht unterhalb des Auges zu halten proptosed zur Injektion. Wenn der Deckel Einschnitt in Schritt zwei gemacht zu groß ist, wird das Auge schlüpfen wieder unter den Deckeln und damit eine ausreichende Belichtung während der Injektion. Für erwachsene Mäuse, mit leichtem Druck um die Augen mit drEssing Pinzette halten kann das Auge für die Injektion proptosed. </li><li> Machen Sie eine kleine Sklera Einschnitt am oder hinter dem Globus Äquators durch Kratzer auf der Oberfläche mit einem 15-Grad-Mikrochirurgie Klinge. Dieser Einschnitt sollte nur groß genug, um die Spitze der Injektionsnadel passieren, aber nicht größer als die. Falls gewünscht, kann eine kleine, spitze Nadel wie einer Akupunkturnadel verwendet, um dieses Einschnitts in den subretinalen Raum anstelle der Mikrochirurgie Klinge herzustellen. In dunkel pigmentierten Tieren wird eine dunkelbraun-pigmentierten Gewebebereich (die Aderhaut-Netzhautpigmentepithels) sichtbar an der Stelle des Einschnitts. In leichteren pigmentierte oder Albinomäusen, kann eine chirurgische Markierungsstiftes zur Spitze der Klinge Mikrochirurgie, um eine Tinte, die den Ort Inzisionsstelle gehandhabt werden können. Wenn klar (Glaskörper) Flüssigkeit Rückflüsse aus dem Inzisionsstelle wurde die Klinge gelegt zu tief und trat in den Glaskörperraum und die therapeutische Viren oder Zellen die intravitreale Raum während der Injektion geben. Für visualizatiauf Zwecke haben wir den Einschnitt zu diesem Punkt in dem Video. Es ist immer noch möglich, eine subretinale Injektion in diesem Fall zu vervollständigen, aber die Netzhautablösung durch die Anwesenheit der Injektionsflüssigkeit verursacht möglicherweise nicht vollständig in dieser Maus zu heilen. Daher muss darauf geachtet werden, nur die äußere Oberfläche des Auges und nicht durch die Retina vor der Injektion geschnitten werden. </li><li> Schieben Sie die Injektionsnadel in die Inzisionsstelle und fördern sie parallel zum äußeren Auges Wand, um den subretinalen Raum geben. Vorrücken zu nahe an der Außenwand oder zu tief innerhalb des Auges wird die Einspritzung in der falschen Stelle zu lenken. Das beste Verfahren zu verstehen, ob die Nadel in der richtigen Position ist, um die Technik zu praktizieren. Üben auf leicht pigmentiert oder Albinomäusen kann helfen, präzise und genaue Injektionen in den subretinalen Raum zu machen. Dies liegt daran, dass die Nadel und der Einspritzfluid sichtbar ist innerhalb dieser Augen. </li><li> Wenden Sie leichten Druck auf den Spritzenkolben und seinGin Injektion des gewünschten Fluids. Wenn die Nadel korrekt in den subretinalen Raum gestellt wird, moderate Gegendruck zu spüren sein. Wenn die Nadel in den Glaskörper, wird es deutlich weniger Gegendruck und möglicherweise etwas Fluid Rückfluß während der Injektion sein. Wenn eine erhebliche Gegendruck, halten die Nadel an Ort und Stelle für mindestens weitere 15 Sekunden vor dem Entfernen der Nadel langsam. Dies ermöglicht es dem hohen Augeninnendruck zu entzerren anstelle des Rückfluss des eingespritzten Virus oder Zellen wieder aus der Einschnittstelle. Ein Teil der Luft und Kochsalzlösung kann in den subretinalen Raum aufgrund des erhöhten Drucks während der Injektion benötigt injiziert werden. Es sollte darauf geachtet, nicht über injizieren Luft oder Kochsalzlösung, da es bündig kann das injizierte Virus oder Zellen aus dem Auge werden. Es ist auch möglich, dauerhafte Netzhautablösung aus dem Vorhandensein von zu viel Flüssigkeit in den subretinalen Raum injiziert verursachen. Zur Visualisierung wurde überschüssiger Farbstoff und Luft injiziert into die subretinalen Raum in dem Video. Es ist deutlich zu sehen, wie ein Teil des Farbstoffes Rücken wird gespült werden aus dem subretinalen Raum, wenn zu viel eingespritzt wird, sondern auch, wie die Luftblase im subretinalen Raum bleibt und nicht in den Glaskörper verschwinden. Dies wurde verwendet, um zu betonen, dass diese Injektionen alle innerhalb der richtigen Stelle des Auges waren, so kann man visualisieren, wie die Nadel den Einschnitt Website eingeben. Alle Injektionen in den subretinalen Raum zu einer vorübergehenden Netzhautablösung aufgrund des Vorhandenseins der Injektionsflüssigkeit. Wenn die Injektion Verfahren korrekt abgeschlossen ist, wird diese temporäre Netzhautablösung innerhalb von 24 Stunden und Mäuse heilen kann für alle weiteren Experimente verwendet werden. Das Auge kann bleiben für etwa eine Woche wegen des chirurgischen Eingriffs weich, so dass eine zweite Einspritzung während dieser Zeit sollte vermieden werden. </li><li> Für neugeborenen Mäusen, verwenden Sie die gebogenen Dressing Pinzette vorsichtig die Augen hinter den Lidern und in die Umlaufbahn. Es kann nützlichfür eine Minute, um zu ermöglichen, um das Virus innerhalb des subretinalen Raumes absetzen und nicht dazu führen, dass aus der Einschnittstelle gespült werden, wenn sanftes Drücken des Auges zurück in seine Umlaufbahn. Nach der Operation eines Tropfens 0,5% Bupivacain (Marcain) bis 0,25% in steriler Kochsalzlösung aus einer 25-Gauge-Nadel verdünnt können an der Injektionsstelle platziert werden. Mäuse zeigen keine offensichtlichen Anzeichen von Leiden nach subretinale Chirurgie und die Verwendung von Bupivacain als langwirksame aktuelles Analgetikum ist seit den letzten drei Jahren reichlich. Mäuse sollten immer nach dem chirurgischen Eingriff überwacht werden, um auf Anzeichen von Stress suchen; wie Infektionen, Schwellungen oder einer Abnahme der normalen täglichen Aktivitäten der Maus. Wenn diese auftreten, sollte der Tierarzt benachrichtigt und weitere Schmerzmittel wie Buprenorphin (0,05 mg / kg) kann als eine intraperitoneale Injektion verabreicht werden. </li><li> Wake the mouse aus der Narkose nach örtlich genehmigten Umgang mit Tieren Protokoll. Die Maus sollte auf einer Heizplatte p gehalten werdenad beizubehalten normale Körpertemperatur, wie es aus der Narkose aufwacht. Der chirurgische Eingriff sollte weniger als fünf Minuten in Anspruch nehmen, nicht mitgerechnet die Zeit für die Maus auf die Anästhesie unterziehen. Daher ist ein Heizkissen nicht während des eigentlichen Verfahrens notwendig, kann aber benötigt, während man das Erlernen der Technik, da das Verfahren eine längere Zeit dauern könnte. Die Maus sollte nicht wieder in einem sauberen Käfig gelegt werden, bis sie begonnen hat sich zu bewegen auf seine eigenen. Für Neugeborene wird sanften Fuß drückt ihnen helfen, in vollem Umfang von der Narkose erholen, und sie sollten ihre rosa Farbe und Bewegung, bevor sie wieder mit der Mutter gelegt zurückzugewinnen. Mäuse sollten im Laufe der Zeit auf Anzeichen von Stress überwacht werden, da zuvor aufgeführten. </li></ol>

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	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Video-Technik enthält Anweisungen zum Ausfüllen des subretinalen Injektion chirurgischen Eingriff erfolgreich, und sicherzustellen, dass die Gentherapie-Vektor oder Stammzellen in der Lage erforderlich sind, um effizient behandeln die Augenerkrankung platziert werden. Diese Technik erlaubt die Targeting von Retinazellen wie RPE oder Photorezeptoren, da es die Gentherapievektoren oder Stammzellen abgeleiteten Geweben stellt sich in der Nähe dieser Zellen. Frühere Verfahren involviert intravitreale Injektionen,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 0,8-1,10 x 100 mm Kapillarrohr (Glas) </td><td> Kimble Glass, Inc. </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge kann stattdessen verwendet werden. Catalog # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td> Silikon </td></tr><tr><td> Dubecco die Phosphate Buffered Saline mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; Blutentnahme-Set </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Sub-Q 265/8G Slip-Tip Spritze </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5-10 ul Finnpipette II Adjustable-Volume Pipetten </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 ul Natürliche abgeschrägten Spitzen </td><td> USA Scientific, Inc. </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 Stereomikroskop </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Style Behandelte Polystyrol Zellkultur Schale </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Gerade Schere </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Gebogene Pinzette mit Serrations Delicate </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 Grad Mikrochirurgie Knife </td><td> Wilsam Ophthalmic Corp </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacain (Carbostesin) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

Der Verlust der Sehkraft betrifft etwa 3,4 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und wird voraussichtlich in den kommenden Jahren zu erhöhen. 1 Kürzlich, Gentherapie und Stammzelltransplantationen sind zu den wichtigsten therapeutischen Ansätzen zur Behandlung von Blindheit infolge degenerativer Netzhauterkrankungen. Verschiedene Formen der autologen Transplantation für altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), wie Iris Pigmentepithel-Transplantation haben ermutigende Ergebnisse erzeugt und klinischen Studien am Menschen sind für andere Formen der Gen-und Stammzelltherapie begonnen. 2 Dazu gehören RPE65 Genersatz Therapie bei Patienten mit angeborenen Amaurose Leber und einem RPE Zelltransplantation Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) in Stargardt-Krankheit. 3-4 Da es mittlerweile Gentherapievektoren und Stammzellen für die Behandlung bei Patienten mit retinalen Erkrankungen ist es wichtig zu überprüfen, diese mögliche Therapien im Tiermodell vor geltenING sie in Studien am Menschen. Die Maus ist ein wichtiges wissenschaftliches Modell zur Prüfung der therapeutischen Wirksamkeit von Vektoren für die Gentherapie und Stammzelltransplantation in die Augen. 5-8 In diesem Video Artikel präsentieren wir eine Technik, um Vektoren für die Gentherapie oder Stammzellen in den subretinalen Raum zu injizieren die Maus Auges minimiert Beschädigung des umgebenden Gewebes.

Eine Zeichnung der Maus Auge mit großen Strukturen als Referenz bezeichnet gezeigt, mit Pfeilen Darstellung der Standorte für beide intravitrealen und subretinale Injektion chirurgischen Eingriffen (Pfeilspitzen, Abbildung 1). Gentherapie-Vektoren, wie das lacZ lentiviralen Vektor (Figur 2), kann unter Verwendung dieser Positionen injiziert werden. Zusätzlich können Stammzellen, wie embryonalen Stammzellen der Maus (Abbildung 3), auch an diesen Stellen in d...

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Diese Operationstechnik veranschaulicht die Injektion von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum des Auges Maus.

Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

33.1K Aufrufe.  Columbia University. Diese Operationstechnik veranschaulicht die Injektion von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum des Auges Maus.

Serie: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Modell Netzhautablösung in Nagetiere durch subretinale Injektion von Natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Medizin

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

In utero und ex vivo Elektroporation für die Genexpression in Maus retinalen Ganglienzellen

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biologie

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to the interphotoreceptor/subretinal compartment that has direct exposure to photoreceptors and the retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injections of plasminogen as well as recent preclinical and clinical trials have demonstrated safety and/or efficacy of delivering viral vectors and stem cells to individuals with advanced retinal disease. Mouse models of retinal disease, particularly hereditary retinal dystrophies, are essential for testing these therapies. The most common injection procedure in rodents is to use small transcorneal or transcleral incisions with an anterior approach to the retina. With this approach, the injection needle penetrates the neurosensory retina disrupting the underlying RPE and on insertion can easily nick the lens, causing lens opacification and impairment of noninvasive imaging. Accessing the subretinal space via a transcleral, posterior approach avoids these problems: the needle crosses the sclera approximately 0.5 mm from the optic nerve, without retinal penetration and avoids disrupting the vitreous. Collateral damage is limited to that associated with the focal sclerotomy and the effects of a transient, serous retinal detachment. The simplicity of the method minimizes ocular injury, ensures rapid retinal reattachment and recovery, and has a low failure rate. The minimal damage to the retina and RPE allows for clear assessment of the efficacy and direct effects of the therapeutic agents themselves. This manuscript describes a novel subretinal injection technique that can be used to target viral vectors, pharmacological agents, stem cells or induced pluripotent stem (iPS) cells to the subretinal space in mice with high efficacy, minimal damage, and fast recovery.

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Eine Alternative und Validated Injektionsmethode für den Zugriff auf den subretinalen Raum<i&gt; über</i&gt; A Transcleral dorsalen Zugang

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Höchste Auflösung Maus optische Kohärenztomographie, intraokulare Injektion in die retinale Gentherapie Forschung unterstützen

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

Subretinale Transplantation von menschlichem embryonalem Stammzellgewebe in einem katzenartigen Großtiermodell

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

Transpupillengesteuerte transsklerale Transplantation von subretinalen Transplantaten in einem retinalen Degenerations-Mausmodell

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...