We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).

Alle menschlichen Geweben für diese Experimente verwendet wurden, über ein Institutional Review Board genehmigten Protokoll und / oder Freistellung an der Universität von Illinois in Chicago erworben. 1. § frisch gefroren Prostate auf PEN-Rutsche und auf Geladene Glass Slide <ol><li> Am Tag vor oder ein paar Stunden vor dem Schneiden die Probe, saubere Werkzeuge (dh, Pinsel, Pinzette, coplins, Klingen, PEN-gerahmte Dias (falls nicht bereits RNase frei), eine ETOH sicheren Marker und ein Bleistift) und das Innere des einen RT Kryostat mit RNase-Dekontaminationslösung mit einer Sprühflasche und Lab-Wischtücher. <ol><li> Erlauben RNase-Dekontaminationslösung für 5 min vor wischte sitzen, Spülen mit depcH 2 0 auf über RNase-Dekontaminationslösung und eine abschließende Spülung mit 70% EtOH (mit depcH 2 0) hergestellten links entfernen. Hinweis: Es ist wichtig, eine RNase-freie Arbeitsfläche zu erhalten. Alle coplins, Werkzeuge, gefroren Eindeckmedium, Klingen und Folien verwendet werden, sollten nur für RNase freie Arbeiten verwendet werdenund nie in einem Standard-nicht-RNase freien Umgebung verwendet. Alle Instrumente müssen mit einer RNase Dekontaminationslösung vor jedem Experiment behandelt werden. </li></ol></li><li> Coole Kryostaten auf -24 ° C. </li><li> Setzen Sie die folgenden gereinigt RNase frei Instrumente innerhalb Kryostat mindestens 30 Minuten vor dem Schneiden abkühlen: slide Coplin gefüllte mit 100% Ethanol, Werkzeuge, kleine gefrorene Gewebekassetten und Montagezange. </li><li> Abrufen gefrorenen Prostatagewebe aus Kryospeicherung aufnehmen und in einem Trockeneis gefüllten Schaum Eimer für den Transport. Platzieren Gewebe in Kryostat Temperatur angeglichen wird für mindestens 30 min Kryostaten. Hinweis: Human Prostatagewebe für Laser-Capture-Mikrodissektion kann entweder frisch gefroren oder sein in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE). Die Zeitdruck und Objektträgervorbereitung sind etwas anders zwischen Gewebequellen. Hier beschreiben wir die Schritte für die Gefrierschnitten. </li><li> Arbeiten Sie mit einem Gewebe zu einem Zeitpunkt, und spritzen gefrorenen Einschlussmittel in die bottom der Kassette und schnell montieren Sie die gefrorenen Prostatagewebe in den gefrorenen Eindeckmedium mit den gekühlten Pinzette. </li><li> Legen Sie die Kassette mit dem Gewebe auf Kühler in Kryostaten für 5 min auf gefrorenen Eindeckmedium gesetzt. </li><li> Squirt eine kleine Menge gefrorenen Montagemedium auf dem Spannfutter und bis drücken montiert Gewebeunterseite vorsichtig auf dem gefrorenen Eindeckmedium. Lassen Sie in den Kryostaten Set für 5 Minuten, damit das gefrorene Eindeckmedium vollständig zu verfestigen. </li><li> Zeigen Futter in die Halterung ein und ziehen. </li><li> Verriegeln Sie den Griff in Sperrstellung und eine neue Klinge auf den Kryostaten. Für nachgeschaltete molekulare Endpunkte, die einen Verstärkungsschritt umfassen (dh qPCR) ist es ratsam, eine neue Klinge für jeden Patienten zu verwenden, um eine Kontamination zu verhindern (oder bewegen Sie die Klinge über den Bereich des Schaufel für die nächste Probe zu verwenden). </li><li> Entriegeln Sie den Griff und das Gewebe vorsichtig voran mit der Hand oder mit einem Fußpedal zu glätten und setzen das Gewebe mit 50 μm Abschnitte, bis die gewünschte Gewebe Belichtung erreicht ist. </li><li> Passen Kryostaten bis 5 um, schneiden ein oder zwei Abschnitte und legen Sie sie auf geladene Objektträger für die Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung (siehe Schritt 2). </li><li> Sofort platzieren Sie die Folie in die kalte 100% Ethanol für 2 min. </li><li> Entfernen Sie die geladene Objektträger aus Ethanol und trocknen lassen bei RT, bevor Sie mit H &amp; E Färbung (Schritt 2). </li><li> Zeigen RT PEN-Frame-Schieber auf einem Rahmen Fan. </li><li> Passen Kryostaten bis 10 um und Ort Abschnitten auf die RT PEN Rahmen gleitet. Ein bis vier Abschnitte Ort auf jeder Folie je nach Gewebegröße sein. </li><li> Die Folie sofort tauchen Sie ein in der Kälte 100% Ethanol für 2 min. </li><li> Entfernen Sie die PEN-Frame-Folien aus Ethanol und speichern Sie die Folie in einer Dia-Box in einem Exsikkator Feld in einem -80 ° C Gefrierschrank bis bereit LCM. Drei Tage ist die maximale Speicherdauer für eine optimale RNA-Gewinnung. </li><li> Fahren Sie mit Schritt 2 nur für die geladenen Glas geschobene. Fahren Sie mit Schritt 3 für PEN-Frame-Folie. </li></ol> 2. Hämatoxylin und Eosin-Y (H &amp; E) Stain zur histologischen Mark-up Hinweis: Diese, wenn für das Gewebe auf der geladenen Objektträger und den Stift nicht Rahmen Rutsche für LCM. <ol><li> Hydrat in den Abschnitten über die geladene Objektträger Eintauchen der Objektträger durch abgestufte Ethanol wie folgt: Tauchen Sie die Objektträger zweimal in 100% Ethanol für 3 Minuten, zweimal in 95% Ethanol für 3 min, einmal in 70% Ethanol für 3 min und zwei mal in destilliertem H 2 O 3 min. <ol><li> Vorbereitung Säurealkohollösung: 99 ml 70% igem Ethanol + 1 ml 1% HCl und 0,1% ige Natriumbicarbonatlösung: 0,1 g Natriumbicarbonat in 100 ml destilliertem H 2 O </li></ol></li><li> Tauchen Sie die Folie in Hematoxylin Gill II (0,4%) für 5 min. </li><li> Abwaschen überschüssige Beize in Steady fließendem Wasser H 2 O 3 min. </li><li> Tauchen Sie die Objektträger 10 Mal in saurem Alkohol </li><li> In fließendem H 2 O 3 min Waschen Sie die Folie. </li><li> Tauchen Sie den Schiebein 0,1% Natriumhydrogencarbonat-Lösung für 30-60 Sekunden, um die violette Farbe auf blau um. </li><li> In fließendem H 2 O 3 min Waschen Sie die Folie. </li><li> Spülen Sie die Folie in 95% Ethanol mit 10 Dips. </li><li> Tauchen Sie die Folie in Eosin-Y 2-3 mal für 15 sec insgesamt. </li><li> Entwässern die Folie durch abgestufte Ethanol wie folgt: Tauchen Sie die Objektträger zweimal in 95% Ethanol, zweimal in 100% Ethanol und zweimal in Xylol (stellen Sie sicher, das Gewebe wird klar, welche gründliche Entwässerung anzeigt). </li><li> Montieren Sie den Schieber mit nicht-wässrigen permanenten Fest Eindeckmedium und Deckglas. </li><li> Lassen Sie die Folie trocken für 30 Minuten. </li><li> Ein großes, hochauflösendes Bild Scan Rutsche mit jeder ganzen Dia-Scanner und drucken auf 8 &quot;x 11&quot; Papier. </li><li> Gliederung Interessengebiete (in der Regel durch einen Facharzt Pathologen durchgeführt) mit einem Marker. Dieses Markup ist der Leitfaden für die LCM Verfahren. </li></ol> 3. Toluidinblaufärbung des PEN-Frame-Slides Hinweis: Thwird am selben Tag wie der LCM durchgeführt. Verwenden depcH 2 O Wasser für alle Lösungen. Füllen Sie alle Schritte in RNase-free-Bereich. Alle coplins muss mit RNase-Dekontaminationslösung gereinigt werden. <ol><li> Der Tag des LCM entfernen Sie die PEN-Frame-Folien von -80 ° C Gefrierschrank und Hydrat durch flach geneigte Objektträger in 90% EtOH für 2 Minuten, dann 75% EtOH für 2 min. <ol><li> Bereiten Sie 0,5% Toluidinblau durch Auflösen in der molekularen Wasser biology grade dann auswählen, sterilisieren, durch ein 0,2 um-Filter und lagern bei RT. Diese Lösung kann für bis zu 6 Monate weiterverwendet werden. Hinweis: Es wird dringend empfohlen, die Lösung vor, wie die Filtration kann ein paar Stunden dauern vorzubereiten. </li></ol></li><li> Färben das Prostatagewebe durch flach geneigte Objektträger in 0,5% Toluidinblau für 5-30 sec. Entfärben das Gewebe durch Waschen gleitet 2 mal in depcH 2 O für 15 Sekunden, gefolgt von 75% EtOH für 30 Sekunden bis 3 Minuten. Hinweis: Fleck und destain Zeiten können eingestellt werden, um eine gute Färbung zu gewährleisten. Prostate neigt dazu, über Fleck. </li><li&gt; Über PEN-Frame-Folien RNAase freien Trockenbehälter auf Eis. </li></ol> 4. Laser-Capture-Micro-Dissektion (LCM) <ol><li> Unmittelbar vor LCM, trockenen Objektträger auf einer Trägerwärmer bei 42 ° C für 15 min. Chemische nur die Folie, die verarbeitet werden wird und der Rest auf Eis zu lagern, bis für sie bereit. </li><li> Schalten Sie LCM und Computer in dieser Reihenfolge, Mikroskop Macht, der Laserschlüssel, der Laserschalter und dann den Computer ein. Starten Sie die Laser Mikrodissektion Software. </li><li> Verwenden Sie die Software, um das Mikroskop, um die Folien und Sammelröhrchen Laststeuerung. Klicken Sie auf &quot;unload Probenhalter&quot;, legen Sie die Folie mit den Abschnitten auf den Objektträger-Halter mit dem Gewebe nach unten und legen Sie die Objektträgerhalter in den entsprechenden Steckplatz im Mikroskop, klicken Sie dann auf &quot;Weiter&quot;. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;unload Sammelröhrchen&quot;, Label und laden 0,5-ml-Röhrchen auf Rohrhalter und setzen Sie sie in den entsprechenden Steckplatz im Gerät. EinmalKappen gesichert sind, fügen Sie 35 ul Lysispuffer zu den Sammel Kappen und versuchen, Blasen zu vermeiden. Klicken Sie dann auf &quot;OK&quot;. Hinweis: Wenn Verdunstung ist ein Problem, verdünnte den Puffer, wie folgt: 25 &amp; mgr; l Lysepuffer mit 10 ul depcH2O. </li></ol></li><li> In der Software, wählen Sie die Position, in der der Schieber in der Objektträgerhalter gelegt. Wählen Sie die Auffangkappe, um die LCM Probe zu sammeln. </li><li> Visualisieren und konzentrieren sich die Folie durch den Computer zu 10X. Verwenden Sie die Software, um den Laser, indem Sie &quot;Laser&quot; und dann &quot;Kalibrierung&quot; zu kalibrieren. Stellen Sie die Macht, Blende und Geschwindigkeit des Lasers, die Auswahl von &quot;Laser&quot; und dann &quot;Control&quot;, damit der Laserstrahl die vollständig und effizient ausgewählten Bereich zu schneiden. Wiederholen Sie Einstellungen, bis die Laserschnitte vollständig durch das Gewebe. </li><li> Unter Verwendung des 8 &quot;x 11&quot; Pathologen Aufschlag als Leitfaden, benutzen Sie die &quot;Form zeichnen&quot; Werkzeug, um die gewünschten Bereiche der epithe umschreibenlium in der Ansicht und vermeiden Sammeln von Stroma. Hinweis: Mehrere Bereiche können auf einen Blick ausgewählt werden, aber nicht zu einer anderen Ansicht wechseln, ohne erste Schneid indem Sie auf das &quot;cut shape&quot; Werkzeug. <ol><li> Wenn ein Bereich nicht vollständig durch den Laser geschnitten bekommen benutzen Sie die &quot;bewegen und schneiden&quot; Werkzeug, um mehr als es manuell zu gehen. Bewegen Sie weiterhin das Ziel, neue Ansichten und wiederholen Laserschneiden bis Schieber vollständig seziert oder die gewünschte Menge an Gewebe gesammelt wurden (in der Regel 100 gutartigen Drüsen ergeben 150-500 ng RNA). (siehe Beispiel in Abbildung 1A). </li></ol></li><li> Rohre aus der Sammlung Halter vorsichtig heraus, und schließen Sie die Kappen, eingedenk des Lysepuffers und Gewebe in den Kappen. Kurz zentrifugieren für 30 Sekunden, um Flüssigkeit und Gewebe in dem Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 30 min und bei -80 ° C, bis sie zur RNA-Isolierung. </li></ol> 5. Gesamt RNA-Isolierung mit einem Filter-basierten Kit und Qualitätsanalyse <ol><li> Auftauen der Röhrchen auf Eis und bringe das Volumen der Lösung auf 100 ul. </li><li> Pre-nass das Mikrofilter eines RNA-Extraktions-Kit, indem 30 ul ofLysis Lösung auf die Mitte des Filters und lassen Sie es genießen whileperforming die nächsten beiden Schritte (mindestens 5 min). </li><li> In 3 ul LCM Additivlösung (im Kit enthalten) zum Lysat und mischen durch Vortexen für 5 Sekunden. Zentrifugieren für 30 Sekunden, um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Zentrifugieren Sie die vorbenetzt Filter für ~ 30 Sekunden mit Höchstgeschwindigkeit, um Flüssigkeit zu entfernen. </li><li> Hinzufügen 1,25 Volumina (in diesem Fall 129 &amp; mgr; l) von 100% Ethanol zu dem Lysat Mischung sanft Wirbel oder einer Pipette auf und ab. ** Diese Methode wird für große und kleine RNA-Spezies zu erholen. </li><li> Laden der Probe auf die vorbenetzte Mikrofilter und Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min, um die RNA zu dem Filter zu binden. Dann waschen Mikrofilter mit 180 &amp; mgr; l von &quot;Waschlösung 1, R21; Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1 min. Anmerkung: Von diesem Zeitpunkt an alle Zentrifugationen sollte bei 13.000 xg oder maximalen Geschwindigkeit durchgeführt werden. </li><li> Waschfilter zweimal mit 180 ul des &quot;Waschlösungen 2 und 3&quot; bezeichnet, wie durch die Kitprotokoll gerichtet. Zentrifuge für 30 Sekunden, dann entsorgen Sie die Strömung durch, und drehen Sie den Filter für 1 min, um Restflüssigkeit zu entfernen und den Filter trocknen. </li><li> Übertragen Sie Filter, um eine neue Sammelröhrchen. </li><li> Warm Elutionslösung bis -95 ° C (im Kit enthalten). </li><li> Übernehmen 10 ul vorgewärmtes Elutionslösung in die Mitte des Filters, schließen Sie die Kappe und zu speichern für 5 min bei RT. Dann Zentrifuge für 1 min, um die RNA zu eluieren, und wiederholen Sie diesen Schritt einmal nachgeben ~ 20 ul RNA. </li><li> Führen die DNase I-Behandlung für 15 min bei 37 ° C. </li><li> Quantifizierung der RNA durch Spektralphotometer mit Absorption bei 260 nm. Das Verhältnis der optischen Dichte bei Wellenlängen von 260 nm und 280 nm verwendet, um die Reinheit zu beurteilenDie RNA (siehe Tabelle 1) 15. </li></ol> 6. Genexpressionsanalyse Hinweis: Gene Expression lange RNA-Spezies (wie mRNAs und lncRNAs) im Schritt 6.1 und kurze RNA-Spezies (wie miRNAs) gezeigt in Schritt 6.2. Verschiedene Kits sind für die RT-qPCR zur Verfügung und die Menge der RNA erforderlich variiert je nach Kit (so wenig wie 10 ng). RNA-Sequenzierung Analyse ist in 6.3 beschrieben. <ol><li> Revers transkribieren (RT) die RNA in cDNA, indem 5 ul 20 ng / ul RNA-Probe mit 5 &amp; mgr; l des RT Master Mix (RT-Puffer, dNTPs, Zufallsprimer, RT-Enzym, RNase-Inhibitor). Inkubieren der Reaktion für 25 min bei 25 ° C, dann 120 min bei 37 ° C und 5 min bei 85 ° C. </li><li> Verdünnen Sie die RT-Reaktion im Verhältnis 1:10 mit RNase-freiem Wasser und verwenden Sie 2,5 ul pro 10 &amp; mgr; l qPCR Reaktion mit Primer oder Primer / Sondensätze für die Gene von Interesse. Hinweis: Zur Analyse von teilweise abgebauten RNA erleichtern, ist es ratsam, Primer fo verwendenr kürzere Amplikons (weniger als 100 bp) 16. (Tabelle 2B) <ol><li> Für microRNA-Expressionsanalyse führen Sie die RT-Reaktion durch Mischen von 5 &amp; mgr; l von 2-10 ng / ul RNA-Probe mit 5 &amp; mgr; l des RT Master Mix. Hinweis: Jeder handelsüblichen PCR-basierte microRNA-Detection-Technologie erfordert den Einsatz von proprietären und spezifische RT-Primer. </li></ol></li><li> Alternativ oder zusätzlich zur RT-PCR, der nächsten Generation verwenden Sequenzierung (RNA-seq oder kleinen RNA-seq), um verschiedene Arten von RNAs zu quantifizieren. Typischerweise verwenden 500 ng RNA für dieses Verfahren (Tabelle 3) und die Durchführung des Verfahrens, wie vom Hersteller und Nachweisinstrument. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Genexpressionsprofile von Humanproben kann eine Herausforderung sein, nicht nur für die Qualität oder Quantität von Gewebe zur Verfügung, sondern auch für die verschiedenen histologischen in einem bestimmten Gewebeprobe vorhanden Entitäten. Dies ist eine besondere Herausforderung in der Prostata, in der gutartigen Gewebe sind weitgehend stromalen Geweben und Bereichen Krebs frei von Stroma. LCM ermöglicht physikalische Trennung Prostatastroma und Epithel-RNA für eine genauere Signatur der zwei verschiedenen Zell...

Die Prostata ist eine heterogene Gewebe des sekretorischen Epithels in Drüsenacini durch fibromuskuläre Stroma in erster Linie aus der glatten Muskulatur 1 komponiert umgeben angeordnet sind. Basalzellen, sekretorischen Zellen, neuroendokrinen Zellen, Transit Verstärken und Stammzellen 2: Die Epithelzellen Fach besteht aus fünf verschiedenen, aber organisierter Zelltypen besteht. Bei Prostatakrebs (PCa), die sich von den luminalen Epithelzellen entsteht, das Wachstum des Adenokarzinoms bewirkt eine evident allmählichen Rückgang des Stroma 3. Aus diesen Gründen werden Gewebeproben deutliche Unterschiede im Verhältnis von stromalen und epithelialen Zelltyp auf der Basis des Ausmaß der PCa haben. Diese Unterschiede können zu Verzerrungen der Annahmen der Genexpressionsdaten von ganzen Geweben ungeachtet Mikrodissektion der gewünschten Zelltyp gewonnen führen. Daher ist es wichtig, diese Vorspannung zu entfernen, um Zelltypen vor der RNA-Extraktion und TrennungGenexpressionsanalyse. Macrodissection oder Mikrodissektion verwendet werden, um physisch zu trennen gut charakterisierten epithelialen Bereichen von der umgebenden Stroma 4 -6 werden. Macrodissection wird typischerweise mit einer Rasierklinge unter einem Präpariermikroskop gemacht und funktioniert gut zum Trennen großer PCa Knötchen vom Stroma, aber ist nicht fähig zur Entfernung von gutartigen Epithel von umgebenden Stroma (siehe Beispiel benigner Prostata Histologie in Abbildung 1). Mikrodissektion mit einem Laser (LCM) wesentlich arbeitsintensiver als macrodissection, aber sehr genau sezieren gutartige Epithel 4. Aktuelle Veröffentlichungen aus unserem Labor haben gezeigt, dass RNA erfolgreich durch LCM entweder aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Biopsien oder gefrorenen Gewebe 4,7-9 extrahiert werden. Die großen Herausforderungen in LCM-RNA-Extraktion sind 1), genau zu sezieren die gewünschten Bereiche des Gewebes, und 2) zur Erhaltung RNA Integrität während des LCM und Isolierungsverfahren 4,10. RNA aus reinen Zellpopulationen isoliert können zur Genexpressionsanalyse durch mehrere Verfahren einschließlich Reverse-Transkription quantitative PCR (RT-qPCR) 7,8 Microarray 11 und tiefe -sequencing 12-14 verwendet werden. Ziel dieses Protokolls ist es, Gesamt-RNA aus LCM Prostataepithel aus gefrorenem Gewebe zu isolieren, für nachgeschaltete Genexpressionsanalysen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RNase-AWAY&#160;</td>
			<td>MBP</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN-membrane 4,0 mm slides&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11600289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides, Superfrost Plus</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon labs.</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplins (Staining jar)</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>M900-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplins (Staining rack)</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>M905-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperio ScanScope</td>
			<td>Aperio(Leica)</td>
			<td>ScanScope&#174; CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>89640-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection System</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LMD7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Thin-walled Tubes for LCM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAqueous&#174;-Micro Total RNA Isolation Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1931</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368814</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>203301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan microRNA RT kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4366597</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin stain&#160;</td>
			<td>Ricca Chemical Company</td>
			<td>3536-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Richard Allan Scientific&#160;</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-capture microdissection of human prostatic epithelium for rna analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

In einer früheren Studie haben wir gezeigt, die Verwendung von LCM zu epithelialen und stromalen Gewebe zu sammeln, um Expression Profiling durch RT-qPCR von mRNA und microRNA aus gefrorenen und FFPE Prostatagewebe des gleichen Patienten 4 zu vergleichen. LCM ist zeitaufwendig, vor allem, wenn große Menge an RNA ist für die nächste Generation Sequenzierungsanalyse gesammelt werden. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um den Arbeitsraum zu halten und Tools kostenlos RNase. Es wird empfohlen, um die ...

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Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

laser-capture-microdissection-human-prostatic-epithelium-for-rna

Research

JoVE Journal

Medicine

13.3K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago. The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Serie: Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

Dissection of Human Glaskörper Elemente für Proteomanalyse

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Forschung

Medizin

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

Formation of Human Prostate Epithel Mit Tissue Rekombination von Nagetier Urogenitalsinus Mesenchym und menschlichen Stammzellen

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Nierenkapsel Xenografting und subkutane Implantation Pellet für die Beurteilung von Prostata-Karzinogenese und benigne Prostatahyperplasie

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the quality of life. BPH includes 2 major treatments: medication and surgery. Surgical treatment is often the most effective and final intervention. Holmium laser enucleation of the prostate (HoLEP), one of the most efficient surgical procedures for BPH, is conducted transurethrally. During surgery, the most important and most difficult part is to locate the surgical capsule of the prostate, which is consistent to the idea of anatomic surgery. Different skills may be needed in treating different parts of the prostate. HoLEP tends to be efficient and safe with good hemostatic properties, and able to treat bladder calculus, which may be the complications of BPH. The technique is particularly suitable for prostate of varying volumes and sizes. Indeed, HoLEP also presents certain disadvantages, such as a long learning curve and costly equipment. Regardless, this method may be the "new standard" and the excellent method for the surgical treatment of BPH.

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate HoLEP.

Here we present a safe and efficient protocol, holmium laser enucleation of the prostate, to treat benign prostatic hyperplasia.

Chirurgische Behandlung der benignen Prostatahyperplasie: Holmium Laser Enukleation der Prostata (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

Räumliche Quantifizierung von Drogen in der Lungentuberkulose Läsionen durch Laser Capture Microdissection Flüssigkeit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...