Die Autoren bedanken sich bei Dr. Steve Withers und Hong-Ming Chen für die Bereitstellung von DNP-cellobiosid Substrat danken.

Bevor dieses Protokoll, müssen Sie Ihre metagenomische Bibliothek in einer 384-Well-Platte-Format gespeichert. In unserer Studie haben wir die pCC1 Kopierschutz Fosmid Vektor in Kombination mit dem Phagen T1-resistente TransforMax EPI300-T1 R E. coli-Zellen, da die Bibliothek Host gespeichert und unsere Platten bei -80 ° C 11. 1. Die Replikation der metagenomische Bibliothek Plates <ol><li> Defrost die Platten mit Ihrer Bibliothek bei 37 ° C für ca. 20 Minuten, oder bis alle Brunnen sind aufgetaut. </li><li> Verwenden Sie das UV-Licht sterilisiert Funktion auf dem qPix2, um den Roboter für 15 Minuten zu sterilisieren. </li><li> Bereiten LB-Medium mit Chloramphenicol in einer Endkonzentration von 12.5ug/mL und Arabinose bei 100ug/mL in einem 500 ml Reagenzflasche. Jede Platte verwenden ca. 20 ml, plus einen zusätzlichen 50 mL für Totvolumen zu ermöglichen. </li><li> Richten Sie die qFill3 gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den Medien Flasche an den Verteiler über die sterile Schlauch befestigt. Programm ist für die entsprechende Menge an Medien, und setzen Sie ihn auf eine 45uL Volumen in jede Vertiefung zu füllen. </li><li> Spülen Sie die Luft aus dem Schlauch und Verteiler mit der Säuberung Funktion des Roboters bis Medien zu sehen ist, die aus jedem Pin des Verteilers. </li><li> Füllen Sie die gewünschte Anzahl von Platten mit LB-Medium mit dem qFill3. Jede Platte dauert ca. 20 Sekunden zu füllen. </li><li> Laden Sie die Bibliothek Platten und die frische Platten in die entsprechenden Bereiche der qPix2 Roboter. Füllen Sie die Reinigungsbäder mit den entsprechenden Reagenzien, 2% Micro90 im hinteren Bad, autoklaviert destilliertem Wasser in der Mitte Bad, 80% Ethanol in den vorderen Bad. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Replizieren&quot;-Programm der qPix2. In der Software, wählen Sie die entsprechende Kopf, Anzahl und Art der Quelle Platten-und Ziel-Platten. Auch bis der Kopf zwischen den Replikationen, in der Regel 6 Zyklen in jedem Bad sauber eingestellt ist genug. Kapazität der Maschine ist 10 Platten in einer Zeit, und es dauert etwa 15 Minuten, um sie alle mit einem 384 Pin Kopf (oder ca. 50 Minuten mit einem 96 pin Kopf) zu replizieren. Hinweis: Es gibt eine Option, &quot;Stir Source&quot; oder &quot;Stir Destination&quot;. Es wird empfohlen, nicht zu verwenden, diese Optionen als Probleme vorher mit unserem Roboter mit ihnen aufgetreten sind. </li><li> Sobald die Platten repliziert werden, wachsen die Platten bei 37 ° C für 24 Stunden in einer feuchten Box. Weil wir Induktion einer hohen Kopienzahl Fosmid werden unter Zusatz von Arabinose, neigen die Klone wachsen langsamer als nicht-induzierten Klone. Return der Bibliothek Platten bis -80 ° C. Hinweis: Die Inkubation in einer feuchten Box sorgt für Verdunstung von Medien nicht in den Brunnen am Rand der Platten auftreten, halten eine einheitliche Umgebung für alle Vertiefungen. </li><li> Reinigen Sie die qFill3 Roboter, indem Sie zuerst Spülen mit Wasser (~ 50ml) und dann 80% Ethanol (~ 50ml). Zerlegen der Komponenten und sauber und Autoklaven die Flasche, Deckel und Schlauch in Aluminiumfolie eingewickelt. </li></ol> 2. Messung des Wachstums von E. coli-Klone <ol><li> Entfernen Platten von 37 ° C Inkubator. Nehmen und beiseite stellen den Deckeln verschließen und Platten auf das Magazin Ladefläche mit dem RapidStak vorgesehen, bis zu einem Maximum von 25 Platten. Hinweis: Die Platte an der Unterseite des Stapels wird der erste, der gelesen werden kann. Achten Sie darauf, den Überblick über die Reihenfolge der Platten zu halten, da die Software nicht aufzeichnen tut dies. </li><li> Nehmen Sie ein Magazin aus dem Rapid Stak, sicherzustellen, dass sie leer ist, und schieben Sie sie auf den Stapel der Platten zu lesen. Anmeldung durch den Griff, und die Platten sollten alle in das Magazin geladen werden. Laden Sie das Magazin in den RapidStak. Hinweis: Das Magazin hat eine kleine Schraube in der Ecke bezeichnet die Ecke der A1 Vertiefungen der Platten gehen sollte. Das Magazin wird nur in der RapidStak Montage in eine Richtung. </li><li> Öffnen Sie die SkanIt RE-Programm auf den Computer angeschlossen, um die Maschinen. Wählen Sie &quot;New Session&quot; und nennen Sie sie entsprechend. Wählen Sie &quot;Corning Flachboden 384-Well-Platte&quot;, wie die Platte geben. </li><li> In der &quot;Plate Layout&quot;-Bereich, wählen Sie den &quot;Wizard&quot;-Schaltfläche, und wählen Sie es zu 384 Unbekannten auf Ihren Teller hinzuzufügen. </li><li> In dem &quot;Protokoll&quot;-Bereich, wählen Sie die &quot;Well-Loop&quot;-Option, und geben Sie für 384 Wells. Ein &quot;Gut Loop&quot;-Symbol wird in den Fluss-Baum auf der linken Seite des Bildschirms angezeigt. Wählen Sie das Symbol und klicken Sie auf &quot;Photometrische Messung&quot;. Setzen Sie ihn auf bei 600nm gelesen. </li><li> Speichern Sie Ihre Protokoll mit einem eindeutigen Namen, und schließen Sie die SkanIt RE-Programm. </li><li> Auf dem Computer, öffnen Sie die PolaraRS Programm. </li><li> Auf der Hauptseite gibt es tabellarische Auflistung der Instrumente mit dem RapidStak Gerät sein. Die VarioSkan sollte auf der linken Seite dieser Tabelle. Unter der Überschrift VarioSkan, wird es zwei Links werden; &quot;RunSession&quot; und &quot;Inkubation&quot;. Klicken Sie auf die &quot;RunSession&quot;-Option. </li><li> Ein neues Fenster, das Assay-Fenster wird mit einem Flussdiagramm in der Mitte angezeigt. Wählen Sie den &quot;RunSession&quot; item (es sollte das einzige Element vorhanden sein). Auf der rechten Seite des Bildschirms ein Drop-Down-Menüwird angezeigt. Suchen Sie den Namen der gespeicherten SkanIt RE in diesem Menü ausgeführt werden. Hinweis: Es scheint keine rationalen Ordnung, um dieses Menü werden. Es ist nicht alphabetisch oder nach Datum hinzugefügt oder im Zusammenhang mit dem auf dem Computer das Protokoll gespeichert wird. Das heißt, Sie müssen über alle Protokolle vor der Suche nach Ihrem eigenen, die Schmerzen zu suchen. </li><li> Sobald Sie Ihr Protokoll ausgewählt, in der oberen rechten Ecke klicken Sie auf &quot;Run diesem Assay&quot;. </li><li> Ein Feld wird angezeigt, in dem Sie bezeichnen die Zeitschrift als Quelle zu verwenden, und die Zeitschrift ist leer. Das untere Feld auf dem Bildschirm entspricht dem vorderen Magazin. [Optional: Es fordert Sie auf, die Anzahl der Platten geladen werden, um eine Schätzung für die Zeit, es dauert bestimmt geben. Diese Schätzung wird in der Regel weg.] </li><li> Stellen Sie sicher, sowohl die RapidStak und die VarioSkan eingeschaltet sind, und drücken Sie &quot;OK&quot;. </li><li> Die RapidStak wird automatisch geladen Ihre Platten in die Platten-Lesegerät, so dass für die kontinuierliche Messung der Platten. So lesen 25 Stück dauert etwa 50 Minuten. Hinweis: Es wird empfohlen, die erste Platte Laden in den VarioSkan beobachten, um die richtige Ausrichtung der Maschinen zu gewährleisten. Wenn die RapidStak nicht geladen wird die Platte Leser richtig, verwenden Sie die &quot;Pause diesen Test&quot;-Taste in der oberen rechten Ecke des PolaraRS Fenster. </li><li> Sobald die VarioSkan erfolgt das Lesen der Platten, entfernen Sie den vollen Magazin und legen Sie es auf das Magazin Ladefläche. Heben Sie die äußere Rechteck der Plattform, und das Magazin sollte abrutschen, so dass die Platten stehen in einem Haufen in der Mitte. Ersetzen Sie den Deckel auf den entsprechenden Platten. </li></ol> 3. Neben der Assay Mix zu jeder Platte <ol><li> Bereiten Assay-Mix mit vorgefertigten 10fach Lyse-Mix (10% Triton X-100, 100 mM ris, 10 mM EDTA) in 50 mM Kalium-Acetat-Puffer bei pH 5,5. Bereiten Sie einen Vorrat von bis zu 75mg/ml DNP-cellobiosid Substrat in DMSO, so dass das Substrat vollständig gelöst ist. Add DNP-cellobiosid Stammlösung zu Assay-Mix, um eine endgültige Konzentration von 0.1mg/mL. Jede Platte verwenden ca. 20 mL der Lösung, plus einen zusätzlichen 50 mL für Totvolumen zu ermöglichen. Hinweis: DNP-cellobiosid ist nicht leicht löslich in Wasser, so löst in DMSO erhöht die Löslichkeit. Die Anwesenheit von DMSO in der letzten Test-Lösung hat keine beobachtbaren Effekte. </li><li> Richten Sie die qFill3 gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den Medien Flasche an den Verteiler über die sterile Schlauch befestigt. Programm ist für die entsprechende Menge an Medien, und setzen Sie ihn auf eine 45uL Volumen in jede Vertiefung zu füllen. </li><li> Spülen Sie die Luft aus dem Schlauch und Verteiler mit der Säuberung Funktion des Roboters bis Medien zu sehen ist, die aus jedem Pin des Verteilers. </li><li> Add-Assay-Mix zu jeder Platte mit dem qFill3. Jede Platte dauert ca. 20 Sekunden zu füllen. </li><li> Sobald Assay Mix zugegeben, inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in einer feuchten Box für 12-16 Stunden. Hinweis: Over-Inkubation von Platten, wenn der Assay-Mix hinzugefügt wird Verdunstung in den äußeren Vertiefungen der Platte verursachen, was zu höheren Absorptionswerte als für die Innen-Brunnen zu sehen. Dies kann durch Inkubation Platten in eine feuchte Kammer ausgeglichen werden. </li></ol> 4. Messung der Absorption von Assay-Clones <ol><li> Entfernen Platten von 37 ° C Inkubator. Nehmen und beiseite stellen den Deckeln verschließen und Platten auf das Magazin Ladefläche mit dem RapidStak vorgesehen, bis zu einem Maximum von 25 Platten. Hinweis: Die Platte an der Unterseite des Stapels wird der erste, der gelesen werden kann. Achten Sie darauf, den Überblick über die Reihenfolge der Platten zu halten, da die Software nicht aufzeichnen tut dies. </li><li> Nehmen Sie ein Magazin aus dem Rapid Stak, sicherzustellen, dass sie leer ist, und schieben Sie sie auf den Stapel der Platten zu lesen. Anmeldung durch den Griff, und die Platten sollten alle in das Magazin geladen werden. Laden Sie das Magazin in den RapidStak. Hinweis: Das Magazin hat eine kleine Schraube in der Ecke bezeichnet die Ecke der A1 Vertiefungen der Platten gehen sollte. Das Magazin wird nur in der RapidStak Montage in eine Richtung. </li><li> Öffnen Sie die SkanIt RE-Programm auf den Computer angeschlossen, um die Maschinen. Wählen Sie &quot;New Session&quot; und nennen Sie sie entsprechend. Wählen Sie &quot;Corning Flachboden 384-Well-Platte&quot;, wie die Platte geben. </li><li> In der &quot;Plate Layout&quot;-Bereich, wählen Sie den &quot;Wizard&quot;-Schaltfläche, und wählen Sie es zu 384 Unbekannten auf Ihren Teller hinzuzufügen. </li><li> In dem &quot;Protokoll&quot;-Bereich, wählen Sie die &quot;Well-Loop&quot;-Option, und geben Sie für 384 Wells. Ein &quot;Gut Loop&quot;-Symbol wird in den Fluss-Baum auf der linken Seite des Bildschirms angezeigt. Wählen Sie das Symbol und klicken Sie auf &quot;Photometrische Messung&quot;. Setzen Sie ihn auf bei 400 nm gelesen. </li><li> Speichern Sie Ihre Protokoll mit einem eindeutigen Namen, und schließen Sie die SkanIt RE-Programm. </li><li> Auf dem Computer, öffnen Sie die PolaraRS Programm. </li><li> Auf der Hauptseite gibt es tabellarische Auflistung der Instrumente mit dem RapidStak Gerät sein. Die VarioSkan sollte auf der linken Seite dieser Tabelle. Unter der Überschrift VarioSkan, wird es zwei Links werden; &quot;RunSession&quot; und &quot;INCUBATe &quot;. Klicken Sie auf die&quot; RunSession &quot;-Option. </li><li> Ein neues Fenster, das Assay-Fenster wird mit einem Flussdiagramm in der Mitte angezeigt. Wählen Sie den &quot;RunSession&quot; item (es sollte das einzige Element vorhanden sein). Auf der rechten Seite des Bildschirms ein Drop-Down-Menü erscheint. Suchen Sie den Namen der gespeicherten SkanIt RE in diesem Menü ausgeführt werden. </li><li> Sobald Sie Ihr Protokoll ausgewählt, in der oberen rechten Ecke klicken Sie auf &quot;Run diesem Assay&quot;. </li><li> Ein Feld wird angezeigt, in dem Sie bezeichnen die Zeitschrift als Quelle zu verwenden, und die Zeitschrift ist leer. Das untere Feld auf dem Bildschirm entspricht dem vorderen Magazin. [Optional: Es fordert Sie auf, die Anzahl der Platten geladen werden, um eine Schätzung für die Zeit, es dauert bestimmt geben. Diese Schätzung wird in der Regel weg.] </li><li> Stellen Sie sicher, sowohl die RapidStak und die VarioSkan eingeschaltet sind, und drücken Sie &quot;OK&quot; </li><li> Die RapidStak wird automatisch geladen Ihre Platten in die Platten-Lesegerät, so dass für die kontinuierliche Messung der Platten. Hinweis: Es wird empfohlen, die erste Platte Laden in den VarioSkan beobachten, um die richtige Ausrichtung der Maschinen zu gewährleisten. Wenn die RapidStak nicht geladen wird die Platte Leser richtig, verwenden Sie die &quot;Pause diesen Test&quot;-Taste in der oberen rechten Ecke des PolaraRS Fenster. </li><li> Sobald die VarioSkan erfolgt das Lesen der Platten, entfernen Sie den vollen Magazin und legen Sie es auf das Magazin Ladefläche. Heben Sie die äußere Rechteck der Plattform, und das Magazin sollte abrutschen, so dass die Platten stehen in einem Haufen in der Mitte. Die Platten können nach Ihrem Labor entsorgt werden. </li><li> Um die Absorption Lesungen, offene SkanIt RE-Software, Export und wählen Sie &quot;Öffnen einer vorhandenen Datei&quot;. </li><li> Wählen Sie das Verzeichnis, in dem Sie Ihre Sitzung, auf den &quot;+&quot;-Symbol, um die Liste zu erweitern und unter dem Titel Überschrift wird Möglichkeiten der Beschriftung &quot;Container 1&quot; bis &quot;Container N&quot; in Abhängigkeit von der Anzahl der Platten sein. Wählen Sie die erste Platte analysiert werden. </li><li> In der Menüleiste am oberen Rand der Seite, wählen Sie &quot;Data Processing&gt; Report / Export&quot; </li><li> Wählen Sie die Optionen für den Export gewünscht. Hinweis: ich normalerweise wählen &quot;Plate Layout&quot; und &quot;Photometrische&quot; Daten für den Export. </li><li> Klicken Sie auf &quot;View Report&quot; und dann &quot;Datei&gt; Speichern&quot;. Wählen Sie das gewünschte Verzeichnis. Das Ausgabeformat ist eine Microsoft Excel-Tabelle </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel Absorptionswerte aus einer 384-Well-Platte mit einem positiven Klon ist in Abbildung 2 dargestellt. Positive Klone zeigen eine deutliche Zunahme der Absorption über diejenigen, die nicht zum Ausdruck Cellulase-Aktivität. Unterschiede in der Assay-Zeit, auch Standort auf der Platte oder DNP-Konzentration (kann durch das Herausfiltern von nicht gelösten DNP eingeführt werden) können sich auf absolute Absorptionswerte. Relative Absorptionswerte, wie der Unterschied in der Absorption oberhalb der Platte durchschnittliche oder Spalte Durchschnitt sind eine robuste Methode zur Identifizierung von Cellulase positive Klone. Nach der Identifizierung der positiven Klone aus der Bibliothek Platten, ist es empfehlenswert, alle positiven Klone in eine neue Platte für sekundäre Screening replizieren. Dadurch entfällt Effekte aus gut Standort oder Platte Variation und sorgt für mehr direkte Vergleich zwischen positiven Klone. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Ablaufschema des High-Throughput-Assay für eine metagenomische Bibliothek in E. geklont coli und bei -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Absorptionswerte von einer 384-Well-Platte mit einem positiven Klon. Cellulase positive Klone können durch eine deutlich erhöhte Absorption über die negativen Klone identifiziert werden.

<ol>
	<li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+cellulosic+biofuels.">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li><li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase.">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li><li>Duan, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+assay+methods:+a+review.">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li><li>Kasana, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production.">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses.">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li><li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+amplifiable+BACs:+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones.">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li><li>Johnson, E. 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Ein hoher Durchsatz-Bildschirm für den schnellen Nachweis von cellulolytische Aktivität aus einer großen einfügen genomischer DNA metagenomische Bibliothek in E. ausgedrückt coli ist in diesem Protokoll beschrieben. Diese Methode ist eine Verbesserung gegenüber dem CMC / Congo Red Assay häufig in der Literatur verwendet. Es ist Lösung, und ermöglicht die Ein-Topf-Chemie-Screening in 384-Well-Platten, mit der endgültigen Ausgabe als Absorptionswerte von einem Platten-Lesegerät ermöglicht fü...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>qPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-pin gridding head</td>
</tr>
<tr>
<td>qFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-well manifold</td>
</tr>
<tr>
<td>Varioskan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RapidStak</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Connected to Varioskan</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro90 Detergent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>18100-00</td>
<td>Diluted to 2% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Major Lab Supplier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluted to 80% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0378</td>
<td>12.5mg/mL in ethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>LB broth, Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1426-2</td>
<td>25g/L, autoclaved</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384-well flat bottom plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3680</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-(+)-Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3256</td>
<td>100mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P171</td>
<td>50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T3253</td>
<td>In TE buffer solution, 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA disodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>In TE buffer solution, 10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Provided by Dr. Steve Withers, UBC</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries

Cellulose, die ergiebigste Quelle von organischem Kohlenstoff auf der Erde, verfügt über weit reichende industrielle Anwendungen mit zunehmendem Schwerpunkt auf die Produktion von Biokraftstoffen 1. Chemische Methoden zu ändern oder zu degradieren Zellulose erfordern in der Regel starke Säuren und hohen Temperaturen. Als solche haben enzymatischen Methoden werden in der biologischen Umwandlung Prozess im Vordergrund. Während die Identifizierung von aktiven Cellulasen aus Bakterien und Pilzen isoliert wurde etwas effektiver, widerstehen die überwiegende Mehrheit der Mikroben in der Natur Labor Anbau. Environmental Genomics, auch als Metagenom, Screening-Ansätze bekannt sind äußerst viel versprechend bei der Überbrückung der Anbau Lücke in der Suche nach neuen Biokonversion Enzyme. Metagenomische Screening-Methoden erfolgreich neuartige Cellulasen aus Umgebungen wieder wie als Böden 2, Büffel Pansen 3 und die Termiten Enddarm 4 mit Carboxymethylcellulose (CMC)-Agarplatten mit Kongorot-Farbstoff (basierend auf der Methode der Teather und Holz 5) gefärbt vielfältig. Doch die CMC-Methode in den Durchsatz begrenzt ist, ist nicht quantitativ und manifestiert ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis 6. Andere Methoden wurden 7,8 berichtet, aber jeder Verwendung einer Agar-Platte-basierter Assay, was unerwünscht für das Hochdurchsatz-Screening von großen einfügen genomische Bibliotheken ist. Hier präsentieren wir eine Lösung basierende Bildschirm für Cellulase-Aktivität unter Verwendung eines chromogenen Dinitrophenol (DNP)-cellobiosid Substrat 9. Unsere Bibliothek wurde in den pCC1 Kopierschutz Fosmid zu Assaysensitivität durch Kopienzahl Induktion 10 erhöhen geklont. Das Verfahren nutzt Ein-Topf-Chemie in 384-Well-Mikroplatten mit der endgültigen Anzeige als Extinktionsmessung zur Verfügung gestellt. Diese Anzeige ist quantitativ, empfindlich und automatisiert mit einem Durchsatz von bis zu 100x 384-Well-Platten pro Tag mit einem Liquid Handler und Platten-Lesegerät mit angeschlossenem Stapelsystem.

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A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Dieses Protokoll beschreibt einen hohen Durchsatz Bildschirm für cellulolytische Aktivität von einem metagenomische Bibliothek in Escherichia coli exprimiert. Der Bildschirm ist Lösung und hoch automatisiert und nutzt Ein-Topf-Chemie in 384-Well-Mikroplatten mit dem letzten Auslesen als Extinktionsmessung.

Ein High-Throughput-Screen für Biomining Cellulase Aktivität von Metagenombanken

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

a-high-throughput-screen-for-biomining-cellulase-activity-from

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Aufrufe.  University of British Columbia - UBC. Dieses Protokoll beschreibt einen hohen Durchsatz Bildschirm für cellulolytische Aktivität von einem metagenomische Bibliothek in Escherichia coli exprimiert. Der Bildschirm ist Lösung und hoch automatisiert und nutzt Ein-Topf-Chemie in 384-Well-Mikroplatten mit dem letzten Auslesen als Extinktionsmessung.

Serie: A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Forschung

Biologie

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

Here we describe a method for preparation of both single read and paired end Illumina mRNA-Seq sequencing libraries for gene expression analysis based on T7 linear RNA amplification. This protocol requires only 10 nanograms of starting total RNA and generates highly consistent libraries representing whole transcripts.

Single Read und Paired End mRNA-Seq Illumina Bibliotheken von 10 Nanogramm Gesamt-RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Ein Handbuch Kleine Molecule Bildschirm Nähern Hochdurch Mit Zebrafischembryonen

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;