Die Autoren danken: Frau Alexia Saunders und Frau Michelle McPhedran für experimentelle Unterstützung, Frau Helen Feng für Elektrodenherstellung; Dr. Penny Allen und Dr. Jonathan Yeoh für chirurgische Hilfe, Mitarbeiter des Royal Victorian Eye and Ear Hospital Biological Forschungszentrum für Tierpflege; Prof. Rob Shepherd für die allgemeine Beratung während und Dr. Bryony Nayagam und Herr Ronald Leung für kritische Anmerkungen zu dem Entwurf einer Form des Manuskripts. Diese Arbeit wurde am Institut Bionics und St. Vincent Hospital, Melbourne durchgeführt. Die Finanzierung wurde von der Ian Potter-Stiftung, den John T Reid Charitable Trusts, und dem Australian Research Council durch ihre spezielle Research Initiative in Bionic Vision Science and Technology Zuschuss zu Bionic Vision Australia (BVA) zur Verfügung gestellt. Die Bionik-Institut würdigt die Unterstützung, die sie von der Regierung von Victoria durch ihre betriebliche Infrastruktur Support Program.

1. Enukleation und Post-Fixation Dieses Protokoll setzt voraus, dass das Thema wurde einseitig mit einem suprachoroidalen Elektroden-Array implantiert. <ol><li> Bereiten postfix Lösungen in Glas Schott Flaschen. <ol class="lalpha"><li> Davidson Fixierlösung, 2x 100 ml <ul><li> 2 ml Formalin (37% Formaldehyd) </li><li> 10 ml Eisessig (99,7%) </li><li> 35 ml Ethanol (98%) </li><li> 53 ml destilliertem Wasser </li></ul></li><li> 50%-igem Ethanol, 2 x 100 ml </li><li> 70% Ethanol, 2 x 100 ml </li></ol></li><li> Transkardial perfundieren Thema mit warm (37 ° C) heparinisierter Kochsalzlösung gefolgt von kaltem (4 ° C) neutral gepuffertem Formalin (10%). </li><li> Tie Nähte an der oberen Limbus (oder ein Ort, der fern von der suprachoroidalen Array) beider Augen - im Einklang mit einer Rektusmuskel, als Wahrzeichen dienen. </li><li> Enucleate Augen, etwaige Beibehaltung der externen Leitungen von der implantierten Auge. </li><li> Zeigen each Auge in 100 ml Fixierlösung Davidson und lassen bei Raumtemperatur Post-fix. </li><li> Nach 18 - 36 h in Davidsons Fixativ, zu 50% Ethanol (Raumtemperatur) übertragen für 6 - 8 Stunden, dann endlich zu 70% Ethanol (Raumtemperatur). </li><li> Kühlen Proben bei 4 ° C und Speicher bis Dissektion. </li></ol> Intakte und Druck Auge Globen haben auf diese Weise gelagert bis zu 3 Monaten ohne Beeinträchtigung der resultierenden Histologie. 2. Identifizierung und Tissue Mapping Die oben Fixierung Protokoll (Schritt 1) hat die Lederhaut durchscheinend gerendert und das Array ist jetzt sichtbar - inklusive der einzelnen Elektrode Websites (Abbildung 3). <ol><li> Entfernen Sie die implantierten Globus aus Ethanol und sorgfältig wegschneiden überschüssiges Gewebe, einschließlich Bindehaut und Tenonkapsel. Trim Sehnerv zu einer 2 - 3 mm Länge (3A). </li><li> Mit einem histologischen Farbstoff marking Schema, beschriften Sie die Elektroden mit einem vordefinierten Farbcode, kümmert sich nicht um den Farbstoff zu verschmieren. </li></ol><ul><li> Wir entschieden uns für einen handelsüblichen Suite von spezialisierten histologischen Farbstoff (siehe Anhang). Kleine Mengen des Farbstoffs wurden vorsichtig mit einer feinen Spitze Pinsel (Roymac Größe 00) auf das Gewebe aufgetragen und an der Luft für bis zu 5 min trocken. </li><li> Für unsere Zwecke haben wir uns entschieden: grün für den aktiven Elektrode (n), die (waren) war angeregt maximal bei überschwellige Ebenen, für die Dauer der Studie; rot für andere aktive Elektroden, gelb für die größeren Durchmesser Rückkehr Elektroden und Blau für zusätzliche Führungen und / oder anatomischen Abstand Markierungen (3B und 3C). </li><li> Einige trial and error erforderlich sein, um einen Farbstoff, der stabil ist in den nachfolgenden Schritten zu finden. Zum Beispiel in Figur 4 ist ersichtlich, dass der grüne Farbstoff elastischer als der roten Farbstoffs werden. Verdünnung der Farbstoff in 70% Ethanol verbessert Lipid penetration und Gewebe-Beschichtung. </li><li> Es ist sinnvoll, skizzieren oder fotografieren das gefärbte Globus für die Zukunft. </li></ul><ol start="3"><li> Zurück zu 70% Ethanol, um den Farbstoff zu entwässern. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.1 für die Steuerung unimplantierten Globus. </li><li> Mit den Fäden aus Schritt 1.3, richten Sie die Steuerung und das Auge implantiert Auge als gespiegelten Paar. </li><li> Platzieren eines Silikon-Vorlage (mit den gleichen Abmessungen wie die Elektrodenanordnung) in dem gespiegelten Position auf der Steuerung Auge als das Implantat implantiert Auge (NB die lichtdurchlässige Sklera und der Farbstoff Markierungen von Schritt 2.2 liegt damit bereit Visualisierung der implantierten Position im Array ). </li><li> Die Schritte 2.2 und 2.3 für die Steuerung Auge, so daß jede Elektrode implantiert ein Steuerelement Paar hat in einer anatomisch vergleichbar (dh spiegelgleichen Äquivalent) Lage. </li></ol> 3. Dissection und Einbettung <ol><li> Entnehmen Sie das Implantat Array aus dem Auge und nehmen Sie die Vorderseite des Auges(Einschließlich der Hornhaut, Iris und Linse). Entfernen Sie die Glaskörper aus dem verbleibenden Auge cup (hintere Kammer). </li><li> Präparieren des implantierten Auge in mehrere Vertreter Streifen (~ 2 mm Dicke), die jeweils eine Teilmenge der Farbstoff markierte Bereiche (3D). Man beachte, dass die Orientierung der Streifen so zu wählen, bei der Beurteilung der verschiedenen Aspekte der Gewebereaktion auf das Implantat 7 zu unterstützen. </li></ol> Es ist sinnvoll, für die Zukunft, um einen Datensatz von dem Farbstoff Regionen vorhanden sind, auf jedem Streifen und ihre relativen Positionen (und Farben) zu machen. <ol start="3"><li> Sie den Streifen auf der Seite in einem flachen Becken von verflüssigtem Agar (4%, 80-90 ° C) mit der zu schneiden zuerst nach unten (Fig. 3E) wird. </li><li> Sobald das Agar gesetzt hat, um die Probe geschnitten und in einen Gewebekassette von Einlagen (3F) unterstützt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte für die Steuerung 3.1-3.3 Auge - taking Pflege zu sezieren Spiegel-Streifen abgestimmt. </li><li> Bearbeiten Sie alle Kassetten über Standard (automatisierte Übernachtung) Paraffin Verarbeitungstechnik. </li><li> Einbetten verarbeitet Gewebe in Paraffin mit der Seite zu schneiden zuerst nach unten werden. </li></ol> 4. Schneiden und Färben <ol><li> Cut Paraffinblöcke in 5 um Abschnitte beziehen regelmäßig die Hinweise aus den Schritten 2 und 3. </li><li> Sammeln Abschnitte von jeder der gefärbten Regionen und Befestigung auf Objektträgern. </li></ol> Der Bereich unmittelbar benachbart zu jeder gefärbten Fleck Sklera kann nun mit Sicherheit, dass sie in nächster Nähe zu der entsprechenden Elektrode in der Anordnung (4) wurde bewertet. <ol start="3"><li> Stain oder führen Immunfluoreszenz nach Wunsch. Beispiel Flecken und Immunhistochemie in Abbildung 5 dargestellt sind: H &amp;E; Luxol schnell blau (LFB); Kresylviolett; Masson Trichrom blau; Perjodsäure schiff (PAS); Perls &#39;Preußisch Blau stain, Anti-Glutamin-Synthetase (GS), Anti-Neurofilamentprotein (NF), Anti-saure Gliafaserprotein (GFAP) und 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI). </li><li> Standard-und Spezial Flecken wurden so detailliert durchgeführt: <ol><li> H &amp; E-Färbung wurde gemäß dem Protokoll, das von Leica Multistainer Bad Array ST5020 (Leica Biosystems) vorgesehen durchgeführt. </li><li> LFB und Kresylviolett (modifiziert nach 11): <ol><li> Entparaffinieren in 3 ändert Xylol (3x 2 min) und 2 Wechsel von Ethanol (100%, 100%) (2x 1 min) und Spülen in Leitungswasser (45 sec). </li><li> Hydrate Abschnitte zu 95% Ethanol. </li><li> Platz in der LFB-Lösung 11 bei 37 - 42 ° C (über Nacht). </li><li> Spülen Sie überschüssiges mit 70% Ethanol Fleck. </li><li> Spülen in destilliertem Wasser. </li><li> In verdünnter Lithiumcarbonat (8%) (einige Sekunden). </li><li> Differenzieren in 70% Ethanol (einige Sekunden). </li><li> Spülen in destilliertem Wasser. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.4.2.6 bis 4.4.2.8, wenn nötig, bis background ist farblos. </li><li> Platz in Kresylviolett Acetat funktionierende Lösung bei 37 ° C (10 min). </li><li> Nicht mit Wasser waschen. </li><li> Entwässern in 3 Änderungen absolutem Alkohol (1x 30 sec, 20 sec 2x) und 3 Änderungen Xylol (1x 1 min 30 sec, 2x 1 min). </li><li> Berg und Deckglas mit DPX. </li></ol></li><li> Masson Trichrom blau (modifiziert nach 11): <ol><li> Dewax gemäß 4.4.2.1. </li><li> Bringen Abschnitte zu Wasser (2 min). </li><li> Stain die Kerne mit Weigert Eisen-Hämatoxylin (2 min). </li><li> Waschen in Leitungswasser, in destilliertem Wasser spülen. </li><li> Färben in Biebrich Scharlach-Säurefuchsin Lösung (5 min). </li><li> Spülen in destilliertem Wasser. </li><li> Differenzieren in Phosphormolybdänsäure-Phosphowolframsäure bis Kollagen ist blassrosa (6 min). </li><li> Spülen in destilliertem Wasser. </li><li> Gegenfärbung in Anilin blau (1 min). </li><li> Gut waschen in 1% Essigsäure (1 min). </li><li> Entwässern, Halterung und Deckglas als p4.4.2.12 und 4.4.2.13 er. </li></ol></li><li> PAS (modifiziert nach 11): <ol><li> Dewax gemäß 4.4.2.1. </li><li> Oxidieren in 1% Perjodsäure (15 min). </li><li> Waschen unter fließendem Wasser dann destilliertes Wasser. </li><li> Färben in Schiff-Reagenz (15 min). </li><li> Waschen in Wasser (5 min). </li><li> Gegenfärbung mit Harris Hämatoxylin (1 min). </li><li> Waschen Sie kurz in Leitungswasser. </li><li> Differenzieren in 0,5% Säure Alkohol (1 dip). </li><li> Waschen gut in Leitungswasser. </li><li> Blau in Scotts Leitungswasser (1 min). </li><li> Waschen gut in Wasser. </li><li> Entwässern, Halterung und Deckglas nach 4.4.2.12 und 4.4.2.13. </li></ol></li><li> Perls &#39;Preußisch Blau Fleck wie in 11 beschrieben. </li></ol></li><li> Immunfluoreszenzfärbung wurde so detailliert durchgeführt: <ol><li> Dewax gemäß 4.4.2.1. </li><li> Spülen in destilliertem Wasser (2x 5 min). </li><li> Führen Antigen-Retrieval unter Verwendung von 0,01% Citrat-Puffer, pH 6 bei 75 - 80 ° C (20 min) eind zu ermöglichen, in 0,01% Citratpuffer (20 min) abgekühlt. </li><li> Waschen Abschnitte in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (2x 5 min). </li><li> Permeabilisieren die Zellmembran in Waschpuffer-Lösung (10 min). </li><li> Inkubation in Serum-Block-Lösung (2 h). </li><li> Inkubieren Abschnitte in einer einzigen primären Antikörper in Antikörper verdünnt (10% normal goat serum/0.1% Triton X-100/PBS) (über Nacht im Kühlschrank). Der Titer der einzelnen primären Antikörper ist in Tabelle 1 gezeigt. </li><li> Nach Inkubation über Nacht, waschen Abschnitte in Waschpuffer (5x 3 min). Von diesem Punkt an, halten Abschnitte in der Dunkelheit. </li><li> Inkubieren Abschnitte in der entsprechenden sekundären Antikörper bei einem Titer von 1:500 für eine bestimmte Dauer (siehe Tabelle 1 für weitere Details). </li><li> Wash Abschnitte in Waschpuffer (3x 5 min). </li><li> Inkubieren Abschnitte in DAPI (1:25.000 / PBS) (30 min). </li><li> Wash Abschnitte in Waschpuffer (3x 5 min). </li><li> Berg und Deckglas mit fluoreszierennt Montage Medien. </li></ol></li></ol> Testproben und Kontrollproben sind bereit für paarweisen Vergleich.

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+coverage+of+beta+cells+in+the+cat+retina.">Distribution and coverage of beta cells in the cat retina.</a> J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).</li><li>Dagnelie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychophysical+evaluation+for+visual+prosthesis.">Psychophysical evaluation for visual prosthesis.</a> Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).</li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Beurteilung der Sicherheit des Implantats ist eine wichtige Überlegung für die präklinischen Studien. Bevor ein Netzhautprothese in Menschen implantiert werden können ist es wichtig, zu überprüfen, dass es keinen Schaden anrichten. Dies erfordert eine Einschätzung sowohl des Implantats Biokompatibilität 17-23 sowie allen möglichen Schaden das könnte durch chronische elektrische Stimulation 24-26 verursacht werden. Die Erfahrungen mit ähnlichen neuronalen Prothesen, wie das Cochlea-Implantat, bietet einen Einblick in das breite Spektrum der Stimulation und körperliche Parameter, die nicht verursachen Gewebeschäden 27. Allerdings hat die Netzhaut unterschiedliche Eigenschaften auf andere Nidationsstellen und somit präzise Grenzwerte (z. B. maximale Ladungsdichte) kann nicht aus früheren Studien in anderen Systemen übernommen werden. Ladungsdichten am höchsten an der aktiven Elektrode Websites und dies entspricht mit dem größten Potenzial für Schäden. Daher ist ein Verfahren zur Lokalisierung der Gewebe direkt benachbartzu den einzelnen aktiven Elektroden stark erhöhen würde den Nutzen dieser Studien. Das Gewebe angrenzend an spezifische Bereiche des Implantats kann auch eine engere Kontrolle markiert. Dieser Ansatz ermöglicht gezielte weniger Abschnitte analysiert werden, unter Beibehaltung Vertrauen, dass das &quot;worst case scenario&quot; untersucht wurde. Der Farbstoff skleralen Lokalisation hier beschriebene Verfahren wurde ausgiebig mit der Hand geformt und geformten Silikon / Pt-Elektrode Arrays 28-30 getestet. Es wurde mit Dünnschicht-Polyamid-Arrays 7,31 und auch Dünnschicht-Silikon / Pt-Arrays 32 verwendet worden. Einige Netzhautprothese Studien beschäftigt &quot;kugelförmig&quot; Elektroden mit intraskleralen Implantationen 33. Die vorliegende Technik sollten wirksam für die Bewertung dieser Art von Elektroden-Arrays. Feline Augen mit dünnen Lederhaut (Dicke am hinteren Pol 90 - 200 um) erlaubt die Visualisierung der einzelnen Elektroden in einem Array. Selbst wenn einzelne elektrodes nicht sichtbar waren, ihre Position leicht abgeleitet werden kann unter Verwendung einer Silikon-Vorlage, wenn die Kontur des Feldes zu sehen (ähnlich wie in Schritt 2.6 verwendet werden). Der Farbstoff Mapping begrenzt die Notwendigkeit, nicht relevant Gewebeschnitten zu erhalten, da nur abschnittsweise mit dem Farbstoff erhalten werden. Die Fähigkeit, genau zu folgern Elektrodenposition ermöglicht nicht nur relevant histopathologischen Analyse und eine größere statistische Power, hat aber einen großen Einfluss auf Zeit-und Kostenmanagement durch die Reduzierung der Menge von Dias und Schaufeln sowie die Kosten der Arbeit verwendet. Die Verwendung von Farbstoff, der haftend ist und Gewebebehandlung während auch sichtbar in ungefärbten Gewebeschnitten widerstehen ist eine wichtige erste Überlegung. Kenntnis der Lage des Farbstoffs und Orientierung des Gewebes an Präparation und beim Einbetten unterstützt den Schneidvorgang. Dies beinhaltet richtig Ausrichten des Blocks, um einen Abschnitt, die nicht schräg geschnitten zu erreichen und bietet einen vollständigen Vertreterinnenauf der Gewebe. Es ist daher wichtig, dass die Person, die das Schneiden vorliegenden Zeitpunkt der Farbauftrag, Präparation und Einbettung. Das gesamte Protokoll ist robust, um kleinere Änderungen, insbesondere mit Fixierung Timings. Allerdings sind das Auge Dissektion und Farbstoff Markierungsschritte schwierige Vorgänge, die Nutzen aus gute manuelle Geschicklichkeit, um eine Beschädigung der Probe. Während Davidson Fixativ hat sich bewährt zur Verringerung artifactual Netzhautablösung in der Nähe eines Implantats, ist es nicht zu verhindern direkte mechanische Beschädigung beim Präparieren. Davidson fixative war nicht ohne weiteres kompatibel mit einigen speziellen histologischen und immunhistochemischen Verfahren. Daher gab es eine Notwendigkeit zu ändern / optimieren diese Schritte wie oben beschrieben. Inkrementelle Änderungen in Färbung und Konzentrationen wurden bis das optimale Ergebnis erreicht wurde - für weitere Details finden Sie in den ergänzenden Materialien. Quantifizierung der retinalenHistologie bleibt problematisch. Die Netzhaut nicht homogen ist und sowohl die Dicke und die Zelldichte ändern sich mit zunehmendem Abstand vom Bereich centralis 34,35. Daher kann benachbarte Gewebe im Auge implantiert nicht für Vergleiche verwendet werden und eine Kontrolle Auge statt beschäftigt. Paarweise passenden jedes Abschnitts mit der Steuerung Auge gibt uns einen stärkeren statistischen Vergleich der pathologischen Veränderungen, Wirksamkeit und Sicherheit Ergebnisse mit Retina-Prothesen werden besser beurteilt, wenn man die Augen in einem anderen Thema 36. Besondere Vorsicht ist geboten, um schräg schneiden zu minimieren, da dies Quantifizierung beeinflussen würde. Zusammenfassend, die oben beschriebenen Verfahren haben unsere histopathologischen Analyse, was wiederum zu einer effizienteren präklinischen Workflow geführt verbessert. Die Ergebnisse der präklinischen Studien mit diesen Methoden führte direkt zu einer klinischen Studie, in der 3 RP-Patienten wurden sicher haben mit suprachoroi implantiertdal retinale Prothesen. Diese Methoden sind sowohl auf die Netzhaut und andere Stimulatoren Augenimplantaten wo die pathologische Reaktion auf langfristige Implantation muss ausgewertet werden. Diese Methode bereitgestellt lohnt Vorteile für die Aufrechterhaltung der Zytoarchitektur und Registrierung der Pathologie in Regionen von Interesse auf dem Implantat. Obwohl nicht spezifisch geprüft werden, eine Modifikation dieser Verfahren in anderen Spezies und anderen anatomischen Stellen verwendet werden, insbesondere, wo eine Reihe oberflächlich implantiert wird.

Retinal Prothesen könnten bald nützliche klinische Interventionen werden zur Behandlung von verschiedenen Formen der schweren Sehverlust. Bestimmte Bedingungen, wie Retinitis pigmentosa (RP), Ergebnis in der weitverbreiteten Degeneration der Photorezeptoren im Auge, das sind die Zellen, die zur Umwandlung von Licht in neuronale Signale. Jedoch bleiben einige Zellen in anderen Schichten der Netzhaut und sind potentielle Ziele für die elektrische Stimulation mit einem Netzhautprothese 1. Erste Ergebnisse von klinischen Studien am Menschen haben für Elektroden-Arrays im epiretinalen 2,3, 4,5 subretinalen implantiert und intraskleralen 6 Standorten waren vielversprechend. Diese Geräte sind aus verschiedenen Materialien mit unterschiedlichen Formen, aber sie alle verwenden elektrische Impulse, um die restlichen lebensfähigen Neuronen der Netzhaut zu aktivieren, um visuelle Wahrnehmungen zu erstellen. Unsere größeren Gruppe (Bionic Vision Australia) hat ein Retina-Implantat, das progres entwickelt hatsed zu einer klinischen Pilotstudie mit 3 RP-Patienten mit suprachoroidalen Elektroden-Arrays (Clinical Trial Number: NCT01603576) implantiert. 1A zeigt diese suprachoroidalen Prototyp Netzhautprothese. Patientensicherheit ist von größter Bedeutung in klinischen Studien und damit vor Beginn der Studien am Menschen, wir umfangreiche akuten und chronischen Tests durchgeführt in präklinischen Modellen (Abbildung 1B). Histopathologische Einschätzungen waren unerlässlich, um die chirurgischen Verfahren zu verfeinern, durchlaufen Elektroden-Konstruktion und letztlich zu etablieren, die Sicherheit des Implantats. Um einen effizienten Workflow mit üblichen klinischen Pathologie Praktiken verzahnt halten, wurde eine Einbettung in Paraffin-Technik eingesetzt. Es war auch wünschenswert, Färbeprozeduren vergleichbar mit klinischen Standards wie Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E), die leicht von den Pathologen interpretiert nutzen. Wir wollten auch eine Technik, die für immunhistochemische Analysen angepasst werden könnte, inum weiter zu erleichtern zellulären Auswertung der Gewebe. Die Biokompatibilität des Implantats Materialien und die Sicherheit der chronischen elektrischen Stimulation, müssen sorgfältig geprüft werden. Es ist wichtig, in der Lage, die Histopathologie von dem Augengewebe benachbart zu den einzelnen stimulierenden Elektroden in der Anordnung zu prüfen. Jedoch benötigt die Arrays vor der Bearbeitung der Proben, so dass sie getestet werden kann entfernt werden, und weil ihre Metallkomponenten nicht leicht geschnitten. Folglich hat unsere etablierten Gewebeaufbereitung nicht zulassen Lokalisierung und Abbildung von Gewebe in Bezug auf den implantierten Elektroden 7. Neben dem Fehlen einer Gewebelokalisierung Verfahren führte die Standard-Formaldehyd-Basis Fixierung und Verarbeitungstechniken verbreitet Artefakte und Ablösung der Netzhaut durch die unterschiedliche Schrumpfung der verschiedenen Schichten des Auges (Abbildung 2). Aufgrund der Inhomogenität ter Netzhaut, war es schwierig, einen sinnvollen Vergleich mit Kontrollgewebe machen, besonders für quantitative Messungen. Diese kombinierten Einschränkungen erschwert eine genaue Beurteilung des potenziellen Schadens durch unsere implantiert Arrays verursacht. Hier präsentieren wir neue Techniken zur Überwindung dieser Grenzen. Wir haben modifiziert spezialisierte Augenfixierung und Verarbeitungstechniken 8-10, um die Kompatibilität mit Paraffin-Basis Histologie halten. Wir haben Standard-histologische und immunhistochemische Färbungen modifiziert werden, um vergleichbare Ergebnisse zu geben, basierend auf dem Feedback aus der klinischen Pathologen. Nach dem Rendern der Skleralgewebe transluzent wurde ein Farbstoff-Farben-Code verwendet, um das Augengewebe benachbart zu jeder einzelnen Elektrode zu markieren, bevor die Anordnung aus dem Suprachoroidalraum. Durch Markieren des Elektroden-Array und die einzelnen Elektrode Websites könnten Proben genau von der Elektrode angrenzenden Regionen gesammelt werden. Abgestimmte Proben konnten von th gesammelt werdene Kontrolle Auge um paarweisen Vergleiche zu erleichtern.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Davidson marking system</td>
			<td>Bradley Products</td>
			<td>1163-4 - red 1163-5 - blue 1163-2 - yellow 1163-1- green</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Polyclonal Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5804</td>
			<td>1:1500, overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Monoclonal Anti-Glutamine Synthetase Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB302</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Mouse Anti-Neurofilament 200 Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0142</td>
			<td>1:100 overnight incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamindino-2-phenylindole, dilactate (dilactate)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>1:25,000 30 min incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost 90&#176; yellow</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>SF41299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLEX IHC Microscope Slides</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11037</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>10% serum/0.1% Triton X-100/PBS</td>
		</tr>
		<tr>
 			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Non-Standard Solution Preparation for Special Stains
			1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution
			<ul>
				<li>Cresyl violet 1 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Cresyl Violet Acetate Working Solution
			<ul>
				<li>1% aqueous cresyl violet stock solution 9 ml</li>
				<li>Distilled water 51 ml</li>
				<li>10% acetic acid 0.5 ml</li>
			</ul>
			Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin Solution
			<ul>
				<li>1% Beihrich scarlet 90 ml</li>
				<li>1% acid fuchsin 10 ml</li>
				<li>Glacial acetic acid 1 ml</li>
			</ul>
			Phosphomolybdic-Phosphtungstic Acid Solution
			<ul>
				<li>Phosphomolybdic acid 2.5 g</li>
				<li>Phosphotungstic acid 2.5 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Aniline Blue Solution
			<ul>
				<li>Aniline blue 2.5 g</li>
				<li>Glacial acetic acid 2 g</li>
				<li>Distilled water 100 ml</li>
			</ul>
			Solutions for Immunohistochemistry
			Wash Buffer Solution
			<ul>
				<li>0.1% Triton X-100 in Phosphate buffered saline (PBS)</li>
			</ul>
			Serum Block Solution
			<ul>
				<li>10% normal goat serum/0.1% Triton X-100 in PBS</li>
			</ul>
			SUPPLEMENTARY MATERIAL
			Luxol Fast Blue
			The purpose of performing a Luxol Fast Blue (LFB) stain was to identify the ganglion cells in the ganglion cell layer through the counterstain of cresyl violet. While LFB stains myelin, the cresyl violet stain binds to the Nissl substances in neurons, composed of rough endoplasmic reticulum and ribosomes. Numerous cells in the retina contain Nissl substance including amacrine cells. These cells usually are located in the inner boundary layer of the inner nuclear layer, but displaced amacrine cells can be found in the ganglion cell layer. The staining of Nissl substance is helpful in differentiating large, heavily stained ganglion cells from smaller displaced amacrine cells. To aid visualisation of these cells, we modified the cresyl violet working solution protocol by increasing the volume of the cresyl violet stock solution in the working solution. We increased the volume in 1.0 ml increments from 6.0 ml to 9.0 ml, in turn reducing the volume of distilled water. Assessing the ease of visualising and identifying the ganglion cells, optimal staining was achieved with 9 ml of additional cresyl violet stock solution and 51 ml of distilled water. Cresyl violet is a basic dye, though to dye the Nissl substance, it is required to be used in an acidic solution, and therefore the volume of acetic acid remained unchanged at 0.5 ml.
			Periodic Acid Schiff
			The Periodic Acid Schiff (PAS) stain was performed to highlight polysaccharides especially glycogen, found in basement membranes and fungal cell walls, indicating a fungal infection. The process of the PAS stain is to oxidise the hydroxyl groups in polysaccharides using periodic acid, producing aldehyde groups. The application of the Schiff reagent, binds to the aldehyde groups producing a magenta color with haematoxylin counterstaining producing purple cell nuclei. Our slides showed weak staining at the inner limiting membrane. This may be due to the polysaccharides present, as not all polysaccharides can be oxidised with a standard time frame, especially those containing anionic polysaccharides. We therefore increased the duration of the oxidation step from 10 min to 12, 15, and 20 min. We found that a 15 min oxidation step was most effective in PAS staining.
			Masson&#8217;s Trichrome Blue
			The principle of the Masson&#39;s trichrome blue stain is to stain collagen and muscle, which in our retinal slides can be used to indicate an increase in collagen tissue which may indicate fibrosis due to injury. This stain is sensitive to fixation techniques, so alterations were needed to obtain optimal staining. The process of this stain is to initially stain cytoplasm and muscle fibres red using the acidic Biebrich scarlet-acid fuchsin red dye. Differentiation with phosphomolybdic/phosphotungstic acid competes with the red dye in the collagen fibres. In the sclera, the large phosphomolybdic/phosphotungstic acid molecules are able to penetrate the loose connective tissue, as opposed to the dense muscle fibres which are penetrable to small molecules only. Aniline blue dye is then applied to replace the acid in the collagen fibres producing blue dyed sclera. To optimise this stain in retinal sections, the duration of staining with Biebrich scarlet-acid fuchsin dye was reduced to create a balance between the blue and the red dye. The use of Davidson&#39;s fixative also required an extended differentiation time to remove the red dye from the collagen. We trialled differentiation at 5, 6, 8, and 10 min, with optimal results occurring at 6 min. Differentiation also varies on the thickness and cutting of smooth sections, with greater than 6 min differentiation possibly being required.
			Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody
			Polyclonal, host species is rabbit, has a molecular weight of 50 kDa. GFAP antigen is an intermediate filament found in the cytoplasm (the cytoplasm of astrocytes and M&#252;ller cells in the retina), the antigen is made form 428 amino acids and has a molecular weight of 49512 Da.
			Neurofilament-200 antibody
			Monoclonal, host species is mouse, clone N52, isotype IgG1, it recognises phosphorylated and non-phosphorylated forms of the heavy neurofilaments which have a molecular weight of 200 kDa. The antibody will bind to an epitope in the tail domain of the neurofilament. The antibody will stain neurofilaments in the neuronal perikarya, dendrites and axons.
			Glutamine Synthetase (GS) antibody
			Monoclonal, clone GS-6, host species is mouse, has a molecular weight of 45 kDa and antibody isotype IgG2a. The GS antigen is found in the cell cytoplasm (cytoplasm of M&#252;ller cells in the retina), the antigen has 373 amino acids and a molecular weight of 42,064 Da.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis

Mit der jüngsten Entwicklung von Retina-Prothesen, ist es wichtig, zuverlässige Techniken für die Beurteilung der Sicherheit dieser Geräte in präklinischen Studien zu entwickeln. Allerdings sind die Standard-Fixierung, Vorbereitung und automatisierte Histologie Verfahren nicht ideal. Hier beschreiben wir neue Verfahren für die Bewertung der Gesundheit der Retina direkt benachbart zu einem Implantat. Retinal Prothesen verfügen Elektroden-Arrays in Kontakt mit Auge Gewebe. Bisherige Verfahren waren nicht in der Lage, räumlich zu lokalisieren Augengewebe benachbarten einzelnen Elektroden in der Anordnung. Darüber hinaus Standard histologischen Verarbeitung oft zu grob artifactual Ablösung der Netzhaut Schichten bei der Beurteilung implantierten Augen. Folglich ist es schwierig gewesen, um lokalisierte Schadens, falls vorhanden, die durch Implantation und Stimulierung einer implantierten Elektrodenanordnung. Daher entwickelten wir ein Verfahren zur Identifizierung und Lokalisierung der Okulargewebe neben implantiert electrodes mit einem (farblich gekennzeichnet) Farbstoff Benotungsschema und modifizierten wir ein Auge Fixationstechnik zu artifactual Netzhautablösung minimieren. Auch dieses Verfahren machte die Sklera durchscheinend, so dass Lokalisierung von einzelnen Elektroden und bestimmte Teile eines Implantats. Schließlich haben wir eine angepasste Steuerung, um die Macht der histopathologischen Bewertungen zu erhöhen. Zusammenfassend ermöglicht dieses Verfahren eine zuverlässige und effiziente Diskriminierung und Auswertung der retinalen Cytoarchitektur in einem implantierten Auge.

Abbildung 4 zeigt einen repräsentativen Ausschnitt aus Schneiden der Probe in Abbildung 3 dargestellt erhalten. Der Abschnitt bei 5 um Dicke und gefärbt mit H &amp; E, nach den Protokollen beschrieben geschnitten. Die Brutto-Form der Teststreifen wird mit minimalem Differential Gewebe Artefakte (4A) erhalten. Beide Farbstoff Markierungen sichtbar waren auf der Lederhaut, obwohl die grüne Farbstoff war widerstandsfähiger als der rote (4B). Die retinalen Schichten wurden nicht artifactually abgelöst und die Netzhautmorphologie wird beibehalten (4C). Das retinale Gewebe benachbart zu dem Farbstoff Markierungen, die die Position der Elektroden in der Anordnung entspricht, können leicht identifiziert werden. Abbildung 5 zeigt repräsentative spezielle Färbung und Immunhistochemie von Gewebeschnitten, die gemäß dem aktuellen Protokoll. Siehe Abbildung 5 caption und ergänzende Materialien für weitere Einzelheiten über die spezifischen Flecken und den Änderungen an ihrer Nutzung. Post-Modifikation, diese Flecken und Immunhistochemie waren äquivalent zu etablierten Standards - wie von Pathologen überprüft. <table border="1"><tbody><tr><td> Art der primären Antikörper und Titer (in Klammern) </td><td> GFAP (1:1500) </td><td> NF200 (1:100) </td><td> GS (1:100) </td></tr><tr><td> Art des sekundären Antikörper-Titer und (in Klammern) </td><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Alexa Fluor 488 </td></tr><tr><td> Dauer der Inkubation von sekundärem Antikörper </td><td> 1 Stunde </td><td> 2 Stunden </td><td> 45 min </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Antibody Typ, Titre und Dauer der Kennzeichnung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig1.jpg" /> Abbildung 1. Suprachoroidal Prototype Electrode Array. A) Makroaufnahme einer klinischen Grad geformten Array. B) Mikroskopische Aufnahme einer handgefertigten präklinischen Array. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ehemalige Retinal Histologie. Norm histologischen Methoden wurden verwendet, um diese vorzubereiten, H &amp; E-gefärbten, Abschnitte eines Auges mit einem suprachoroidalen Elektroden-Array implantiert. A) Eine orthogonale Schnitt durch das Elektroden-Array Hohlraum (dargestellt durch einen Stern). Die Retina ist von der äußeren Augengewebe getrennt. Dies wird besonders deutlich unterhalb des implantierten Bereichs (Pfeil). Es ist unmöglich zu bestimmen, welcher Teil der Retina benachbart zu jeder einzelnen Elektrode des Arrays. Scalebar = 1 mm. B) Eine höhere Vergrößerung des boxed Region in Panel A. Es gibt mehrere, regelmäßig angeordneten, Artefakte in der Netzhaut layers (Pfeile), sowie die wichtigsten Loslösung von der Tapetenzellen Schicht (die reflektierende Schicht in Katzenaugen). Scalebar = 100 um. C) Ein höherer Vergrößerung des boxed Region in Panel B. Pfeil angedeutet den äußeren Segmenten der Photorezeptoren sowie die pigmental Epithel, die intakt bleiben, was darauf hindeutet, dass die Ablösung ein Artefakt Nebeneffekt der Verarbeitung, um die durch eine in vivo Trauma oder Pathologie verursacht entgegengesetzt war. Scalebar = 20 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig3.jpg" /> Abbildung 3. Lokalisierung und Präparation der Elektroden-benachbartes Gewebe. AD) Hoher Dynamikbereich Makroaufnahmen einer entkernten Auge, mit einem suprachoroidalen Elektroden-Array in situ. A) Beitrag mit Davidsons Fixativ fixiert und vor dem Array entfernt, ermöglicht die transluzente Lederhaut Visualisierungdie einzelnen Elektroden in der Anordnung (einziges Beispiel angegeben mit Pfeil). B) Die Elektroden sind mit einem vorgegebenen Farbstoff markiert. C) Dye Markierungen in regelmäßigen Abstand von anatomischen Landmarken verwendet werden, um Konsistenz zu erhalten über Experimente. D) Nach dem Entfernen der Array wird das Auge von Hand in Teststreifen seziert. Farbige Pfeile zeigen zwei der Elektrode benachbarten Stellen auf der Lederhaut. Gelb gestrichelte Linie zeigt Schnittebene. E) Makro-Fotografie von Teststreifen in einem Agar-Block. F eingebettet) Makro-Fotografie von der Agar-Embed-Teststreifen von Panel E, ausgeschnitten und in einem Einbettungskassette unterstützt durch Schaum Biopsie-Pads um eine Bewegung des Abschnitts während der Verarbeitung zu minimieren. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig4.jpg" /> Abbildung 4. New Retinal Histologie. </s<html> trong&gt; Das oben Probestreifen (von 3D), die die Elektrode Tasche wurde in Paraffin eingebettet, geschnitten bei 5 um und gefärbt mit H &amp; E A) grün und rot gefärbten Bereiche (angedeutet durch die Pfeile, wie Fig. 3D) sind in ein Schnitt auf der Ebene der gelben gestrichelte Linie in 3D gemacht. Maßstab bar = 1000 um. Die Netzhaut ist nicht gelöst, weder unter dem Array Tasche noch fern. B) Der boxed Region von Panel A mit sichtbaren roten und grünen Farbstoff durch Pfeile angedeutet, und intakte Netzhaut ganz. Maßstab bar = 500 um. C) Der boxed Region von Panel B, zeigt die intakte, befestigt, Netzhaut neben dem grünen Farbstoff. Maßstab bar = 50 um. Wissen, dass die Lage des Farbstoffes zeigt die Anordnung einer Elektrode können wir sicher beurteilen benachbarten Netzhautgewebes für Schäden, falls vorhanden, die durch elektrische Stimulation. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/50411/50411fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beispiele für modifizierte retinalen cytohistochemistry mit speziellen Flecken und Immunfluoreszenz. Die Verwendung von Davidson Fixiermittel zu Standard Formalinfixierung Techniken erforderlich, Änderungen an den üblichen Färbemethoden, wie es im Hauptanspruch dargelegt Protokolltext entgegengesetzt. Pathologen haben bestätigt, dass diese Änderungen in gleicher Färbung geführt. A) H &amp;E; Hämatoxylin Flecken Zellkerne violett, wohingegen Eosin Flecken Zytoplasma, Kollagen und Stützgewebe verschiedenen Schattierungen von Rosa. B) LFB Flecken Myelin blau, während die Kresylviolett Gegenfärbung verwendet werden kann, werden . identifizieren Ganglienzellen durch Färbung Nissl Stellen im Perikaryon blau und Hervorhebung der Satelliten-Zellen die Zellen umgebende C) Masson Trichrom blau; die Biebrich-Scharlach Säurefuchsin Lösung Flecken Muskel figlieder rot, während die blauen Flecken Anilin das Kollagen, in diesem Fall Lederhaut, blau D) PAS;. Glykoprotein Komponenten Basalmembran und Bindegewebe Komponenten sind gefärbt lila, während die Hämatoxylin Gegenfärbungen Zellkerne violett E) Perls &#39;Preußisch Blau. am Ort der Blutung, produziert die Bildung von Hämosiderin abgebaut roten Blutkörperchen und die Freisetzung von Eisen-Komplexe eine violette Farbe, während die Zugabe von Neutralrot Beizfarben Lysosomen rot F) GS;. diese Neurotransmitter abbauende Enzym in Müller-Zellen 13 gefunden (grün ), zu sehen, die sich in beide Richtungen bei Müller Zellkörper in der inneren Körnerschicht und Müller Zelle Endfüßen Bilden der inneren Grenzmembran G) NF-200 werden;. diese schweren Kette Zytoskelett-Protein (grün) in Zellsoma und Verfahren gefunden Vernetzungen mit anderen neurofilaments, um die Struktur von Neuronen 14,15 aufrechtzuerhalten. GanglionZellen und ihrer Axone in den Ganglienzellen und Nervenfaserschicht zu sehen, während Axone horizontalen Zellen an der äußeren Grenze des inneren Körnerschicht in der Katze Netzhaut ebenfalls hervorgehoben. Gegenfärbung mit DAPI (blau) ermöglicht die Visualisierung von Netzhautschichten H) GFAP;. Diese Zytoskelettprotein (rot) in Müller-Zellen und Astrozyten während Gliose 16 vermehrt, zu sehen entlang der Nervenfaser Schicht mit Müller-Zellen bilden dünne Erweiterungen durch den inneren zu äußeren Schichten der Netzhaut. Gegenfärbung mit DAPI (blau) die Visualisierung der retinalen Schichten. Maßstab bar = 50 um in allen Panels. Die innere Retina an der Spitze eines jeden Bildes, die äußere Netzhaut an der Unterseite eines jeden Bildes, ohne Tafel E, die subscleral Reaktion zeigt.

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Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

Techniken zur Visualisierung von retinalen Zytoarchitektur direkt an einzelnen Elektroden innerhalb eines Retina-Stimulator.

Techniken für die Verarbeitung Augen mit einem Netzhautprothese für lokalisierte Histopathologische Analyse Implantierte

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.5K Aufrufe.  Bionics Institute. Techniken zur Visualisierung von retinalen Zytoarchitektur direkt an einzelnen Elektroden innerhalb eines Retina-Stimulator.

Serie: Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

How to Measure Cortical Folding from MR Images: a Step-by-Step Tutorial to Compute Local Gyrification Index

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will be identifiable at any age. As recently reviewed by Mangin and colleagues2, several methods exist to quantify different characteristics of gyrification. For instance, sulcal morphometry can be used to measure shape descriptors such as the depth, length or indices of inter-hemispheric asymmetry3. These geometrical properties have the advantage of being easy to interpret. However, sulcal morphometry tightly relies on the accurate identification of a given set of sulci and hence provides a fragmented description of gyrification. A more fine-grained quantification of gyrification can be achieved with curvature-based measurements, where smoothed absolute mean curvature is typically computed at thousands of points over the cortical surface4. The curvature is however not straightforward to comprehend, as it remains unclear if there is any direct relationship between the curvedness and a biologically meaningful correlate such as cortical volume or surface. To address the diverse issues raised by the measurement of cortical folding, we previously developed an algorithm to quantify local gyrification with an exquisite spatial resolution and of simple interpretation. Our method is inspired of the Gyrification Index5, a method originally used in comparative neuroanatomy to evaluate the cortical folding differences across species. In our implementation, which we name local Gyrification Index (lGI1), we measure the amount of cortex buried within the sulcal folds as compared with the amount of visible cortex in circular regions of interest. Given that the cortex grows primarily through radial expansion6, our method was specifically designed to identify early defects of cortical development.
In this article, we detail the computation of local Gyrification Index, which is now freely distributed as a part of the FreeSurfer Software (<a href="http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/">http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/</a>, Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital). FreeSurfer provides a set of automated reconstruction tools of the brain's cortical surface from structural MRI data. The cortical surface extracted in the native space of the images with sub-millimeter accuracy is then further used for the creation of an outer surface, which will serve as a basis for the lGI calculation. A circular region of interest is then delineated on the outer surface, and its corresponding region of interest on the cortical surface is identified using a matching algorithm as described in our validation study1. This process is repeatedly iterated with largely overlapping regions of interest, resulting in cortical maps of gyrification for subsequent statistical comparisons (Fig. 1). Of note, another measurement of local gyrification with a similar inspiration was proposed by Toro and colleagues7, where the folding index at each point is computed as the ratio of the cortical area contained in a sphere divided by the area of a disc with the same radius. The two implementations differ in that the one by Toro et al. is based on Euclidian distances and thus considers discontinuous patches of cortical area, whereas ours uses a strict geodesic algorithm and include only the continuous patch of cortical area opening at the brain surface in a circular region of interest.

Measuring gyrification (cortical folding) at any age represents a window into early brain development. Hence, we previously developed an algorithm to measure local gyrification at thousands of points over the hemisphere1. In this paper, we detail the computation of this local gyrification index.

Wie kortikale Faltung von MR-Bildern messen: eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Local Gyrification Index Compute

Cortical folding (gyrification) is determined during the first months of life, so that adverse events occurring during this period leave traces that will ...

Forschung

Medizin

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Techniken für die Verarbeitung Augen mit einer Netzhautprothese für Implantierte Lokalisierte histopathologische Analyse: Teil 2 Epiretinale Implantate mit Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Methodik für Sputum Induktion und Labor-Verarbeitung

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Customizing a Cryolite Glass Prosthetic Eye

In Germany, Austria, and Switzerland, over 90% of ocularists still manufacture customized prostheses using cryolite glass from Thuringia. The present manuscript demonstrates this long-forgotten technique in detail. This manuscript shows some major advantages of manufacturing prosthetic eyes using cryolite glass in comparison to poly(methyl methacrylate) (PMMA). These advantages include a lighter weight of the prosthesis, higher levels of patient satisfaction, and only one appointment necessary for the customized manufacturing. Potential risk of breakage seems not to be a critical disadvantage for glass prosthetic eye wearers. However, in some patients, manufacturing a well-fitting prosthetic eye is not possible or reasonable due to anophthalmic socket complications such as post nucleation socket syndrome, scarred fornices, or an orbital implant exposure. This article gives ophthalmologists a better insight into ocularistic care in order to improve the essential interprofessional collaboration between ocularists and ophthalmologists.

This manuscript shows each step of customizing a cryolite glass prosthetic eye including some major advantages of the use of cryolite glass for manufacturing an eye prosthesis compared to poly(methyl methacrylate). In addition, this manuscript gives ophthalmologists better insight into the ocularistic care that could improve interprofessional collaboration.

Anpassen eines Kryolglas-Prothesenauges

In Germany, Austria, and Switzerland, over 90% of ocularists still manufacture customized prostheses using cryolite glass from Thuringia. The present ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Eine Methode zur Prozessoptimierung von Zanba-Pfannengerichten mit Tiebangchui

Optimization of Processing Technology for Tiebangchui with Zanba Based on CRITIC Combined with Box-Behnken Response Surface Method

The dried root of Aconitum pendulum Busch., called Tiebangchui (TBC) in Chinese, is one of the most famous Tibetan medicines. It is a widely used herb in northwest China. However, many cases of poisoning have occurred because of TBC's intense toxicity and because its therapeutic and toxic doses are similar. Therefore, finding a safe and effective method to reduce its toxicity is an urgent task. A search through the Tibetan medicine classics shows that the processing method of TBC stir-fried with Zanba was recorded in the "Processing specification of Tibetan medicine of Qinghai Province (2010)". However, the specific processing parameters are not yet clear. Thus, this study aims to optimize and standardize the processing technology of Zanba-stir-fried TBC.
First, a single-factor experiment was conducted on four factors: the slice thickness of TBC, amount of Zanba, processing temperature, and time. With monoester and diester alkaloid contents in Zanba-stir-fried TBC as indexes, CRITIC combined with the Box-Behnken response surface method was used to optimize the processing technology of Zanba-stir-fried TBC. The optimized processing conditions of Zanba-stir-fried TBC were a TBC slice thickness of 2 cm, three times more Zanba than TBC, a processing temperature of 125 &#176;C, and 60 min of stir-frying. This study determined the optimized and standard processing conditions for the usage of Zanba-stir-fried TBC, thus providing an experimental basis for the safe clinical use and industrial production of Zanba-stir-fried TBC.

Autor im Rampenlicht: Optimierung der Verarbeitungstechnologie für Tiebangchui mit Zanba auf Basis von CRITIC in Kombination mit der Box-Behnken Response Surface Method  

The present protocol describes an efficient and standard detoxification processing method for Zanba-stir-fried Tiebangchui using CRITIC combined with the Box-Behnken response surface method.

Optimierung der Aufbereitungstechnik für Tiebangchui mit Zanba auf Basis von CRITIC in Kombination mit der Box-Behnken Response Surface Methode

The dried root of Aconitum pendulum Busch., called Tiebangchui (TBC) in Chinese, is one of the most famous Tibetan medicines. It is a widely used herb in ...