Wir danken Rebecca Nishi, MS, und die Techniker des Christopher &amp; Dana Reeve Foundation Tier Core Facility an der UC Irvine für ihre Hilfe in der Tier-Chirurgie. Wir danken auch Gabriella Funes, Usha Nekanti und Denisse Moreno für die technische Unterstützung, Manuskript und Video-Dreh Vorbereitungen und Animation. Diese Arbeit wurde durch NINDS (RO1 NS43428-01 bis AJA), die Lähmung Projekt von Amerika (PPA-32574 zu HXN) und California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Stem Cell Training Award T1-00008 zu HXN unterstützt. KDB wurde von der Ausbildung in der molekularen und zellulären Neurowissenschaften an der UC Irvine (T32 NS007444) unterstützt.

1. Dissoziation von Rückenmark <ol><li> Rückenmarksegmente T8-T10 von nicht verletzt oder Quetschung des Rückenmarks verletzt (Verletzung am T9) Sprague Dawley Ratten wurden seziert und mechanisch dissoziiert mit einer feinen Schere in HBSS bei Raumtemperatur, wie zuvor 1 beschrieben. Vor Gewebedissoziation wurden ganze Rückenmark Spalten auf Trockeneis für 5 Minuten vor der Extraktion der Schnur Segmente T8-T10 gehalten. </li><li> Tissue-Bits wurden durch Zentrifugation (1 Minute, 1000 rpm, Raumtemperatur) und enzymatisch gespalten mit 2,5 mg Trypsin und 5 mg Kollagenase in 5 ml DME (Dulbecco modifiziertem Eagle-Media) für 20 Minuten bei 37 ° C vor der Trituration (abgerufen ~ 10 Mal bei Raumtemperatur) mit einem Glas Pasteurpipette (9-Zoll). </li><li> 10 ml DME + 10% fötalem Rinderserum wurde, um Zellen hinzugefügt, um Enzymaktivitäten hemmen und wurde dann durch ein 40 um Zellsieb gefiltert. Nach einer schnellen Spin, wurde das Zellpellet in 6 ml HBSS resuspendiert und überlagert auf OptiPrep Gradienten-Lösungen beschrieben. </li></ol> 2. Erstellen OptiPrep Gradienten-Lösungen <ol><li> Das verwässerte OptiPrep wurde durch Verdünnung OptiPrep 1:1 mit MOPS-Puffer (0,15 M NaCl, 10 mM MOPS, pH 7,4) gebaut. </li><li> Vier OptiPrep Gradienten-Lösungen wurden durch Mischen von 350, 250, 200 oder 150 ul verdünnt OptiPrep mit HBSS auf ein Endvolumen von 1 ml (Tabelle 1). </li><li> Die vier Lösungen wurden langsam und vorsichtig in Schichten in einem 15 ml konischen Röhrchen gegeben mit der geringsten Verdünnung auf den Boden und die meisten verdünnten auf der Oberseite (Abbildung 1A). </li></ol> 3. Die Trennung Lipid / Myelin Trümmer von Zellen <ol><li> 6 ml dissoziierter spinalen Zellen in HBSS wurde sorgfältig auf der Oberseite des OptiPrep Gradienten Lösungen geschichtet. </li><li> Röhrchen mit Zellen und Gradienten-Lösungen wurde zentrifugiert (15 Minuten, 1900 rpm oder 726 RCF, 20 ° C) mit einer Eppendorf-Zentrifuge 5810R mit einem Ausschwingrotor (A-4 bis 62), die Trennung der Zell-Lösung in verschiedene Schichten mit Lipid / Myelin Trümmer (top 7 ml Tube), gefolgt von 3 Schichten von Neuronen, die mit entzündlichen Zellen, Gliazellen, und die roten Blutkörperchen in das Pellet gefolgt. Obwohl die meisten entzündlichen Zellen, einschließlich Monozyten, Makrophagen, PMN Granulozyten und Lymphozyten in das Pellet gefunden wurden, könnten einige großformatige-aktivierten Makrophagen in Schichten oberhalb des Pellet gefunden werden. </li><li> Die Lipid / Myelin Trümmer Schicht (oben 7 ml) wurde vorsichtig abgesaugt und abgeführt. Die Zellen wurden dann gewaschen und in 2,5 ml HBSS und für Immunomarkierung unten. </li></ol> 4. Immunomarkierung von spezifischen Immunzellen für die Durchflusszytometrie <ol><li> Cells (500 ul) aus Rückenmark Präparate gesammelt wurden pelletiert und in 0,85% Ammoniumchlorid (verdünnt in destilliertem Wasser) für 5 Minuten, um rote Blutkörperchen zu lysieren. </li><li> Die Zellen wurden mit 500 ul HBSS gewaschen und anschließend für 30 Minuten in normales Kaninchen oder Maus-Serum bei Raumtemperatur blockiert. </li><li> Die Zellen wurden gewaschen und bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit dem Antikörper (Rabbit anti-PMN FITC, Accurate Chemical und Scientific; Maus anti-Ratte ED1 Alexa 488, Serotec, oder Maus-anti-Ratte CD3 Alexa 488) oder Isotyp IgG-Lösung verdünnt in HBSS (alle bei 1:100 Verdünnung), wie zuvor beschrieben 1. </li><li> Die Zellen wurden zweimal nach jedem Schritt vor und dann in 300 ul HBSS nach dem letzten Schritt resuspendiert. </li></ol> 5. Zell-quantitative Bewertung mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Die Proben wurden auf einem FACS Calibur (Becton-Dickinson) Durchflusszytometer mit Cell Quest Software analysiert. 5.000 Veranstaltungen pro Probe wurden für alle Proben zu lesen, und Daten-Analyse wurde mit Summit (DakoCytomation) abgeschlossen. </li><li> Durchflusszytometrische Tore gesetzt wurden mit Kontroll-IgG Isotyp markierten Zellen oder Rückenmark Zellen aus unverletzten Kontrolltieren zu den Ausgangswerten für die Normalisierung über Zeitpunkte festlegen, wie vorher beschrieben 1. Die Mittelwerte der positiv markierten Zellen wurden in Prozent (± SEM) der gesamten Probe ausgedrückt. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Die Fähigkeit eines OptiPrep Gradienten Myelin Ablagerungen zu entfernen und zu verbessern Immunzellen Detektion mittels Durchflusszytometrie wurde durch Quantifizierung der Wirbelsäule PMNs bei 1 beurteilt dpi (Abbildung 1B), die zuvor berichteten Höhepunkt der PMN-Infiltration nach SCI 1-3. Alternativ wurden identisch seziert Rückenmark enzymatisch gespalten, ohne OptiPrep-Entfernung von Myelin Trümmer und wurden in ähnlicher Weise parallel zur PMN-Infiltration mittels Durchflusszytometrie untersucht. Wie wir bereits 1 berichtet haben, gab es eine Verschiebung der Position der Ereignisse in Proben mit OptiPrep Gradientenreinigung Methode im Vergleich zu enzymatischen Dissoziation allein isoliert, demonstrierte der Anteil der PMN in Proben mit intakten Myelin Trümmer entdeckt nur ein Bruchteil (0,5%) der Anteil der PMN festgestellt (5,1%) in OptiPrep purifIED Proben (Abbildung 1B). Diese Daten legen nahe, dass Myelin Trümmer im Gewebe Zubereitungen können durchflusszytometrischen Messungen dunkel, und zeigen, dass das Entfernen von Myelin Trümmer verbessert die Empfindlichkeit von Immunzellen Erkennung in das verletzte Rückenmark Gewebe. Nachdem festgestellt wurde, die Empfindlichkeit des OptiPrep Gradientensystem für die Zell-Erkennung in das verletzte Rückenmark, charakterisierten wir Veränderungen in der zellulären Infiltration über einen Zeitraum von 2 Stunden auf 180 dpi und gründete eine neue mehrphasige Reaktion der zellulären Entzündung nach einer Rückenmarksverletzung, die PMN, Makrophagen aufgenommen / Mikroglia und T-Zellen. Wie frühere Studien 1-3 bestätigt, PMNs zuerst in das Kabel um 2 Uhr nach der Verletzung und erreichte bei 1 dpi (Abb. 2 &amp; 4). Makrophagen / Mikroglia auf der anderen Seite 1,4,5, wurden nicht in das verletzte Rückenmark bis 3 dpi erkannt, und erreichte zunächst bei 7 dpi (Abbildung 3 und 4). Überraschenderweise zeigen wir zum ersten Mal, dass Makrophagen / Mikroglia zum zweiten Mal 60 dpi Höhepunkt und blieb erhöhten durch 180 dpi (Abbildung 3 und 4). Ähnlich wie Makrophagen / Mikroglia, T-Zell-Infiltration wurde vorhergesagt, bis 7 dpi 5-7 Spitze, aber Durchflusszytometrie zeigten keinen Veränderungen in der T-Zell-Zahl in den ersten 7 dpi, obwohl eine erhöhte Anzahl von T-Zellen erkannt wurde um 9 dpi (1,6%) (Abbildung 4). Während T-Zellzahl um 10 dpi, eine anhaltende T-Zell-Antwort wurde durch 180 dpi beobachtet, zu welchem ​​Zeitpunkt 4,4% der Zellen für CD3 (Abbildung 4) wurden als rückläufig. Zusammen zeigen diese Daten eine zeitabhängige mehrphasige Reaktion der zellulären Entzündung nach SCI (Abbildung 4); den ersten Phasen der zellulären Entzündung wurden von den frühen Höhepunkt der PMNs 1 enthielt dpi, gefolgt von einem Spitzenwert von ED1 + Makrophagen / Mikroglia 7 dpi und T -Zellen 9 dpi, während die späteren Phasen wurden von allen drei Zellpopulationen steigende nach 14 dpi und persistierende durch 180 dpi, mit einer bemerkenswerten zweiten Peak von Makrophagen / Mikroglia bei 60 dpi zusammen. Dieser Zeitverlauf studieren und die quantitativen Daten mittels Durchflusszytometrie generiert wurden zuvor validierten zeigen vergleichbare Ergebnisse, Daten aus quantitativen Stereologie von immunolabeled Rückenmark Abschnitte 1 gesammelt. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table1.jpg" alt="Tabelle 1"/> Tabelle 1. Vorbereitung der OptiPrep Gradienten für die Entfernung von Myelin Trümmer. Four OptiPrep Gradienten-Lösungen werden mit HBSS verdünnt und OptiPrep (1:1 Verdünnung OptiPrep und MOPS). <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. OptiPrep Gradienten Dichten trennen meisten Myelin / Trümmer verletzten Rückenmarks Gewebe / Zellen und verbessern Immunzellen Beurteilung mittels Durchflusszytometrie. (A) Myelin / Schutt wurde aus Zellen (Neuronen, Glia-und Immunzellen) nach Zentrifugation dissoziierter Rückenmark durch eine OptiPrep Gradienten durch Aspiration von Myelin / Schüttschichtfiltertechnik gefolgt getrennt. (B) PMN Zahl in das verletzte Rückenmark, zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit bei der Erkennung PMNs nach Schmutzentfernung (Student-t-Test, p = 0,0001). Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere; n = 5 pro Gruppe, Mittelwert ± SEM. 5.000 Veranstaltungen pro Probe wurden für alle Proben zu lesen und die Mittelwerte der positiv markierten Zellen wurden in Prozent (± SEM) der gesamten Probe ausgedrückt. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Erkennung von PMN-Infiltration in das verletzte Rückenmark mittels Durchflusszytometrie. Nach einem moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9, PMNs schnell in das Rückenmark ab 2 Stunden (B) nach der Verletzung und Peaking 1 dpi (C). Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere (A). <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Erkennung von Makrophagen / Mikroglia Infiltration in das verletzte Rückenmark mittels Durchflusszytometrie. Nach einem moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9, ED1 + Makrophagen / Mikroglia Zahl in das verletzte Rückenmark erhöht ab 3 dpi (D), erreichte akut bei 7 dpi (E) sank auf ein niedriges Niveau bei 14 dpi (F) , bevor sie sich zu einem zweiten Peak bei 60 dpi (G), und blieb in das verletzte Rückenmark bis zu 180 dpi (H). IgG Isotyp-Kontroll-Kennzeichnung von 7 dpi spinalen Zellen (B) zeigte minimale Antikörper-Kennzeichnung Hintergrund und keinen Unterschied zu Antikörper-markierte Zellen aus 2 Stunden post-Verletzten (C) oder unverletzt (A) Tiere. Alle durchflusszytometrischen Tore gesetzt wurden unter Verwendung von markierten Zellen aus unverletzten Tiere. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698table2.jpg" alt="Tabelle 2"/> Tabelle 2. Tierische Proben in Zeitverlauf Experimente. Für jeden Zeitpunkt (0 h bis 180 dpi), erhielt fünf Tiere einer moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9,und Rückenmark Gewebe wurden mittels Durchflusszytometrie für die Zahl der neutrophilen Granulozyten, ED1 + Makrophagen / Mikroglia und CD3 + T-Zellen untersucht. Allerdings waren nicht alle tierischen Proben erfolgreich für PMN (4-5), ED1 (3-5) und CD3 (4-5) mittels Durchflusszytometrie analysiert erholt. <img src="/files/ftp_upload/2698/2698fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Ein Zeitverlauf der zellulären Entzündung im Rückenmark nach einer moderaten (200 kd) Prellung Verletzungen bei T9. Wie mittels Durchflusszytometrie, die Zahl der neutrophilen Granulozyten, ED1 + Makrophagen / Mikroglia und CD3 beurteilt + T-Zellen erreichte akut (1,7 und 9 dpi, jeweils) und blieb chronisch in das verletzte Rückenmark. N = 3 bis 5 pro Gruppe, Mittelwert ± SEM.

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Der Einsatz der Durchflusszytometrie an Immunzellen in das ZNS zu quantifizieren ist durch Lipid / Myelin Inhalt und Schutt kompliziert. Neben der Zusammenarbeit mit Antikörper-Bindung und Spezifität beeinträchtigen können Myelin Trümmer haben ähnliche Größe und Granulierung Eigenschaften Immunzellen, abnehmende Messempfindlichkeit und Genauigkeit 8. Der Roman Zellpräparation hier beschriebene Methode ist wirksam bei der Beseitigung von Myelin Schutt und verbessert dadurch die Empfindlichkeit der Durchflusszytometrie auf Veränderungen in der zellulären Entzündung in das verletzte Rückenmark zu erkennen. Zum Beispiel das Entfernen von Myelin Trümmer mit dieser Methode bessere Erkennung von Immunzellen zur enzymatischen Dissoziation alone.Critically Vergleich erlaubt neuartige Verwendung dieser Methode die erste Charakterisierung von akuten und chronischen zellulären Entzündung nach SCI eine komplette zeitliche Verlauf für PMNs enthalten, um, Makrophagen / Mikroglia und T-Zellen bis zu 180 dpi, und nannte eine neue zweite Phase des zellulären Entzündung. Diese wichtigen Ergebnisse einer mehrphasigen Bestandteil Neuroinflammation kann entscheidend sein für die Gestaltung und Umsetzung der rationalen therapeutischen Strategien, die sowohl zell-basierte und pharmakologische Interventionen zur SCI. Die OptiPrep Gradienten System zu trennen Trümmer von Zellen im Blut 9, oder zu reinigen Neuronen im Gehirn für die Zellkultur Zwecke 10 verwendet, jedoch haben wir geändert und erweiterte diese Methode System Myelin Trümmer Rückenmark dissoziierten Zellen zu trennen, und erlaubt schnelle und genauere Quantifizierung der zellulären Entzündung mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode zusammen mit der Durchflusszytometrie ist wahrscheinlich bedeutenden Fortschritt in der Entzündungsforschung bieten nach ZNS-Verletzungen oder pathologischen Bedingungen, da die meisten Studien haben nur zelluläre Entzündung im ZNS durch morphologische und histologische Techniken, die nicht Zelltyp-spezifisch oder kann nicht immer wahr charakterisiert quantitative Bewertung. Darüber hinaus haben einige neuere Studien haben versucht, Immunzellen in das verletzte Rückenmark Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie mit frischen dissoziiert Schnur Gewebe 11,12 oder Zellen durch die Percoll-Gradient-System 13 getrennt, aber diese Studien entweder niedrig Zellausbeuten nachgewiesen oder unempfindlich Nachweis von Immunzellen. Im Gegensatz dazu hat die OptiPrep Gradienten Zellpräparation Methode zum ersten Mal zur Verfügung gestellt, empfindliche und zuverlässige quantitative Bewertung mittels Durchflusszytometrie, um Änderungen der zellulären Entzündung als Reaktion auf abgestufte Verletzungsschwere und über einen längeren Zeitverlauf bis zu 180 dpi. Die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der durchflusszytometrischen Analyse auch auf die Spezifität der Antikörper verwendet, um bestimmte Zelltypen erkennen abhängen, nicht wie die Durchflusszytometrie nicht zulassen morphologischen Kriterien weiter zu unterscheiden Zelltypen. Die Spezifität der Antikörper für die PMN, Makrophagen / Mikroglia oder T-sagt wurde gründlich in der Durchflusszytometrie für die Peritonealdialyse PMNs und Alveolarmakrophagen in Kultur und Zellen in das verletzte Rückenmark Gewebe 1,2 getestet. Zusammen mit dem OptiPrep Gradientensystem, haben diese Antikörper für die Durchflusszytometrie verwendet werden, um die Erzeugung einer zeitlichen und quantitativen Analyse von zellulären Entzündung, die neue Einblicke zur Verfügung gestellt hat in der Dynamik des SCI-Mikroumgebung, und identifiziert zum ersten Mal einen längeren mehrphasige Reaktion beigetragen von zellulären Entzündung. Dieses mehrphasige Reaktion der Zellen nach SCI kann wichtig sein, die Rolle spezifischer Zelltypen zu bestimmten Zeiten nach der Verletzung zu untersuchen oder erzeugen therapeutische Interventionen gegen bestimmte Zelltypen, die Verletzungen verschlimmern kann. Darüber hinaus können diese Erkenntnisse in die Entwicklung einer geeigneten Begründung für die optimale Arzneimittel-oder Zell-basierte Interventionen für SCI zu unterstützen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> OptiPrep </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9182490 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H1387 </td></tr><tr><td> Kaninchen-anti-Ratte PMN (FITC) </td><td> Genaue Chemical &amp; Scientific </td><td> AIFAD51140 </td></tr><tr><td> Maus anti-Ratte ED1 (Alexa Fluor 488) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA341A488 </td></tr><tr><td> Maus anti-Ratte CD3 (FITC) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA772F </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Sigma </td><td> T9935 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma </td><td> C5138 </td></tr><tr><td> DME </td><td> Sigma </td><td> D1152 </td></tr><tr><td> Maus IgG1 (Alexa Fluor 488) </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA1209A488 </td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> Kaninchenserum </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 011-000-120011-000-120 </td></tr><tr><td> Maus-Serum </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-120 </td></tr><tr><td> Zellsieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry:  a novel use for a cell purification method

Nachweis von Immunzellen in die verletzte zentrale Nervensystem (ZNS) mit morphologischen oder histologischen Techniken nicht immer wahr quantitative Analyse von zellulären Entzündung zur Verfügung gestellt. Die Durchflusszytometrie ist eine schnelle alternative Methode zur Immunzellen im verletzten Gehirn oder Rückenmark zu quantifizieren. Historisch gesehen hat die Durchflusszytometrie verwendet worden, um Immunzellen aus dem Blut oder dissoziierte Milz oder Thymus gesammelt zu quantifizieren, und nur wenige Studien haben versucht, Immunzellen in das verletzte Rückenmark Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie mit frischen dissoziiert Schnur Gewebe. Allerdings ist die distanzierte Rückenmark mit Myelin Trümmer, die für Zellen verwechselt werden können und reduzieren Zellzahl Zuverlässigkeit durch das Durchflusszytometer erhalten konzentriert. Wir haben eine Zelle Herstellungsverfahren mit dem OptiPrep Gradientensystem wirksam zu trennen Lipid / Myelin Trümmer von Zellen, die Bereitstellung empfindlicher und zuverlässiger Quantifizierungen der zellulären Entzündung in das verletzte Rückenmark mittels Durchflusszytometrie fortgeschritten. Wie in unserer letzten Studie beschrieben (Beck &amp; Nguyen et al, Brain 2010 Feb; 133 (Pt 2):.. 433-47) hatte der OptiPrep Zellpräparation Sensibilität für zelluläre Entzündung in das verletzte Rückenmark erkennen erhöht, mit einer Anzahl von spezifischen Zelltypen korreliert mit Schwere der Verletzungen. Entscheidend ist, sofern neuartige Verwendung dieser Methode die erste Charakterisierung von akuten und chronischen zellulären Entzündung nach einer Rückenmarksverletzung zu einer vollständigen zeitlichen Verlauf der polymorphkernigen Leukozyten (PMN, Neutrophile), Makrophagen / Mikroglia und T-Zellen über einen Zeitraum von 2 Stunden zu zählen 180 Tage nach der Verletzung (dpi), die Identifizierung einer überraschenden Roman zweite Phase des zellulären Entzündung. Gründliche Charakterisierung der zellulären Entzündung mit dieser Methode kann ein besseres Verständnis der Neuroinflammation im verletzten ZNS liefern, und zeigen ein wichtiger Bestandteil des mehrphasigen Neuroinflammation, dass entscheidend für die Planung und Durchführung von rationalen therapeutischen Strategien, die sowohl zell-basierte und pharmakologische können Interventionen für SCI.

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Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Die Quantifizierung des zellulären Entzündung im verletzten / pathologischen ZNS mittels Durchflusszytometrie wird durch Lipid / Myelin Trümmer, die ähnliche Größe und Granulierung von Zellen haben kann, eine verringerte Empfindlichkeit / Genauigkeit kompliziert. Wir haben eine Zelle Herstellungsmethode des Myelins Ablagerungen zu entfernen und zu verbessern Zelldetektion mittels Durchflusszytometrie in das verletzte Rückenmark fortgeschritten.

Quantitative Beurteilung der Immunzellen in das verletzte Rückenmark Tissue mittels Durchflusszytometrie: eine neue Verwendung für eine Zelle Reinigungsverfahren

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

quantitative-assessment-immune-cells-injured-spinal-cord-tissue-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.0K Aufrufe.  University of California. Die Quantifizierung des zellulären Entzündung im verletzten / pathologischen ZNS mittels Durchflusszytometrie wird durch Lipid / Myelin Trümmer, die ähnliche Größe und Granulierung von Zellen haben kann, eine verringerte Empfindlichkeit / Genauigkeit kompliziert. Wir haben eine Zelle Herstellungsmethode des Myelins Ablagerungen zu entfernen und zu verbessern Zelldetektion mittels Durchflusszytometrie in das verletzte Rückenmark fortgeschritten.

Serie: Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Isolierung von Brain and Spinal Cord mononukleären Zellen mit Percoll Gradienten

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...