Die Autoren bedanken sich bei Nancy Mora für ihre technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder 48.573-M und 168098 vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexiko und durch Zuschüsse IN212308 und IN205311-2 von Dirección General de Asuntos del Personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Mexico finanziert.

Ein. Isolation von Neutrophilen (PMN) aus menschlichem Blut <ol><li> Verwenden etwa 20 ml Humanblut mit Heparin (10 U / ml) als Antikoagulans. Blut wurde von gesunden erwachsenen Freiwilligen durch intravenösen gesammelt. UNAM - Alle Experimente wurden unter Zustimmung des Bioethik-Ausschusses am Instituto de Investigaciones Biomédicas getan. </li><li> Geben Sie 2 ml 6% Dextran T500 in PBS in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und 10 ml Blut. Mix durch Invertieren des Röhrchens zwei oder drei Mal und lassen Sie es für 45 Minuten sitzen, um für Blutsenkungsgeschwindigkeit ermöglichen. </li><li> In einem frischen 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen legte 5 ml Ficoll-Paque. </li><li> Nehmen Sie die Leukozyten-reiche Plasma, das über sedimentiert Erythrozyten gebildet und sorgfältige Pipettierung es oben auf der Ficoll-Paque Bildung einer zweiten Schicht. Stellen Sie sicher, gibt es zwei Phasen. </li><li> Zentrifuge bei 516 × g für 20 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation an der Interphase von Plasma und Ficoll-Paque befindet sich eine Schicht von mononukleären Zellen. Neutrophils sind am Boden des Röhrchens. </li><li> Beseitigen Sie den Überstand, brechen das Zellpellet indem das Rohr gegen ein Rack und die Zellen resuspendieren durch Zugabe von 10 ml kaltem (4 ° C) PBS. Hinweis: Resuspendieren der Zellen durch Auf-und Abpipettieren wird nicht empfohlen, da dies zu schädlich für die Zellen. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 290 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Brechen Sie das Zellpellet nach wie vor und mit 10 ml kaltem (4 ° C) hypotone Lösung (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4), um Erythrozyten zu lysieren. Mix durch Verwirbelung das Rohr vorsichtig von Hand genau eine Minute. </li><li> 10 ml kaltem (4 ° C) hypertonischen Lösung (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), mischen und zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometer (in der Regel&gt; 95% PMN). Hinweis: Bewahren Sie den Schlauch mit der Zellsuspension auf Eis beim Zählen der Zellen. </li><li> Zentrifuge nach vor und resuspendieren PMN bei 107 Zellen / ml in kaltem (4 ° C) PBS. Halten Sie auf dem Eis. Hinweis: Neutrophile lebensfähig bleiben und funktionelle bei 4 ° C für etwa 6 bis 8 Stunden. </li></ol> 2. Aktivieren PMN <ol><li> Legen Sie 100 ul PMN Suspension (1 x 10 7 Zellen / ml) in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Hinweis: Probengefäss sollte mindestens in Doppelbestimmung durchgeführt werden. Übliche negative Kontrollen sollten erste Antikörper nur, und sekundären Antikörper nur die. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden Anti-Integrin oder anti-Fc-Rezeptor monoklonaler Antikörper (mAb) mit 10 ug / ml und Inkubation auf Eis für 15 min. </li><li> Waschen PMN durch Zugabe von 1 ml kaltem (4 ° C) PBS, Zentrifugation bei 1.743 xg (4.500 rpm) in einer Mikrozentrifuge und Absaugen des Überstandes. </li><li> Brechen Sie das Zellpellet durch Antippen der Unterseite des Rohrs gegen ein Rack, 1 ml kaltem PBS, und waschen Sie noch zwei weitere Male, wie im vorherigen Schritt. Hinweis: Diese wäscht Entfernung ungebundener Antikörper. </li><li> Resuspendieren PMN in der gleichen (initial) Volumen von warmem (37 ° C) PBS, enthaltend 60 ug / ml F (ab &#39;) 2 Ziegen anti-Maus-IgG. Anmerkung: Die sekundären anti-Maus-IgG-Antikörper wird an den ersten anti-Rezeptor-Antikörper zu binden und Vernetzung des Rezeptors verursachen. </li><li> Bei 37 ° C während 1 bis 20 min, je nach Kernfaktor von Interesse. Für NF-KB üblicherweise 15 min und für Elk-1 üblicherweise 5 min. Hinweis: Die Inkubation der Zellen bei 37 ° C induziert Rezeptor-Vernetzung, die nicht stattfinden kann bei 4 ° C. </li><li> 1 ml kaltem PBS und zentrifugieren 3 min bei 1.743 xg in Mikrozentrifuge. </li><li> Überstand entfernen </li><li> Frieren PMN sofort dry-ice/ethanol Bad und halten sie dort für 10 min. </li></ol> 3. Isolation und Fixierung der Kerne <ol><li> Resuspendieren gefrorenen PMN Pellet in 100 ul kaltem (4 ° C) hypotonischen Puffer (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, und 1 mM frisch-added DL-Dithiothreitol [DTT], PH = 7,9). Es wird empfohlen, die Rohre nehmen aus dem dry-ice/ethanol Bad eins nach dem anderen, und Wischen Sie die Unterseite des Rohres vor der Zugabe der hypotonen Puffer. </li><li> Auf Eis, und überprüfen Kerne Integrität durch Färbung einen aliquoten Teil der Kerne Suspension mit Trypanblau. Kerne umsehen und blau. PMN intakten nicht angefärbt, erhalten und Zelltrümmer erscheint als blaue Teilchen von unregelmäßiger Form. Hinweis: Wenn Kerne Suspension enthält viele intakte Zellen oder Schmutz, ist es besser, die Vorbereitung zu verwerfen und wiederholen Sie den Vorgang mit einer anderen Probe. </li><li> Zentrifuge Kerne bei 775 xg (3.000 rpm) in Mikrozentrifuge für 10 min in einem kalten Raum. An diesem Punkt Kerne sehr zerbrechlich und besondere Sorgfalt sollte im Einklang die Proben kalt und nicht Zentrifugieren bei übermäßigen Kräften getroffen werden. </li><li> Überstand entfernen, indem Sie sehr vorsichtig Pipettieren. </li><li> Je 100 ul kaltem 4% Paraformaldehyd in PBS auf Kerne zu fixieren. Hinweis: Das Pellet wird sehr locker eind Zugabe des Puffers ausreicht, um die Kerne zu resuspendieren. Und Abpipettieren sollte vermieden werden. </li><li> Inkubieren auf Eis für 20 min. </li><li> Immunolabel Kerne für die Durchflusszytometrie oder halten sie für bis zu 24 Stunden bei 4 ° C. </li></ol> 4. Kerne Immunmarkierung für die Durchflusszytometrie-Analyse <ol><li> Zentrifuge Kerne bei 1.743 xg (4.500 rpm) in Mikrozentrifuge für 1 min, und entfernen Sie Überstand durch sehr vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Je 100 ul kaltem (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% Paraformaldehyd in PBS auf Kerne permeabilisieren. Inkubieren auf Eis für 10 min. </li><li> Centrifuge permeabilisiert Kerne bei 1.743 xg in Mikrozentrifuge und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. An diesem Punkt Kerne Pellets nicht gut befestigen am Boden des Röhrchens. Es wird empfohlen, wieder zentrifugiert, wenn das Pellet wird locker. </li><li> Resuspendieren Kerne in 500 ul kaltem 4% fötales Rinderserum (FBS) in PBS unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, und Inkubieren auf Eis für 20 min. ZentrifugierenKerne bei 1.743 xg für 3 min in Mikrozentrifuge und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. </li><li> Resuspendieren Kerne in 100 ul kaltem PBS mit 4% FBS und 2,5 ug / ml des mAb gegen den nuclear factor von Interesse. Inkubieren auf Eis für 20 min. Hinweis: Übliche negative Kontrollen sollten Anti-Atomkraft-Antikörper nur beinhalten, und FITC-markierten sekundären Antikörper nur. </li><li> Zweimal waschen mit 500 ul kaltem PBS mit 4% FBS und Zentrifugation bei 1743 xg für 3 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand sehr vorsichtig resuspendieren Kerne in 100 ul kaltem PBS mit 4% FBS und 10 ug / ml des entsprechenden FITC-markierten sekundären Antikörper und Inkubation auf Eis für 20 min. </li><li> Waschen Kerne zweimal mit 500 &amp;mgr; l kaltem PBS mit 4% FBS wie in den vorangegangenen Schritt. </li><li> Resuspendieren Kerne in 400 &amp;mgr; l kaltem 4% Paraformaldehyd in PBS. Anmerkung: Die Zellkerne werden in Paraformaldehyd platziert, damit die Probe für mehrere Tage gelagert werden ohne KontaminationProbleme, die in der Gegenwart von Serum auftreten kann. </li><li> Analysieren sofort durch Durchflusszytometrie oder dunkel lagern bei 4 ° C bis zu drei Tage. </li></ol> 5. Durchflusszytometrie-Analyse <ol><li> Analysieren immunmarkierten Kerne in einem Durchflußzytometer wie einem FACScan (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) oder einer ähnlichen Vorrichtung. </li><li> Passen Akquisition Einstellungen: FSC bei log-Skala auf 10-1, SSC bei log-Skala bei 196 und Gate-Kerne in einem Dot-Plot. </li><li> Erwerben zehntausend Kerne pro Probe. </li><li> Analysieren Fluoreszenz von FITC-gefärbten Zellkernen durch die FL-1-Kanal (506 nm) bei log-Skala auf 400 eingestellt. </li></ol>

<ol>
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Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).</li><li>Valente, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+increases+camptothecin-induced+apoptosis+by+inhibition+of+NF-&#954;B.">TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-&#954;B.</a> Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).</li><li>Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NF-&#954;B+by+a+TAT-NEMO-binding+domain+peptide+accelerates+constitutive+apoptosis+and+abrogates+LPS-delayed+neutrophil+apoptosis.">Inhibition of NF-&#954;B by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis.</a> Blood. 102, 2259-2267 (2003).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+neutrophil+apoptosis+by+type+1+IFN+depends+on+cross-talk+between+phosphoinositol+3-kinase,+protein+kinase+C-d,+and+NF-&#954;B+signaling+pathways.">Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-&#954;B signaling pathways.</a> J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).</li><li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells.">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).</li><li>Garcia-Garcia, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+activation+by+Fc&#947;R+in+human+peripheral+blood+neutrophils+detected+by+a+novel+flow+cytometry-based+method.">Nuclear factor activation by Fc&#947;R in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method.</a> J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).</li><li>Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc&#947;RIIA+and+Fc&#947;RIIIB+mediate+nuclear+factor+activation+through+separate+signaling+pathways+in+human+neuthophils.">Fc&#947;RIIA and Fc&#947;RIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils.</a> J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Reinigung hier beschriebene Methode ermöglicht die Isolierung von unstimulierten Neutrophilen (PMN) mit einer Reinheit größer als 95% (bestimmt durch mikroskopische Beobachtung), in einer kurzen Zeit. Manchmal kann durch Neutrophile Erythrozyten kontaminiert werden, wenn letztere nicht vollständig lysiert werden. Dies bedeutet in der Regel nicht auf die Technik, da Erythrozyten und PMN kann leicht als deutliche Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie unterschieden werden. Isoliert PMN kann dann durch Verne...

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut ein. Während Entzündungen und Infektionen Neutrophile sind die ersten Zellen, die an der betroffenen Stelle erscheinen, wo sie als erste Verteidigungslinie 2 handeln. Neutrophile besitzen mehrere antimikrobielle Mechanismen 3 einschließlich Phagozytose, die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die Freisetzung von lytischen Enzymen durch Degranulation und Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen 4,5. Neutrophile sind kurzlebige Zellen, die sich schnell durch Signalisierung von verschiedenen Rezeptoren auf der Zelloberfläche werden aktiviert. Obwohl Neutrophilen wurden berücksichtigt terminalen Zellen aufgrund ihrer kurzen Lebensdauer und weil sie Apoptose, wenn während des entzündlichen Prozesses 6 aktiviert unterziehen, ist es nun klar, dass sie auch ändern ihren Phänotyp, indem Sie die Ebene der Transkription bestimmter Gene. Die Produktion von Cytokinen 5 und der Hemmung der Apoptose 7,8 sind zwei iW ichtig aktivierungsabhängige Zellfunktionen auf der Ebene der Transkription in Neutrophilen reguliert. Nuclear factor kappaB (NF-kB) beteiligt sich an der transkriptionalen Kontrolle Zytokinproduktion 4 und bei der Regulation der Apoptose und Überleben der Zellen 9-11 in verschiedenen Zelltypen. Die Signalwege, die nuclear factor-Aktivierung führen, sind in der Regel durch Reportergen-Assays oder durch elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA) untersucht. Da jedoch Neutrophilen kurzlebigen Zellen sind, kann die Untersuchung von transkriptionell reguliert Reaktionen in diesen Zellen nicht mit Reportergen-Assays durchgeführt werden, da es keine effiziente Methoden zur Transfektion sind Neutrophilen. EMSA-Assays wurden in Neutrophilen verwendet worden, um nuclear factor-Aktivierung 12,13 erkunden, allerdings ist diese Methode aufwendig und teuer, da es die Verwendung von radioaktivem Material beinhaltet. Nukleofektion ist eine weitere Technik, die verwendet wurde successfully zu transfizieren Monozyten 14. Somit zumindest theoretisch könnte Kernfaktor Aktivierung der neutrophilen Granulozyten durch Transfektion detektiert werden (trotz niedriger Effizienz). Jedoch würde diese Technik teurer sein, zeitaufwendig und wahrscheinlich weniger quantitativ. Mikroskopische Analyse immunogefärbten Zellen könnten auch verwendet werden, um atomaren Faktoren im Kern zu erfassen. Tatsächlich haben wir NF-KB-Translokation in den Zellkern 15 auf diese Weise detektiert. Leider ist diese Technik auch zeitaufwendig, weniger quantitative und vorbehaltlich des Betrachters Bias. Hier stellen wir eine einfache und effiziente Methode, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren isoliert und immunmarkierten Kerne mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Wir beschreiben Techniken an Neutrophile aus humanen peripheren Blut zu isolieren, diese Zellen zu stimulieren über Integrine oder Fc-Rezeptoren mit anti-Rezeptor-Antikörpern, zu isolieren und immunolabel Kerne und analysieren Kerne durch Durchflusszytometrie (FBBILDUNG 1). Die Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um NF-kappaB 15 und Elk-1 16 Kernfaktoren in neutrophilen Kerne zu erkennen. Die Empfindlichkeit dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis von kleinen Änderungen in nuclear factor Ebenen im Zellkern. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um das Niveau von Transkriptionsfaktoren in Kernen von anderen Zellarten zu analysieren.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Heparin </td>
 <td >PiSA (Mexico)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Dextran T500</td>
 <td >Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) </td>
 <td>T1-Dextran T500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Ficoll-Paque</td>
 <td >Pharmacia</td>
 <td>17-0320-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium chloride </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S7653 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium phosphate monobasic</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S9638</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium phosphate dibasic</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S9390</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>A2153</td>
 <td>Cohn Fraction V</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >HEPES</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>H3375 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Potassium chloride</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>P9541 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Magnesium chloride anhydrous </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>M8266 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >DL-dithiothreitol (DTT) </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>D9163</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Trypan Blue (0.4 % solution)</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>T8154</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Paraformaldehyde</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>P6148 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Triton X-100 </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>X100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Fetal bovine serum (FBS)</td>
 <td >GIBCO</td>
 <td>10437-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody IV.3</td>
 <td >Medarex (Annandale, NJ) </td>
 <td>025-1 </td>
 <td>Human-specific anti-FcRII (CD32) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody 3G8</td>
 <td >Medarex (Annandale, NJ) </td>
 <td>028-2 </td>
 <td>Human-specific anti-FcRIII (CD16) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody TS2/16</td>
 <td >Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) </td>
 <td>Donated by Dr. Martin Hemler </td>
 <td>Human-specific anti-&beta;1 integrin (CD29)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody IB4</td>
 <td >University of California, San Francisco </td>
 <td>Donated by Dr. Eric J. Brown </td>
 <td>Human-specific anti-&beta;2 integrin (CD18)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >F(ab')2 goat anti-mouse IgG </td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55468</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG</td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55522</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG</td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55665</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-NF-&kappa;B p50</td>
 <td >Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td>
 <td>sc-114</td>
 <td>Rabbit polyclonal antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-NF-&kappa;B p65</td>
 <td >Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td>
 <td>sc-109</td>
 <td>Rabbit polyclonal antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15-ml centrifuge tube</td>
 <td >Corning</td>
 <td>430791</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50-ml centrifuge tube</td>
 <td >Corning</td>
 <td>430291</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge, Sorvall Tabletop</td>
 <td >Dupont Instruments</td>
 <td>RT 6000D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH-meter</td>
 <td >Corning</td>
 <td>340</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-20</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-200</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123601</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-1000</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123602</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hemocytometer</td>
 <td >Fisher Scientific</td>
 <td>0267110</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope</td>
 <td >Nikon </td>
 <td>Eclipse E600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope</td>
 <td >Nikon </td>
 <td>TMS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Bath Incubator</td>
 <td >Fisher Scientific </td>
 <td>2IS-M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td >Eppendorf</td>
 <td>5414C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td >Eppendorf</td>
 <td>5418</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flow Cytometer</td>
 <td >Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) </td>
 <td>FACScalibur </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut. Diese Zellen sind die ersten, an den Standorten der Entzündung und Infektion auftreten und somit als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Neutrophile besitzen wichtige Funktionen wie antimikrobielle Phagozytose, Freisetzung von lytische Enzyme, und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies. Zusätzlich zu diesen wichtigen Abwehrmechanismus funktioniert, führen Neutrophilen andere Aufgaben in Reaktion auf eine Infektion wie die Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Zytokine rekrutieren andere Leukozyten, die klar die Infektion zu helfen, und die Hemmung der Apoptose ermöglicht die Neutrophilen, länger zu leben am Ort der Infektion. Diese Funktionen werden auf der Ebene der Transkription reguliert. Da jedoch Neutrophilen kurzlebigen Zellen sind, kann die Untersuchung von transkriptionell reguliert Reaktionen in diesen Zellen nicht mit herkömmlichen Reportergen Verfahren durchgeführt werden, da es keine effiziente sindziente Techniken für neutrophilen Transfektion. Hier stellen wir eine einfache und effiziente Methode, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren isoliert und immunmarkierten Kerne mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Wir beschreiben Methoden zur reinen Neutrophilen aus humanen peripheren Blut zu isolieren, diese Zellen zu stimulieren mit anti-Rezeptor-Antikörpern, zu isolieren und immunolabel Kerne und analysieren Kerne durch Durchflusszytometrie. Die Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um NF-kappaB und Elk-1 Kernfaktoren in Kernen von Neutrophilen und anderen Zelltypen erkennen. Somit stellt diese Methode eine Option zum Analysieren Aktivierung von Transkriptionsfaktoren an isolierten Kernen aus einer Vielzahl von Zelltypen.

Die Reinigung hier beschriebene Methode der Regel bietet unstimulierten Neutrophilen (PMN) mit einer Reinheit von mehr als 95% (Abbildung 1A). Isoliert PMN kann dann durch Vernetzung insbesondere Rezeptoren mit spezifischen monoklonalen Antikörpern stimuliert werden. Wir haben PMN durch Fc-Rezeptoren und Integrine (1B) stimuliert. Einmal stimuliert, PMN lysiert und Kerne mit hohen Ausbeuten isoliert. Kerne werden dann für eine bestimmte nuclear factor, wie die Kernfaktor kappaB (NF-kB...

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A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im Blut. Neutrophile besitzen transkriptionell reguliert Funktionen wie Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Diese Funktionen können mit dem hier vorgestellten Verfahren, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren können mittels Durchflusszytometrie in isolierten Zellkernen untersucht werden

Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Aufrufe.  University of Alberta. Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im Blut. Neutrophile besitzen transkriptionell reguliert Funktionen wie Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Diese Funktionen können mit dem hier vorgestellten Verfahren, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren können mittels Durchflusszytometrie in isolierten Zellkernen untersucht werden

Serie: A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Studieren Wechselwirkungen von<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Mit Neutrophilen durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie Zeitraffer

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...