Wir sind dankbar, dass Michela de Martino, Wilfred R. Hagen und Kourosh Honarmand Ebrahimi für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung von der Delft University of Technology unterstützt.

1. Dps Expression und Reinigung Beziehen Protein von hoher Reinheit ist ein wichtiger erster Schritt für die DNA-Schutz-Assay. Reinigung von Dps Protein kann in 4 bis 5 Tagen durchgeführt werden. <ol><li> Verwandeln Sie ein Protease-defizienten Stamm von E. coli (wie BL21 (DE3) pLysS) mit einem pET-Vektor (wie pET17), in die der dps-Protein-kodierende Sequenz kloniert wurde. </li><li> Streak die umgewandelten Zellen auf Luria Broth (LB)-Agarplatten, die entsprechenden Antibiotika (zB Ampicillin und Chloramphenicol für die Beispiele in 1,1 gestellt). Die Inkubation über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Impfen einer einzelnen Kolonie von der Platte in 30 ml LB-Medium mit geeigneten Antibiotika. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 200-250 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Impfen 2 x 1 L LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika mit je 10 ml der Übernacht-Kultur. Wachsen bei 37 ° C, unter Schütteln, bis OD 600 </sub&gt; von ca. 0,6. (Wachsende Zellen zu höheren OD erhöht Ausbeute an Protein, ohne merklich zu beeinträchtigen die Reinheit des Endprodukts.) Induzieren die Expression von Dps durch Zugabe von IPTG bis zu einer Konzentration von 0,3 mM und Inkubation bei 37 ° C für 3-4 Stunden unter Schütteln. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 xg für 15 min. Resuspendieren der Zellpellets in 7,5 ml DEAE-Puffer A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) pro Liter der induzierten Zellkulturen. Die Proben können in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C, wenn gewünscht. Das Verfahren kann dann durch Auftauen der Proben in einem Wasserbad bei 4 ° C fortgesetzt </li><li> In ein Gemisch von Protease-Inhibitoren (z. B. Calbiochem Satz III Proteaseinhibitoren bei 0.167 ul pro ml Zellsuspension) zu der Zellsuspension, um den Abbau von überexprimierten DPS verhindern. </li><li> Bereiten zellfreien Extrakt mit einem Französisch Presse. Prime die Französisch Presse mit 20 ml DEAE-Puffer A (bei Verwendung eines Durchfluss-Modell), dann DISRUPt die Probe zweimal bei 20 kpsi. Zentrifuge das Lysat bei 30.000 g für 35 min bei 4 ° C bis unlösliche Partikel zu klären, und speichern Sie den Überstand. Der Überstand kann dann mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C, wenn gewünscht. </li><li> Äquilibrieren eine 30 ml DEAE-Sepharose CL-6B-Säule mit DEAE-Puffer A, unter Verwendung eines FPLC. Laufpuffer durch die Säule mit 1-2 ml / min bei einem maximalen Druck von 0,2 MPa über Hintergrund. Laden Sie die zellfreien Extrakt auf die Säule, und beginnen, die Flow-Through, sobald die OD 280-Signal beginnt oberhalb der Grundlinie erhöhen zu sammeln. Waschen Sie die Säule mit DEAE Buffer A, bis die OD 280-Wert auf den Ausgangswert zurück, während kontinuierlich Sammeln der Durchströmung. Der Durchfluss sollte die Mehrheit der DPS-Protein, frei von gebundenen DNA. Die Säule wird mit 100% Puffer B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M NaCl, 0,1 mM EDTA). Dieses Eluat enthält DPS-DNA-Komplexe sowie andere Proteine ​​codieren und kann verworfen werden. </li><li> Ad entfernenzusätzliche verunreinigenden Proteine ​​durch Ammoniumsulfat-Fällung. Bestimmen Sie das Volumen von gepoolten Durchströmung. Langsam (über einen Zeitraum von 10-20 min) hinzufügen trockenen kleinen Korn Ammoniumsulfat auf 62% Sättigung (390 mg pro ml Lösung) bei 4 ° C unter Rühren gut. Die Mischung wird für weitere 20-30 min nach der Zugabe der letzten Portion von Ammoniumsulfat, um eine vollständige Gleichgewichtseinstellung zu gewährleisten. Dps bleibt löslich, während verunreinigenden Proteine ​​ausfallen wird der Lösung. </li><li> Entfernen gefällten Proteine ​​durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C und speichern Sie den Überstand. </li><li> Langsam fügen Sie eine zusätzliche 227 mg Ammoniumsulfat pro ml Überstand auf 94% Sättigung zu erreichen und rühren für 20-30 min, um eine vollständige Gleichgewichtseinstellung zu gewährleisten. DPS fällt bei dieser hohen Salzkonzentration und durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 min bei 4 ° C gesammelt Die EP werden im Pellet sein, der Überstand verworfen werden können. Das Pellet kann bei -80 ° C gelagert werden, wenn desired. </li><li> Resuspendieren der DPS-Pellet in Resuspensionspuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Stellen Sie die Probenmenge zu 2,5 ml. </li><li> Pufferaustausch die Ammoniumsulfat unter Verwendung einer PD-10 Gelfiltrationssäule zu entfernen. Equilibrieren das Gel Bett mit 25 ml Resuspensionspuffer. Übernehmen Sie die 2,5 ml Dps Probe auf die Spitze des PD-10-Säule und lassen Sie ihn einweichen in. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Sammle Dps durch Elution mit 3,5 ml Resuspensionspuffer. </li><li> Zentrifugieren Pufferaustausch Probe bei 16.000 × g für 10 min bei 4 ° C, um alle unlöslichen Bestandteile zu entfernen, und verdünnen mit 6-10 ml Verdünnungspuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), um sicherzustellen, dass die Salzkonzentration niedrig genug für die EP, der SP-Sepharose-Säule gebunden. Besonders konzentrierte Proben der EP kann es weniger löslich bei Verdünnung in einer niedrigeren Salzpuffer, wie Trübung der Flüssigkeit nachgewiesen, sondern kann vollständig durch die Zugabe einer kleinen amou Lösung gebracht werdennt von 5 M NaCl-Lösung (eine zusätzliche 10-20 mm). </li><li> Äquilibrieren einer 30 ml SP-Sepharose Fast Flow-Säule mit SP Puffer A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Führen Puffer durch die Säule mit 1,5-2 ml / min mit einem Druck von 0,3 MPa über Hintergrund. Legen Sie die Probe auf die Säule. Waschen mit Puffer A SP, bis die OD 280 Spuren auf den Ausgangswert zurück, und entsorgen Sie die Durchströmung. Führen Sie einen 150 ml linearen Gradienten von 0 bis 100% Puffer B, beim Sammeln von 2 ml Fraktionen. Die EP werden in einem scharfen Peak bei etwa 50% B eluieren, obwohl Variation von 10% ist möglich. </li><li> Führen Sie die Elutionsfraktionen auf einem 15% SDS-PAGE-Gel, und überprüfen Sie die DNA-Kontaminationen durch Messung der OD 260 / OD 280 Verhältnis mit einem Spektralphotometer. Das Gel sollte nur zeigen, ein Band um 19 kDa und die OD 260 / OD 280 ist in der Regel etwa 0,7. Schwimmbad Das reinste Dps Fraktionen. Verwenden Sie einen Zentrifugalfiltereinheit (wie der Amicon Ultra-Filtration Unit) mit einem10K Molekulargewicht cut-off zu konzentrieren der DPS und tauschen sie in einen Pufferspeicher (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl). Aliquot die gereinigten Dps und Einfrieren in flüssigem Stickstoff für die Lagerung bei -80 ° C. </li></ol> 2. DNA-Schutz-Assay Der Test umfasst mehrere zeitkritische Schritte und sollte mit dem zweiten zeitgesteuert werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Viele Zutaten und Pipettierschritten beteiligt sind, so dass ein Pipettieren (siehe Tabelle 1) ist es ratsam, den Überblick über die Schritte und Volumen zu halten. Die Gesamtzeit für den Assay benötigt wird, nicht mehr als 3 Stunden. <ol><li> Messen 30 ml Wasser in einem luftdichten Gefäß, die Wasserleitung mit N 2 für 10 min (mit zwei Injektionsnadeln, ein in der Flüssigkeit, eine darüber), um Sauerstoff aus der Lösung zu entfernen. In 0,0168 g FeSO 4 • 7H 2 O, um das Wasser, um eine 2 mM Stammlösung zu erhalten. Verschließen Sie die Flasche und spülen mit Stickstoff für 5 min mehr, dann mischen. Die Lösung mussklar, wenn jeder Hauch von gelb nachweisbar ist, bereiten eine neue Eisen Lösung. </li><li> Machen Sie eine 100 mM H 2 O 2-Lösung (10.87 ul 9.2MH 2 O 2 in 1 ml Wasser), auf Eis zu halten und vor Licht geschützt durch das Einwickeln in Aluminiumfolie. Verwenden Sie nur für etwa 1-2 Stunden nach der Herstellung durch spontanen Zerfall. Das Wasserstoffperoxid Lager ist ähnlich störanfällig, die teilweise durch die richtige Lagerung (im Dunkeln bei 4 ° C) kann verbessert werden. Regelmäßige Kontrollen des Bestands Konzentration durch Messung der OD 240 werden empfohlen. </li><li> Tauwetter ein Aliquot des gereinigten Dps schnell in einer Raumtemperatur Wasserbad, und halten auf dem Eis. Zentrifuge für 10 sec bei 4.000 xg in einer Tischplatte picocentrifuge auszufallen Aggregate. Messen Konzentration nach Zentrifugation mit einem Spektralphotometer (OD 280 = 1.547 zeigt eine Konzentration von 100 pM Monomer DBS). </li><li> Verdünnen lineare DNA von hoher Konzentration Lager mit 12x Reaktionspuffer (1M MOPS-KOH, pH 7,0, 1 M NaCl) zu einer Konzentration von 100 ng / ul. Lineare DNA wird verwendet, um die Quantifizierung zu erleichtern, aber Plasmid-DNA kann ebenso verwendet werden. </li><li> Je 1 ul der DNA-Puffer-Gemisches in ein PCR-Röhrchen. Fügen Sie genug Wasser in der Reaktion, so dass die Endreaktionsvolumen (minus SDS) werden 12 ul sein. Dieser Betrag sollte im Voraus mit dem Pipettieren Tabelle berechnet werden. In Dps zu einer endgültigen Dodecamer Konzentration von 3 um. Inkubation: 15 min bei Raumtemperatur zu ermöglichen DPS DNA binden. </li><li> Fügen Sie genug 2 mM FeSO 4-Lösung, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Ein typisches Experiment verwendet einen Konzentrationsbereich von 0 bis 1 mM FeSO 4. Höhere Konzentrationen führen umfangreichere DNA-Abbau, sondern kann auch zur Bildung von Eisen-III-Ausscheidungen in der Reaktionsmischung führen. Schnelles Hinzufügen von 1 ul der 100 mM H 2 O 2-Lösung (10 mM Endkonzentration) und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min, damit der Fenton-Vermittelten Abbau Reaktion stattfindet. </li><li> In 0,8 ul 20% SDS (Natriumdodecylsulfat). Mischen und Inkubation bei 85 ° C für 5 min auf der DPS-DNA-Komplexe zu stören. Die SDS destabilisiert die Dps-DNA-Komplex und verhindert unerwünschte Verschiebungen Gel für die DNA, die die Leichtigkeit der Quantifizierung verbessert. Ein optionaler Schritt ist die Reaktion durch katalytische Abbau des Wasserstoffperoxids in nicht-toxische Produkte auf. Für die Bedingungen in diesem Protokoll beschrieben, ist dieser Schritt nicht notwendig, um ein breites Spektrum von DNA-Abbau erhalten. </li><li> Inkubation auf Eis für 1 min, fügen Laden Farbstoff und laden auf einem Agarosegel. Führen Sie das Gel und Fleck für die DNA mit Ethidiumbromid. Das Gel sollte gebeizt post-Elektrophorese, anstatt vor der Elektrophorese, die SDS von störenden mit dem Ethidiumbromid Verteilung im Gel zu verhindern. </li></ol>

<ol>
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Wir haben nichts zu offenbaren.

Das Reinigungsverfahren Dps wie in diesem Artikel beschrieben wird, ist sehr robust. Reinheit ist durchweg hoch (&gt; 99%); keine anderen Proteine ​​scheinen auf SDS-PAGE-Gelen als sichtbare Banden. Trotzdem scheinen einige Chargen von gereinigtem DPS Nukleaseaktivität haben, wie durch partielle DNA-Abbau nachgewiesen, wenn mit sehr hohen Konzentrationen von Dps inkubiert. Dies könnte darauf hindeuten, das Vorhandensein von hochaktiven DNasen bei niedriger Konzentration, dass wir nicht durch Reinigung zu entfernen...

Aeroben Organismen müssen ständig mit reaktiven Sauerstoffspezies, die ihre DNA sowie andere wichtige biologische Makromoleküle beschädigen kämpfen. Ein starkes Werkzeug, um die toxischen Effekte von oxidativen Schäden entgegenzuwirken ist die DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS). Seit seiner Entdeckung im Jahre 1992 von ausgehungerten E. coli-Kultur 1 hat Dps in mehr als 300 Arten von Bakterien und Archaebakterien 2 identifiziert worden. Massiver Hochregulation von Dps während der stationären Phase macht es am meisten hochexprimierten nucleoid-assoziiertes Protein von E. coli unter Hunger Bedingungen 3, 4. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Dps sowohl bakterielle Lebensfähigkeit und DNA Integrität während vielen verschiedenen Belastungen, einschließlich Hunger, hohe Eisenkonzentration, UV-Licht Exposition, Hitzeschock, oxidativer Stress und 5, 6 zu bewahren. Strukturell Dps Selbst-Mitarbeiter in eine stabile homooligomeren Komplex von 12 Monomere, werden in einem kugelförmigen hohlen Schale montieren. Das ~ 4,5 nm breiten inneren Hohlraum zugänglich an der Außenseite Lösungsmittel über Poren, die den Durchtritt von kleinen Molekülen 7 zu ermöglichen, und es kann mineralisierten Metallen wie Eisen 8 binden. Die schützende Wirkung von Dps leitet sich von seinen verschiedenen biochemischen Aktivitäten, die nicht-spezifische DNA-Bindung 1, Ferroxidaseaktivität und Speicherung von Eisen 8 gehören. Detaillierte Studie der positiven biochemischen Aktivitäten von Dps erfordert zunächst seine Reinigung. Dps Reinigung ist eine aufwendige Prozedur, wie Dps nicht nur von anderen Proteinen getrennt werden müssen, sondern auch von jedem gebundenen DNA 7. Unsere optimierten Reinigungsprozess verwendet viele gängige Techniken, bestehend aus zwei Ionenaustausch-Säulen und einem Ammoniumsulfatfällung Schritt. Mehrere Puffer Börsen sind erforderlich, da hochkonzentriert Dps ausfallen können von Lösung in salzarme Bedingungen. Sobald Dps Protein wurde gereinigtKann es zu Assays, die direkt zu messen sein Ferroxidaseaktivität 8, DNA-Bindungsstöchiometrie 9 und Mechanismen Eisenbindungskapazität 10 aufgebracht werden. Gereinigt Dps hat auch andere Einsatzmöglichkeiten. Die stabile Hohlkugelstruktur von Dps als Gerüst wurde für die Speicherung von hydrophoben Teilchen im Inneren des Proteins Hohlraum 11 verwendet und sogar als eine Reaktionskammer zu synthetisieren neuartige magnetische Nanopartikel 12. Die Schutzfähigkeit von Dps um Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies vermitteln kann klar und direkt nachgewiesen mit Hilfe der DNA-Schutz-Assay 13, 14. In diesem in vitro-Verfahren werden Radikale erzeugt, wenn Eisen katalysiert H 2 O 2 Zersetzung durch Fenton Chemie. Diese Reste direkt schädigen DNA in der Reaktion und vollständig abzubauen es bei hohen Konzentrationen. Zwei wichtige Dps Aktivitäten können sowohl direkt den Effekten entgegenzuwirken, von Fenton-vermittelten radikalischen Produktion. DPS senkt die Konzentration an katalytischem Eisen durch Mineralisierung und verbraucht den verfügbaren Wasserstoffperoxid in den Prozess. Darüber hinaus kann die Bindung an DNA DPS potentiell abschirmen physisch von Radikalen und kondensiert sie in ein kleineres Volumen mit weniger reaktiven Oberfläche. Die Kombination dieser beiden Eigenschaften macht den DNA-Schutz-Assay auch für den Zweck der Messung schützende Dps Aktivität geeignet. Die DNA-Schutz-Assay ist sehr vielseitig und kann für eine Vielzahl von Anwendungen über DPS Charakterisierung verwendet werden. Radikale ist eine häufige Form von Stress in Zellen, und viele verschiedene Proteine ​​und Chemikalien werden verwendet, um dem entgegenzuwirken. Das allgemeine Prinzip des Assays unter Verwendung von DNA-Integrität als Marker für Radikale, können in Kombination mit fast jedem Rest-produzierenden Reaktion oder entgegenwirkende Mittel eingesetzt werden. Unter anderem hat der Test erfolgreich verwendet, um anti-oxidativen Eigenschaften zu bestimmenvon K. paniculata Extrakt für den Einsatz in der Lebensmittelindustrie 15, um die Auswirkungen der Harnsäure auf Hydroxyl Schäden Mediation 16 charakterisieren und neue Einblicke in die Funktion des Fur Transkriptionsregulators Proteine ​​17 zu gewinnen. Trotz der zahlreichen Verwendungen des Assay in veröffentlichten Arbeiten fanden wir, dass viele Optimierung und Fehlerbehebung erforderlichen Schritte wurden, wodurch die Einrichtung der Test zum ersten Mal eine unnötig aufwendige Arbeit für viele Forscher. Das Protokoll präsentieren wir in diesem Artikel soll diese Barriere für den Eintritt zu entfernen.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3)pLysS competent cells</td>
 <td>Promega</td>
 <td>L1195</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET-17b DNA</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>69663-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth powder</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L3022</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin sodium salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A0166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C0378</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6758</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>BDH</td>
 <td>441476L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium hydroxide</td>
 <td>Merck</td>
 <td>105033</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>VWR</td>
 <td>443824T</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E9884</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor Cocktail Set III</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>539134</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>DFF100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium sulphate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A4418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PD-10 Desalting Columns</td>
 <td>GE Healthcare LS</td>
 <td>17-0851-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SP-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S1799</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferrous Sulphate heptahydrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F8048</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>216763</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>475898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS solution</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>161-0418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethidium bromide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E1510</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Static incubator</td>
 <td>Hettich</td>
 <td>INE500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Shaking Incubator </td>
 <td>New Brunswick Sc.</td>
 <td>Inova 44</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cooled centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5424</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell disrupter</td>
 <td>Constant Systems Ltd.</td>
 <td>TS2/40/AA/AA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FPLC Purifier</td>
 <td>General Electric</td>
 <td>AKTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airtight vials</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>EW-08918-85</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe needles</td>
 <td>BD</td>
 <td>305128</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipettes</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

application of an in vitro dna protection assay to visualize stress mediation properties of the dps protein

Oxidativer Stress ist eine unvermeidbare Nebenerscheinung des aeroben Lebens. Molekularer Sauerstoff ist wichtig für terrestrische Stoffwechsel, aber es nimmt auch an vielen schädlichen Reaktionen im lebenden Organismen. Die Kombination von aeroben Stoffwechsels und Eisen, die eine weitere wichtige Verbindung für das Leben ist, ist genug, um Radikale durch Fenton Chemie produzieren und zelluläre Komponenten abbauen. DNA-Abbau ist wohl die schädlichen Prozess, der intrazellulären Radikale, wie DNA-Reparatur ist alles andere als trivial. Der Test in diesem Artikel vorgestellten bietet eine quantitative Methode zu messen und visualisieren die Wirkung von Molekülen und Enzymen auf radikalvermittelte DNA-Schäden. Die DNA-Schutz-Assay ist eine einfache, schnelle und stabile Werkzeug zur in-vitro-Charakterisierung der schützenden Eigenschaften von Proteinen oder Chemikalien. Es schließt ein, dass eine DNA schädigende oxidative Reaktion und Zugabe von verschiedenen Konzentrationen der Verbindung von Interesse. Die Verringerung oder Erhöhung der DNA-Schädigung in Abhängigkeit von der Konzentration der Verbindung wird dann unter Verwendung von Gelelektrophorese sichtbar gemacht. In diesem Artikel zeigen wir die Technik der DNA-Schutz-Assay durch Messung der schützenden Eigenschaften der DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS). DPS ist eine Mini-Ferritin, das von mehr als 300 Bakterienarten verwendet wird, um kräftig zu bekämpfen Umwelt-Stressoren. Hier präsentieren wir die Dps Aufreinigungsprotokolls und die optimierten Testbedingungen für Auswertung DNA Schutz durch Dps.

Das Reinigungsverfahren für Dps beschrieben ist hier sehr reproduzierbar. DPS Reinigung nach dem beschriebenen Protokoll, mit 2 l E. coli-Kultur als Ausgangspunkt, wird in der Regel ergeben 2,5 ml Protein enthaltenden Dps 12 in Konzentrationen zwischen 5 und 12 um. Längere Zeiten Induktion (4 h) scheinen diese Variabilität zu reduzieren. Protein Reinheit durchweg über 99%, wie durch SDS-PAGE-Gelen (Abb. 1) zeigt. Der Grad der DNA-Kontaminationen werden durchweg gering, da sowohl ...

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Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Die DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung bakterieller Belastung. Dieser Artikel beschreibt die Reinigung von<em&gt; E. coli</em&gt; Dps und das Protokoll für eine<em&gt; In vitro</em&gt; Test demonstriert DPS-vermittelte Schutz der DNA vor Abbau durch reaktive Sauerstoffspezies.

Anwendung eines<em&gt; In-vitro-</em&gt; DNA-Schutz-Assay, um Stress Mediation Eigenschaften des DPS-Protein Visualisieren

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

11.1K Aufrufe.  Delft University of Technology. Die DNA-bindendes Protein von ausgehungerten Zellen (DBS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung bakterieller Belastung. Dieser Artikel beschreibt die Reinigung von E. coli Dps und das Protokoll für eine In vitro Test demonstriert DPS-vermittelte Schutz der DNA vor Abbau durch reaktive Sauerstoffspezies.

Serie: Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

Ein In-vitro- FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Forschung

Biologie

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic information including active site concentrations and intrinsic rate constants that govern macromolecular function. In case of enzymes, for example, transient or pre-steady state measurements identify and characterize individual events in the reaction pathway, whereas steady state measurements only yield overall catalytic efficiency and specificity. Individual events such as protein-protein or protein-ligand interactions and rate-limiting conformational changes often occur in the millisecond timescale, and can be measured directly by stopped-flow and chemical-quench flow methods. Given an optical signal such as fluorescence, stopped-flow serves as a powerful and accessible tool for monitoring reaction progress from substrate binding to product release and catalytic turnover1,2.
Here, we report application of stopped-flow kinetics to probe the mechanism of action of Msh2-Msh6, a eukaryotic DNA repair protein that recognizes base-pair mismatches and insertion/deletion loops in DNA and signals mismatch repair (MMR)3-5. In doing so, Msh2-Msh6 increases the accuracy of DNA replication by three orders of magnitude (error frequency decreases from ~10-6 to10-9 bases), and thus helps preserve genomic integrity. Not surprisingly, defective human Msh2-Msh6 function is associated with hereditary non-polyposis colon cancer and other sporadic cancers6-8. In order to understand the mechanism of action of this critical DNA metabolic protein, we are probing the dynamics of Msh2-Msh6 interaction with mismatched DNA as well as the ATPase activity that fuels its actions in MMR. DNA binding is measured by rapidly mixing Msh2-Msh6 with DNA containing a 2-aminopurine (2-Ap) fluorophore adjacent to a G:T mismatch and monitoring the resulting increase in 2-aminopurine fluorescence in real time. DNA dissociation is measured by mixing pre-formed Msh2-Msh6 G:T(2-Ap) mismatch complex with unlabeled trap DNA and monitoring decrease in fluorescence over time9. Pre-steady state ATPase kinetics are measured by the change in fluorescence of 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl)ethyl)amino)carbonyl) coumarin)-labeled Phosphate Binding Protein (MDCC-PBP) on binding phosphate (Pi) released by Msh2-Msh6 following ATP hydrolysis9,10.
The data reveal rapid binding of Msh2-Msh6 to a G:T mismatch and formation of a long-lived Msh2-Msh6 G:T complex, which in turn results in suppression of ATP hydrolysis and stabilization of the protein in an ATP-bound form. The reaction kinetics provide clear support for the hypothesis that ATP-bound Msh2-Msh6 signals DNA repair on binding a mismatched base pair in the double helix.
F. Noah Biro and Jie Zhai contributed to this paper equally.

Msh2-Msh6 is responsible for initiating repair of replication errors in DNA. Here we present a transient kinetics approach towards understanding how this critical protein works. The report illustrates stopped-flow experiments for measuring the coupled DNA binding and ATPase kinetics underlying Msh2-Msh6 mechanism of action in DNA repair.

Die Anwendung der Stopped-Flow-Kinetics Methoden der Wirkmechanismus eines DNA-Repair Protein Untersuchen

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

Biophysikalische Assays auf die mechanischen Eigenschaften der Interphase Zellkern Probe: Substrat Dehnungs-Anwendung und Mikronadel Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Exposition gegenüber sehr niedrigen Dosen von Beta- und Gamma-Strahlung

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Die Montage und Anwendung der &quot;Shear Ringe &#39;: A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...