Name: comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
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Wir möchten die LHW Stiftung zu danken, in Triesen Liechtenstein, für die finanzielle Unterstützung unserer Forschung auf oxidativen Stress.

Studien über Comet-Assay in der Universität Basel durchgeführt, Augenklinik wurden von der lokalen Ethikkommission genehmigt Basel 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Vorbereitung Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (Ca ++, Mg ++ frei) Lösung durch Zugabe von PBS (1 L-Paket) und 990 ml dH 2 O zu den Medien. Den pH-Wert auf 7,4. Lagern bei RT. </li><li> Bereiten Lyselösung: So bereiten 1.000 ml hinzuzufügen 2,5 M NaCl (146,1 g), 100 mM EDTA (37,2 g) und 10 mM Trizma Base (1,2 g) in dH 2 O </li><li> Vorbereitung Elektrophoresepuffer (300 mM NaOH / 1 mM EDTA) durch Zugabe von 30 ml 10 M NaOH und 7,5 ml 0,2 M EDTA, qs bis 1.500 ml dH 2 O und gut mischen. Das Gesamtvolumen hängt von der Gelbox Kapazität. Vor der Verwendung wird Den pH des Puffers auf einen pH-Wert von&gt; 13 zu gewährleisten. </li><li> Vorbereitung Neutralisierungspuffer, enthaltend 0,4 M Tris (48,5 g zugegeben, um ~ 800 ml dH 2 O, Einstellen des pH auf 7,5), eingeengt (&amp; #62; 10 M HCl) in 1.000 ml mit dH 2 O Bewahren Sie die Lösung bei RT. </li><li> Bereiten Färbelösung. Um Ethidiumbromid (EtBr; 10x Lager, 20 ug / ml) in 10 mg EtBr in 50 ml dH 2 O und Speicher bei RT. Für 1x Lager - mischen 1 ml mit 9 ml dH 2 O VORSICHTIG! Griff EtBr mit ausreichender Vorsicht, da es ein bekanntes Karzinogen. </li></ol> 2. Isolierung von Leukozyten <ol><li> Erhalten Humanblutproben (20 ml) mit Anti-Koagulationsmittel, wie Heparin mittels Venenpunktion. </li><li> Trennen Sie die Lymphozyten mit einem Dichtegradienten Zellseparator wie Histopaque. <ol><li> Kurz, verdünnte Blut in Verhältnis 1: 1 mit PBS oder RPMI (ohne FBS) und die Schicht mehr als 600 &amp; mgr; l Zelltrennflüssigkeit. </li><li> Zentrifuge 1.800 xg für 20 min bei 4 ° C. Saugen Sie das &#39;Buffy&#39; Mantel in 3-5 ml PBS / RPMI und bei 300 g für 10 min zentrifugiert, um die Lymphozyten zu pelletieren. </li><li> Abrufen Lymphozyten von knapp über Grenze zwischen PBS (RPMI) Und Zelltrennflüssigkeit, mit einem Pipette. Entfernen Sie die Leukozyten-Bands aus der Schnittstelle zwischen Plasma und den Zellseparator Flüssigkeitsschichten von jedem Röhrchen sammeln und in einen 50-ml-Tube. </li></ol></li><li> Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 50 ml mit kaltem Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). Dreimal mit DMEM Waschen der Zellsuspension bei 300 × g für 10 min. </li><li> Zählen der Gesamtzahl von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Die Zellen in PBS und Aliquot in Mikrozentrifugenröhrchen auf 10 7 Zellen / Röhrchen. </li><li> Pipette 0,4 ml der Zellen in einem 5 ml-Einweg-Kunststoffrohr. In 1,2 ml 1% niedriger Temperaturen gelierender Agarose bei 40 ° C. Mischen und schnell und pipettieren 1,2 ml der Zellsuspension auf das Agarose-bedeckten Oberfläche einer vorbeschichteten Folie. Vermeiden Sie Blasen entstehen. </li><li> Ermöglichen die Agarose ca. 2 min gelieren. Im Einklang mit der Zeit und Temperatur zum Gelieren verwendet, und sicherzustellen, dass Agarose vollständig vor Eintauchen in Lyse-Lösung eingestellt. Nach voll set, tauchen in Lyse-Lösung bei ca. 4 ° C. </li></ol> 3. Lysis und Elektrophorese HINWEIS: Die beschriebene Vorgehensweise ist für die Elektrophorese unter pH&gt; 13 alkalischen Bedingungen. <ol><li> Nach mindestens 2 Stunden bei ca. 4 ° C, entfernen Sie vorsichtig Folien aus der Lyselösung. Die Objektträger nebeneinander auf der horizontalen Elektrophoresekammer nahe einem Ende, verschiebbar sie so nahe wie möglich beieinander. </li><li> Füllen Sie die Pufferbehälter mit frisch zubereiteten pH&gt; 13 Elektrophoresepuffer, bis der Flüssigkeitspegel die Folien vollständig (zu vermeiden, Blasen über die Agarose) abdeckt. </li><li> Lassen Folien sitzen im alkalischen Puffer für 20 min bis zum Abwickeln der DNA und die Expression von alkalilabilen Schäden. </li><li> Stromversorgung einschalten, um 25 Volt (~ 0,75 V / cm), und stellen Sie den Strom auf 300 mA durch Anheben oder Absenken der Pufferstufe. Elektrophorese der Objektträger für 30 Minuten. </li><li> Schalten Sie das Gerät. Heben Sie die Folien aus dem Puffer und pSpitze auf einem Auffangwanne. Tropfenweise Beschichtung der Folien mit Neutralisationspuffer. Lassen Sie die Objektträger für mindestens 5 min zu sitzen. Ablassen Rutschen und zwei weitere Male wiederholen. </li><li> Färben die Objektträger mit 80 ul 1x Ethidiumbromid (EtBr) und lassen Sie für 5 Minuten und dann tauchen in gekühltes destilliertes Wasser, um überschüssige Fleck zu entfernen. Dann legen Sie ein Deckglas über den Objektträger und sofort speichern. Shop gleitet für einen Monat bei Raumtemperatur in trockener Umgebung. Hinweis: andere DNA Flecken (zB SYBR-Grün), können ebenfalls verwendet werden. Achtung! Schutzhandschuhe tragen, da die meisten Farbstoffe sind mutagen. </li></ol> 4. Quantifizierung der DNA-Brüche <ol><li> Um die DNA-Schäden zu visualisieren, beobachten die EtBr-gefärbten DNA Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop 40X-Objektiv. </li><li> DNA-Schädigung zu beurteilen quantitativ in den Zellen durch Messen der Länge der DNA-Migration und der Prozentsatz der migrierten DNA (1A). DNA-Schäden zu quantifizieren (1B) von der Schwanz Moment und Olive-moment. Definitionen von Schwanz-Moment und Olive -Moment eine effektvolle wurden bislang 8-10 gegeben. HINWEIS: Nach unserer Erfahrung ist es genug, um von einer der Parameter bleiben. Die Zellen werden durch Setzen des automatisiertes Tool, das über dem Objektträger und Fotografien Zellen scannt fotografiert. Die Quantifizierung der DNA-Brüche können durch Bildanalyse-Software-Pakete durchgeführt werden. Es gibt mehrere verschiedene Softwarepakete, die nach Maß sind, um das Bild der Zellen zu erfassen und zu quantifizieren, DNA-Schäden. Wir empfehlen, mit der gleichen Software-Paket während des Experiments. Die Labor-Techniker identifiziert der intakten Zelle oder Kometen auf dem Computer erzielt werden, und klickt mit der Maus auf sie. Der Komet oder intakte Zelle wird dann automatisch erzielt. </li></ol>

<ol>
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Schwedische Wissenschaftler Ostling und Johanson als erste in ihrem Bereich zu Comet-Assay verwenden, um DNA-Schäden in Zellen 1 zu quantifizieren. Die neutralen Bedingungen, dass die beiden Wissenschaftler nutzten jedoch nur erlaubt den Nachweis von doppelsträngigen DNA-Brüche. Singh et al. Später angepasst den Test für den Einsatz unter alkalischen Bedingungen, die eine empfindliche Version, die Doppel- und Einzelstrang-DNA-Brüche zu bewerten und erkennen alkalilabile Websites 12 könnte hergestellt. Seit der ersten Entwicklung hat der Assay bei verschiedenen Schritten verändert wurde, um für die Bewertung Arten von DNA-Schädigung in verschiedenen Zelltypen 13-15 geeignet zu machen. Wie bei allen Techniken ist wichtig, zahlen viel Liebe zum technischen Details, um genaue Ergebnisse zu erhalten 16. Basierend auf unserer Erfahrung, die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn jeder Verfahrensschritt-Lösung von der Vorbereitung bis zur Kometen-Quantifizierung von Experten Labor techn geführticians. Die Verwendung von frischen und richtig vorbereitet Medien, angemessene Pipettiertechniken, exaktes Timing und (wie zuvor im Ergebnisteil erwähnt) die Verwendung von frisch zubereiteten Leukozyten sind von wesentlicher Bedeutung, um für die Lyse und Gelelektrophorese, um genaue Ergebnisse zu erhalten 17. All die einzelnen Schritte in diesem Test sind für den Erhalt zuverlässige Ergebnisse ebenso wichtig. 16 In der Regel die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn jeder einzelne Verfahrensschritt aus der Lösung Vorbereitung bis Kometen Quantifizierung wird von Experten Labor technicians.Important geführt scheint die Verwendung von frischen und richtig vorbereitet Medien , angemessene Pipettiertechniken, exaktes Timing und wie bereits im Ergebnisteil der Einsatz von frisch zubereiteten Leukozyten für die Lyse und Gelelektrophorese, angemessene Ergebnisse aus dem Test 17 ​​zu erhalten bezeichnet. Wie andere Methoden, hat die Comet-Assay-Technik seine ADVANteile und Nachteile. Als eine empfindliche Methode ist der Test anfällig für Faktoren (zB UV-Licht), die DNA-Brüche ergänzen und beeinflussen so Ergebnisse könnten. Jeder Faktor, erhöhen kann oxidativer Stress, außer der, die erforscht wird, sollte vermieden werden. Stressoren können Niveau von oxidativem Stress nicht nur in Leukozyten, sondern auch in allen anderen Blut Medien und Lymphozyten zu erhöhen. Wie bereits erwähnt gibt es viele verschiedene und direktere Methoden zur Messung der oxidativen Stress 18,19. Comet-Assay ist einer der vielen Methoden, die bestimmte Vorteile hat. Dazu gehören ihre relativ geringen Kosten, der geringen Anzahl von Zellen erforderlich ist (&lt;10.000 Zellen) und damit die kleine Proben von Blut pro Patient benötigt, die relativ kurze Zeitdauer erforderlich ist, um DNA-Schäden in Zellen (etwa 3 Tage) zu quantifizieren, dessen Empfindlichkeit und seine weit verbreitete Anwendbarkeit auf Eseln DNA-Schäden in verschiedenen Zelltypen. In der Vergangenheit wählen wir mit Leukozyten zu arbeiten, da wir hatten Erfahrung mit diesemZelltyp und es war zutreffend für den jeweiligen geplanten Studie. Ein weiterer Vorteil der Comet-Assay ist, dass es verwendet werden kann, um verschiedene Arten und Mengen an DNA-Schäden zu erkennen und kann somit in verschiedenen anderen Bereichen des Studiums neben oxidativen Stress, wie DNA-Reparatur Studien Supplementierung Versuche oder Genotoxizität Studien angewendet werden. Oxidativer Stress gilt heute als spielen eine kritische Rolle bei der Pathogenese mehrerer Krankheiten erkannt. Comet-Assay-Methode, wobei eine von vielen Möglichkeiten der Messung von oxidativem Stress 18,19, ist relativ einfach, vielseitig und kostengünstig. Wenn beherrscht, kann dieses Verfahren in allen Bereichen der Medizin, bei denen oxidativer Stress eine Rolle spielt 8-10,20,21 verwendet werden.

Comet Assay wurde zuerst von schwedischen Wissenschaftlern Ostling und Johanson 1 entwickelt. DNA ist ein negativ geladenes Molekül. Während der Elektrophorese, kleiner, beschädigte DNA-Fragmente zu reisen schneller zu einer positiv geladenen Anode 2. Je kleiner die DNA-Fragmente, desto schneller wird die Migration in Richtung der Anode eine typische &quot;Komet&quot; mit einem &quot;Kopf&quot; von intakten, unbeschädigte DNA und einem &quot;Schwanz&quot; der beschädigten DNA-Fragmente 3 zusammengesetzt, um zu bilden. Beschädigte DNA kann durch verschiedene Mechanismen im Körper 4, der die Erzeugung von DNA-Brüchen relativ ausgewogen 5 halten repariert werden. Wenn jedoch das Gleichgewicht zugunsten der DNA Pausen können die Brüche ansammeln und wird schließlich zu der Entwicklung einer Krankheit beitragen. Unsere DNA leidet etwa 0.000165% Schädigung zu einer gegebenen Zeit 6. Einzelsträngige DNA-Brüche beziehen sich auf einen Defekt an einem der beiden Stränge der DNA-Doppelhelixwohingegen doppelsträngige DNA-Brüche verursacht werden, wenn beide Stränge der DNA-Doppelhelix beschädigt sind. Es gibt verschiedene Faktoren, die die Menge an DNA-Brüche zu einem gegebenen Zeitpunkt wie das Alter der Zelle, Zigarettenrauch, verschiedene Medikamente oder oxidativen Stress 7-9 erhöhen kann. Wenn alle Faktoren, die zu einer verbesserten DNA-Brüche konstant gehalten werden, dann wird die Quantifizierung von DNA-Brüchen mittels Comet-Assay ist eine gute indirekte Parameter des oxidativen Stresses. Das Verfahren zur Comet-Assay wird heute zunehmend in der Medizin einschließlich der Augenheilkunde eingesetzt. Ein Grund dafür ist, dass oxidativer Stress mehr als Pathomechanismus für verschiedene Krankheiten, 8-11 und Comet-Assay erfasst ist eine Methode, mit der oxidativen Stress indirekt quantifiziert werden kann.

<table><tbody><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Qualigens</td><td>(CPW59)</td><td></td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>HiMedia</td><td>(RM1370)</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma</td><td>(E-8751)</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>(1077-1)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td><td>HiMedia</td><td>(TS1006)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td><td>(S0160)</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>BDH-Merck</td><td>(89021)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>(RM 845)</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Spectrochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials required for gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Normal Melting Agarose (NMA)</td><td>HiMedia</td><td>(RM273)</td><td></td></tr><tr><td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Methanol - Qualigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td><td>Blue Star</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes</td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor and Tips</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

Höheren eukaryotischen Organismen nicht ohne Sauerstoff leben; Paradoxerweise kann Sauerstoff für sie schädlich sein. Das Sauerstoffmolekül chemisch relativ inert, weil es zwei ungepaarten Elektronen in verschiedenen pi * Anti-Bindungsorbitalen entfernt. Diese beiden Elektronen parallel Spins, das heißt sie in der gleichen Richtung um ihre eigenen Achsen drehen. Deshalb ist die Sauerstoffmoleküls ist nicht sehr reaktiv. Aktivierung von Sauerstoff kann durch zwei verschiedene Mechanismen auftreten; entweder durch Reduktion über ein Elektron zu einem Zeitpunkt (monovalent Reduktion) oder durch die Absorption von genügend Energie, um den Spin eines der ungepaarten Elektronen umzukehren. Dies resultiert in der Produktion von reaktiven oxidativen Spezies (ROS). Es gibt eine Reihe von Möglichkeiten, wie der menschliche Körper eliminiert ROS in seinen physiologischen Zustand. Wenn ROS-Produktion übersteigt die Reparaturkapazität, oxidativer Stress Ergebnisse und Schäden unterschiedlichen Molekülen. Es gibt viele verschiedene Methoden, mit denen oxidativer Stress kann mich seingesicherter. Diese Handschrift konzentriert sich auf eine der Methoden namens Zell Gelelektrophorese, die auch als &quot;Comet Assay&quot;, die Messung der DNA-Brüche ermöglicht bekannt. Wenn alle Faktoren bekannt, DNA-Schädigung, ausgenommen oxidativen Stress verursachen konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung durch Comet-Assay gemessen wird, ein guter Parameter für oxidativen Stress. Das Prinzip ist einfach und beruht auf der Tatsache, dass DNA-Moleküle, sind negativ geladen. Ein intakter DNA-Molekül hat eine so große Größe, die nicht während der Elektrophorese nicht migrieren. DNA-Brüche, jedoch falls vorhanden führen zu kleineren Fragmenten, die im elektrischen Feld zur Anode hin bewegen. Kleinere Fragmente wandern schneller. Die Fragmente unterschiedliche Größen für das Ergebnis der Elektrophorese ist keine klare Linie, sondern ein Kontinuum mit der Form eines Kometen. Das System ermöglicht eine Quantifizierung der resultierenden &quot;Komet&quot; und damit der DNA-Brüche in der Zelle.

Obwohl das Verfahren der Comet-Assay macht reproduzierbare Ergebnisse, kann es durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst werden. Ein solcher Faktor ist, ob die Leukozyten vor der Lyse und Gelelektrophorese oder ob dieser Schritt auf frisch hergestellten Leukozyten geführt kryokonserviert. 2 zeigt, dass in der Gruppe 2, wobei Leukozyten wurden vor der Lyse und Gelelektrophorese ss- DNA kryokonserviert Pausen waren signifikant höher als in Gruppe 1, wo die Lyse und Gel -electrophoresis wurde auf frisch zubereitete Zellen durchgeführt. Der Assay kann auch verwendet werden, um indirekt zu beurteilen systemischen oxidativen Stress. Tabelle 1 zeigt die deskriptiven Statistiken für Schwanz Moment und Oliven Moment bei Rauchern und gesunden Probanden. Die Daten zeigen, dass das Rauchen eine halbe Packung Zigaretten täglich mehr als verdoppelt ssDNA Brüche in den zirkulierenden Leukozyten 9. <img alt="1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Abbildung 1 (a) zeigt das Mikroskop während der Comet-Assay-Analyse verwendet. (B) Δ zeigt eine typische &quot;Komet&quot; mit einem hellen Kopf und Schwanz (beschädigt kleiner DNA-Fragmente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Abbildung 2. ssDNA Pausen waren signifikant höher als Leukozyten wurden (Gruppe 2) kryokonserviert als frisch hergestellt Leukozyten wurden vor der Lyse und Gelelektrophorese verwendet. <imgalt = &quot;Tabelle 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tabelle 1. Raucher hatten mehr als die doppelte Anzahl von ssDNA bricht im Vergleich zu Alter und Geschlecht gesunden Nichtrauchern.

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Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet Assay misst DNA-Brüche, durch verschiedene Faktoren hervorgerufen. Wenn alle Faktoren (außer oxidativer Stress) DNA-schädigenden konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung ist eine gute indirekte Parameter von oxidativem Stress. Das Ziel des Protokolls ist es, Comet-Assay zur indirekten Messung von oxidativem Stress zu verwenden.

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

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29.3K Aufrufe.  University of Basel.  Comet Assay misst DNA-Brüche, durch verschiedene Faktoren hervorgerufen. Wenn alle Faktoren (außer oxidativer Stress) DNA-schädigenden konstant gehalten werden, die Menge an DNA-Schädigung ist eine gute indirekte Parameter von oxidativem Stress. Das Ziel des Protokolls ist es, Comet-Assay zur indirekten Messung von oxidativem Stress zu verwenden. 

Serie: Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer therapies, such as radio- and chemotherapy, introduce enormous amount of additional DNA damage, leading to cell cycle arrest and apoptosis to limit cancer progression. Quantitative assessment of DNA damage during experimental cancer therapy is a key step to justify the effectiveness of a genotoxic agent. In this study, we focus on a single cell electrophoresis assay, also known as the comet assay, which can quantify single and double-strand DNA breaks in vitro. The comet assay is a DNA damage quantification method that is efficient and easy to perform, and has low time/budget demands and high reproducibility. Here, we highlight the utility of the comet assay for a preclinical study by evaluating the genotoxic effect of olaparib/temozolomide combination therapy to U251 glioma cells.

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

The comet assay is an efficient method to detect DNA damage including single and double-stranded DNA breaks. We describe alkaline and neutral comet assays to measure DNA damage in cancer cells to evaluate the therapeutic effect of chemotherapy.

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Forschung

Krebsforschung

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Biotechnik

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

A Behavioral Assay, um die Reaktionsfähigkeit der Zebrafisch zu Änderungen in Lichtintensitäten messen

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biologie

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

Genetik

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Neurowissenschaften

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

Anwendung eines<em&gt; In-vitro-</em&gt; DNA-Schutz-Assay, um Stress Mediation Eigenschaften des DPS-Protein Visualisieren

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell function, and therefore DNA damage may play a critical role in the development of, conceivably, all major human diseases, e.g., cancer, neurodegenerative and cardiovascular disease, and aging. Single-cell gel electrophoresis (i.e., the comet assay) is one of the most common and sensitive methods to study the formation and repair of a wide range of types of DNA damage (e.g., single- and double-strand breaks, alkali-labile sites, DNA-DNA crosslinks, and, in combination with certain repair enzymes, oxidized purines, and pyrimidines), in both in vitro and in vivo systems. However, the low sample throughput of the conventional assay and laborious sample workup are limiting factors to its widest possible application. With the "scoring" of comets increasingly automated, the limitation is now the ability to process significant numbers of comet slides. Here, a high-throughput (HTP) variant of the comet assay (HTP comet assay) has been developed, which significantly increases the number of samples analyzed, decreases assay run time, the number of individual slide manipulations, reagent requirements, and risk of physical damage to the gels. Furthermore, the footprint of the electrophoresis tank is significantly decreased due to the vertical orientation of the slides and integral cooling. Also reported here is a novel approach to chilling comet assay slides, which conveniently and efficiently facilitates the solidification of the comet gels. Here, the application of these devices to representative comet assay methods has been described. These simple innovations greatly support the use of the comet assay and its application to areas of study such as exposure biology, ecotoxicology, biomonitoring, toxicity screening/testing, together with understanding pathogenesis.

The comet assay is a popular means of detecting DNA damage. This study describes an approach to running slides in representative variants of the comet assay. This approach significantly increased the number of samples while decreasing assay run-time, the number of slide manipulations, and the risk of damage to gels.

Ein Hochdurchsatz-Comet-Assay-Ansatz zur Beurteilung zellulärer DNA-Schäden

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell ...

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

To begin, prepare 0.6% low melting point agarose in PBS, and place it in a water bath at 37 degrees Celsius. Labeled the frosted end of the pre-coated slides with name, date, and treatment information using a permanent marker or pencil.
Place a chilling plate on a flat bench, and insert two frozen cooling packs into the sliding drawer below the metal surface. Then, place the slides on the chilling plate to pre-chill for 1 to 2 minutes. Centrifuge and remove the supernatant from the sample tubes, and place them immediately back on ice. Resuspend the cell pellet with 200 microliters of 0.6% low melting point agarose, and mix by pipetting.
Next, add 80 microliters of agarose-containing cells onto a chilled slide, and quickly place a coverslip on the gel. Allow the gel to set on the chilling plate for 1 to 2 minutes. In the meantime, prepare 500 milliliters of working solution of lysis buffer, and pour it into the lysis dish.
After the gels have set, remove the coverslips quickly by gently holding the slide between thumb and forefinger, and sliding the coverslip off the gel. Then, place the slides inside a slide carrier, with all the black dot marks on the slides facing in the same direction. Place the slide carrier inside the lysis dish. Close the lid of the lysis dish, and put it for incubation.
Carefully remove the slide carrier from the lysis dish without disturbing the gels. Gently, place the slide carrier in a washing dish pre-loaded with ice-cold double-distilled water. Ensure that the slides are completely submerged, and leave the setup for 30 minutes.
Place a frozen cooling pack under the electrophoresis tank to maintain optimal buffer temperature. Then, add ice-cold electrophoresis working solution to the tank, and transfer the slide carrier into it. Orient the slides, such that the cell containing gels point toward the cathode.
Incubate the slides in the electrophoresis tank for 20 minutes, to allow the DNA to unwind. Then, turn on the power supply to perform electrophoresis for 20 minutes at 1.19 volts per centimeter. After the electrophoresis is complete, turn off the power supply, and remove the slide carrier from the electrophoresis tank. Allow the slide carrier to drain on tissue paper for 30 seconds.
Next, place the slide carrier into a dish containing neutralization buffer, and leave it for 20 minutes. Following this, place it in a washing dish containing ice-cold double-distilled water, and leave it for 20 minutes. After washing, remove the slide carrier from the water, and allow the slides to dry in an incubator at 37 degrees Celsius for 1 hour.
To rehydrate the slides, transfer the slide carrier to a washing dish containing ice-cold double-distilled water and leave it for 30 minutes. Then, place the slide carrier into a staining dish containing 2.5 micrograms per milliliter propidium iodide solution.
Close the lid of the staining dish, and incubate it for 20 minutes in the dark at room temperature. After incubation, transfer the slide carrier to a separate dish, and wash it with ice-cold double-distilled water for 20 minutes.
Remove the slide carrier from the dish, and dry it completely in the dark, either in a 37 degrees Celsius incubator or at room temperature. After the slides dry completely, store them in a slide box in the dark until ready for image analysis.

Comet Assay zur Detektion von DNA-Schäden in Zellen

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Assay Techniques

Cell-based assays

EoE Sub Articles

Thiobarbituric Acid-Reactive Substances Assay to Assess Oxidative Stress in Human Serum

Label the glass tubes for the samples to be analyzed, then, add 100 microliters of the prepared sample to each tube. Add 200 microliters of 8.1% SDS to each sample, and gently swirl the glass tube in a circular motion to mix.
Add 1.5 milliliters of 3.5 molar sodium acetate buffer to each sample. Then, add 1.5 milliliters of aqueous 0.8% thiobarbituric acid solution. Bring the final volume in each tube to 4 milliliters by adding 700 microliters of deionized water. Tightly cap the glass tubes, and incubate them in a heating block set to 95 degrees Celsius for 1 hour. Cover the tubes with aluminum foil to prevent condensation. Then, remove the tubes from the block and incubate them on ice for 30 minutes.
After the incubation, centrifuge the samples and standards at 1,500 x g for 10 minutes at 4 degrees Celsius. Transfer 150 microliters of supernatant from each tube to a well in a 96-well plate, removing any air bubbles with a pipette tip.
Measure the absorbance of the samples at 532 nanometers. Then, subtract the average absorbance reading of the blank samples from all other absorbance readings.
Create a standard curve and use it to calculate unknown sample concentrations.

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

Zusammenfassung

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