Name: techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks
Uploaded: 2015-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
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Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

HINWEIS: Alle Verfahren wurden von der Royal Victorian Eye and Ear Hospital Tierforschung und Ethik-Kommission genehmigt (RVEEH AEC; # 10-199AB). Die Probanden wurden nach dem National Health und Medical Research Council &quot;Australian Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken&quot; (2013) und die &quot;Prävention von Tierquälerei Act&quot; behandelt (1986 und Änderungen). Alle chirurgischen, klinische Bewertung und elektrophysiologische Verfahren wurden unter Narkose durchgeführt und alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden zu minimieren. 1. Enukleation und Fixierung HINWEIS: Befolgen Sie die im Detail in der Begleiter Manuskript 16 beschrieben Enukleation und Fixierung Verfahren, wobei besonders vorsichtig, um Gerätekabel oder Vitrektomie-Ports, falls vorhanden. Kurz gesagt, dies beinhaltet: <ol><li> Transkardial perfuse das Thema mit warmer Kochsalzlösung, gefolgt von kalten neutralen bufferot Formalin. </li><li> Binden Sie Nähte am Augapfel als Landmarken dienen. </li><li> Entkernen das Auge 16 unter Beibehaltung der Gerätekabel und alle Befestigungs patches / Tabs. </li><li> Post-fix das Auge in Davidsons Lösung für 18 - 36 Stunden. </li><li> Transfer zum 50% Ethanol für 6-8 Std. </li><li> Transfer zum 70% Ethanol und im Kühlschrank (4 ° C), bis Dissektion. </li></ol> 2. Elektroden-Entfernung und Dissection. HINWEIS: Nicht alle epiretinalen Implantate den gleichen Formfaktor aufweisen, aber im allgemeinen wird es eine Elektrodenanordnung und eine gewisse Form von flexiblen und anpaßbare Trägermaterial sein. Geräte, die auf der Netzhaut angeheftet sind mit einem Tack Loch, wo der Metallheft dringt das Array und den hinteren Teil des Auges, wobei diese zusammen. <ol><li> Visualisieren des Implantats und dem Punkt, wo es auf die Netzhaut befestigt. <ol><li> Mit einem 15-Grad-Klinge einen Umfangstranshornhautschnitt und entfernen Sie die Hornhautkappe zu expose der zugrunde liegenden Iris und Linse. </li><li> Mit einem 15-Grad-Klinge, disinsert die Zonulafasern der Linse und entfernen Sie die Linse in toto, Freilegung der hinteren Kammer mit dem epiretinalen Implantat und dem Metall tack in situ. </li></ol></li><li> Abhängig von dem Implantat und dem die Prüfung durchgeführt wird, zu entfernen Fremdkomponenten vor der weiteren Zerlegung. HINWEIS: Bei dem vorliegenden Beispiel ist die epiretinale Array ausgewertet bestand aus einem hermetischen Prototyp Diamantelektrode und Elektronikpaket innerhalb einer konformen Silikonträger untergebracht (im Haus hergestellt, siehe 20). <ol><li> Hier vorsichtig heraus die Diamantelektrode Paket von feinen Sezierung mit einem Skalpell. Lassen Sie das Silikon Körper des Implantats zusammen mit der Netzhauthaftung und den Überresten der Platin Verdrahtung (Bild 2). Wenn ein Embedded Array / Gehäuse ist nicht Bestandteil des Gerätes Design untersucht, dann lassen Sie diesen Schritt (2.2). </li></ol></li><li> Vorsichtigsezieren ein Beispiel, das die Klebrigkeit und das umgebende Gewebe in der gewünschten Ausrichtung umfasst. Verwenden Sie feinen Sezierung Schere gesamten Dicke Streifen von der Rückseite des Auges, einschließlich der Lederhaut, Aderhaut und der Netzhaut zu schneiden. Nehmen Sie eine Probe, die einen Längsschnitt des Tack gibt, in der alle Netzhautschichten neben dem Tack (Abbildung 2) HINWEIS: Die gewünschte Ausrichtung für die Probe kann abhängig von der speziellen gewünschten Ergebnis. Zum Beispiel, wenn man die Nähe der klebe Beschädigung der optischen Platte dann sollte die optische Platte innerhalb der Probe enthalten sein zu prüfen wünscht. </li></ol> 3. Dehydration, Einbetten, Montage, reiben, Färbung und Imaging <ol><li> Entwässern der Probe über drei Tage in progressive Ethanol Stufen: <ol><li> Dehydrieren der Probe in 70% Ethanol für 2 Stunden zweimal. </li><li> Dehydrieren der Probe in 80% Ethanol für 2 Stunden zweimal und dann O / N. </li><li> Entwässern der Probe in 90% Ethanol für 2 Stunden TWICe. </li><li> Dehydrieren der Probe in 100% Ethanol für 2 Stunden zweimal und dann O / N. </li></ol></li><li> Entwässern der Probe in 100% Aceton für 2 Stunden zweimal. <ol><li> Entfernen Sie die Probe aus dem Aceton und unter einem Lichtmikroskop, wie es Luft trocknet bei Raumtemperatur zu beobachten es. Die Probe in Epoxidharz (siehe Schritt 3.4), kurz bevor es beginnt zu rollen / verdecken. Hinweis: das Entfernen von Flüssigkeit aus den Weichteilen ergibt sich zusammengebrochen Zellen und Schrumpfung. Eine Würdigung, wenn das Gewebe Curling / verdecken tritt mit Erfahrung entwickelt. </li></ol></li><li> Bereiten medical grade Epoxidharz nach den Anweisungen des Herstellers. Um das Harz zu härten, verwenden Sie entweder 55 ° C für 1 Stunde oder 24 Stunden bei Raumtemperatur. In einer Vakuumkammer für ~ 5 min bei ~ 50 mbar zur Entfernung der Luftblasen. Manuell regeln das Vakuum als ein übermäßiges Vakuum bewirkt, dass der Epoxy Mischung zum Kochen bringen und Entgasung nicht wirksam auftreten HINWEIS: Führen Sie Schritt 3.3 gleichzeitig mit Schritt 3.2. </li><li> Betten Sie die sample in klaren Epoxidharz. Tauchen Sie die Augengewebe in entgastem Epoxy in geeigneter verschließbaren Behälter und lassen Sie O / N bei RT zu heilen. </li><li> Achten Sie darauf, um die Probe in der gewünschten Orientierung (Abbildung 2), die durch die Größenänderung und Wieder Einbettung des ausgehärteten Epoxid Block einbetten. Re-betten die Größe verändert Satz mit dem Augengewebe, so dass die lange Achse des Tack ist parallel zum Boden der Form ausgerichtet (gelbe Tasse - 3A). </li><li> Montieren Sie das Harz in einem Schleifprobenhalter und schleifen die Probe (230 bis 250 Umdrehungen pro Minute mit Wasser auf, manuelles Schleifen) mit Siliziumkarbid-Papier (beginnend mit 800 Gitter; 3C und 3E). </li><li> Zur Färbung, tauchen die Bodenoberfläche in Toluidinblau-Färbung für 3-5 min, oder bis der Fleck entwickelt (3F). </li><li> Spülen mit Leitungswasser (Abbildung 3G). </li><li> Bild die geschliffene Oberfläche der Probe mit einer hohen Leistungs Dissektion Umfang um die Zellschichten des visualisierenNetzhaut (3H). Einen Tropfen von destilliertem Wasser auf die Oberseite des Epoxy oberhalb der Probe, um die Beugung an der Luft-Epoxy-Schnittstelle zu glätten. Verwenden Sie eine optische Faser &quot;Schwanenhals&quot; Lichtquelle, um die Probe zu beleuchten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,6 bis 3,9, bei jedem Schleifen entfernt eine vorgegebene Dicke der Probe (Mindest präzise und reproduzierbare Schleifschritt der Probenhalter ist 20 um). </li></ol>

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Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

Histologischen Standardtechniken sind nicht imstande, Hartmetallimplantate in situ Prozess wegen der Beschränkungen in Schneid diese Objekte mit Metall, Glas oder auch Diamantscheiben. In unserem Begleiter Papier 16 zeigten wir, daß die Verwendung einer modifizierten Vollaugenfixierung Technik könnte artifactual retinalen Delaminierung verringern. In der aktuellen Manuskript, ein etabliertes Schleif- und Poliertechnik zur Visualisierung Cochlea-Implantate in situ 21-23 wurde für die Netzhautprothesen modifiziert. Ein Titan-tack, verwendet werden, um eine Elektrodenanordnung auf die Netzhaut zu sichern, epiretinal wurde in Epoxidharz zusammen mit dem umgebenden Augengewebe eingebettet. Diese Harzblock wurde dann in geeigneter Weise, um die Gewebemorphologie unmittelbar angrenzend an die Metall tack offenbaren orientiert und schrittweise geschliffen / poliert. Bilder von der polierten Oberfläche des Blocks in verschiedenen Tiefen wurden mit einem leistungsstarken Dissektionsmikroskop gemacht. Diese Technik ist nützlich für: Visualisieren und evaluating die Gewebereaktion neben dem epiretinalen Implantats; um das Operationstrauma mit der Implantation des Implantats verbunden sind, bewerten; die biologische Reaktion auf die Hartmetallkomponenten zu bestimmen; und um den Abstand zwischen dem Implantat und der Oberfläche der Netzhaut zu messen. Diese Technik wird in situ Visualisierung der Bereich in der Nähe einer Netzhaut-Tack oder andere harte (zB metallischen) Gegenstände in die Augen, die in Zukunft Sicherheitsstudien sein. Dies hat direkte Anwendung bei der Beurteilung der präklinischen Sicherheits Prothesen an der Netzhaut angeheftet epiretinal. Es kann auch nützlich für die Bewertung Gewebeschäden bei Retinabereiche in Kontakt mit Implantaten im subretinalen Stelle angeordnet sein. Es gibt mehrere Möglichkeiten, um sicherzustellen, daß das Verfahren korrekt durchgeführt wurde. Bei jedem Schritt sollte die Netzhaut zu den äußeren Schichten des Auges befestigt bleiben. Wenn es Brutto artifactual Netzhautablösung kann dieser indischenaß ein Problem bei der Fixierung. Wenn die Probe eingebettet ist, und in der endgültigen Harz umorientiert blockieren die Retina sollte in der Nähe der Schleiffläche des Blocks orthogonal sein; dies Schrägschneid minimieren. Es ist nützlich, um zu überprüfen, dass die Anzahl der inkrementellen Schleifschritte (bekannter Schrittgröße), die für ein Objekt (wie ein Retina Klebrigkeit) durchlaufen entsprechend korrelieren mit den Abmessungen des Objekts. Die Technik kann auf verschiedene Weisen optimiert werden. Kratzer auf der Oberfläche des mit der Schleifprozess verbunden Epoxydblock kann mit zunehmend feineren Poliergrad reduziert werden. Für die vorliegende Studie verwendeten wir 800, 1000, 1200, 2400, und 4000 Grad Siliciumcarbidpapier. Diamantpaste könnte auch verwendet werden, um die Oberflächenqualität zu verbessern. Eine feinere Oberflächengüte ergibt eine höhere Bildqualität, aber auf Kosten einer zusätzlichen Polierzeit. Ein weiterer kritischer Betrachtung zur Verbesserung der Ergebnisse dieser Technik ist die Auswahl und Qualität des optics und Beleuchtung für die Bildaufnahme verwendet. Andere histologische Grundflecken - besonders Nissl Flecken, kann anstelle von Toluidinblau verwendet werden, jedoch kann eine weitere Optimierung erforderlich. Einige Flecken wird das Harz als auch das Gewebe (zB Eosin), daher kann eine flache Lack nach der Färbung erforderlich ist, um Hintergrundfärbung zu entfernen Fleck. Spezialisierte Flecken, Fluoreszenzfarbstoffe und immunhistochemischen Färbung wurde nicht versucht, aber wenn ein sehr spezifisches Ergebnis erwünscht ist, ist die erforderliche Zeit, um diese Flecken an jedem Schleifebene ausführen wahrscheinlich unerschwinglich. Jedoch kann es möglich sein, das Gewebe als Ganzes vor dem Einbettungsschritt (Schritt 3.4) 24 zu färben. Die Haupteinschränkung dieser Technik ist, dass, sobald der interessierende Bereich wurde abgeschliffen, nicht wiederhergestellt werden können, ist es daher ratsam, viele (möglicherweise redundant) Bilder mit einer Vielzahl von Vergrßerungen in jeder Stufe des Schleifens und Polierens zu erfassen. Es istauch wichtig, in kleinen Schritten für jeden Schleiftiefeneinstellung zu verwenden. Eine weitere Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass von der optischen Vergrßerung und Auflösung im Vergleich mit dem Gewebe auf einem Glasträger befestigt und mit einem Standard (Transmission) Lichtmikroskop betrachtet. Für die Zwecke des Prototyping und Bewertung der Sicherheit eines neuartigen Implantatvorrichtung ist von primärem Interesse der pathologische Auswertung. Dieses Verfahren stellt eine effiziente Methode zur Beobachtung der klinisch relevanten Schäden mit einer Retina Klebrigkeit verbunden. Mit etwas Übung die Gesamtzeit zum schleifen, polieren zu sammeln und zu fotografieren eine gegebene Probe (einmal eingebettet) ist vergleichbar mit der Zeit würde es dem Kapitel einen Paraffinblock oder Gefrierschnitt zu nehmen. Es besteht auch das Potential für die vorliegenden Techniken auf Anwendungen außerhalb des Bereichs der Netzhautimplantate verlängert. Diese Technik ist für die Bewertung des Gewebes angrenzend an eine Fest Implantat gegebenen Implantat Extraktion nicht geeignet feasible oder würde die Schnittstelle beschädigt werden. Zum Beispiel könnte diese Technik erweitert werden, um Implantate aus Metall (beispielsweise Platin, Nitinol, etc.), die nicht mit herkömmlichen histologischen Verfahren geschnitten werden können, hergestellt werden, zu bewerten, wie einige tiefe Gehirn oder peripheren Nervenelektroden, Kanülen für die Arzneimittelabgabe, Gefäßstents oder orthopädische Prothesen.

Retinitis pigmentosa (RP) ist eine erbliche Erkrankung, die weitverbreitete Verlust von Photorezeptoren, die die Zellen in der äußersten Schicht der zur Transduktion Licht verantwortlich Retina verursacht, in der Form von Photonen, in neuronale Aktivität. Wichtig ist, dass Patienten mit RP haben typischerweise Rest Neuronen in den anderen Schichten der Netzhaut, die noch funktionsfähig sind. Netzhautprothesen zur Wiederherstellung einige begrenzte Vision für diese Patienten, indem sie auf diese überlebenden Neuronen mit elektrischer Stimulation ihrer Sehbahn 1,2 zu aktivieren. Perceptual Ergebnisse aus klinischen Studien haben gezeigt, viel versprechende erste Ergebnisse und vor kurzem einige Geräte sind für den kommerziellen Gebrauch zugelassen ist. Derzeit gibt es drei Haupt anatomischen Stellen, in denen klinische retinalen Prothesen positioniert worden: epiretinal 3,4, subretinal 5,6 und suprachoroidally 7,8. Verschiedene Geräte verwenden unterschiedliche Materialien und deren Form angepasst wirdan den Ort, in dem sie implantiert werden. Jedoch alle schaffen visuelle Wahrnehmungen durch Aktivieren der Rest Neuronen der Retina mit elektrischen Impulsen. Es besteht die Möglichkeit für jede medizinische Prothese beschädigen umliegende Gewebe durch mechanische Einwirkungen des anfänglichen Platzierung oder die späteren laufenden Kräfte. Im Falle von implantierbaren Stimulatoren, wie Netzhautprothesen besteht die zusätzliche Überlegung, dass die elektrischen Parameter sollten innerhalb sicherer Grenzen liegen. Die Sicherheit der Patienten ist von größter Bedeutung, so dass Geräte müssen konsequent in präklinischen Studien, bevor zum klinischen Bereich 9-15 getestet werden. In unserem Begleiter Artikel beschrieben wir eine Methode zur Bewertung der lokalisierten Histopathologie des Auges ein Implantat in der Suprachoroidalraum 16 positioniert Umgebung. Im vorliegenden Manuskript beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung von umgebenden eine Elektrodenanordnung an der Netzhaut angeheftet epiretinal, in einem präklinischen Augengewebe (zBLinie) Modell (Abbildung 1). Die epiretinalen Lage ist die am häufigsten verwendete Position zur Lokalisierung eines Sehprothese. Elektrodenanordnungen hier entfernt werden typischerweise an der Netzhaut mit einer Metall Klebrigkeit, die alle Schichten des Auges eindringt 17-20 befestigt. Vor den in der vorliegenden Handschrift beschriebenen Techniken, war es schwierig, genau zu beurteilen die Netzhaut und anderen Geweben eine Wende in unmittelbarer Umgebung. Standard-Augenfixierung mit neutral gepuffertem Formalin führte artifactual Netzhautschäden durch die unterschiedliche Bewegung der Netzhaut und Lederhaut gegen die feste Spitze des Stifts. Daher ist jede tatsächliche Schaden durch die Klebrigkeit und epiretinalen Array verursacht nicht genau eingehalten werden. Zusätzlich könnte Schneiden des Augengewebes nicht mit der retinalen Klebrigkeit in situ durchgeführt werden, wie Metallgegenständen kann nicht ohne weiteres mit herkömmlichen histologischen Vorrichtung geschnitten werden; Entfernen der Heft vor histologische Verarbeitung war auchunerwünscht, da dies führte auch zu artifactual Netzhautschäden. Das Ziel der vorliegenden Studie war zweifach: 1) zu einer Netzhautablösung Artefakt zu reduzieren, so dass keinerlei Einfluss auf die Klebrigkeit und das epiretinale Implantat Array verursacht verlässlich bewertet werden; und 2), um die Netzhautarchitektur benachbart zur Klebrigkeit, ohne es zu visualisieren. Um Ziel 1 zu erreichen, wurde eine neue Befestigungstechnik verwendet, die Artefakt retinale Ablösung reduziert (wie in der Begleiter Artikel 16 beschrieben). Um Ziel 2 zu erreichen, modifizierten wir eine Einbettung, Schleif-, und Poliertechnik, die ursprünglich für in situ Beobachtung der Cochlea-Implantat-Elektroden 21 bis 23 entwickelt. Die in dieser Handschrift beschriebenen Verfahren ermöglichen die Visualisierung der Netzhaut umgeben und grenzt an einer Wende in situ bei gleichzeitiger Minimierung artifactual Netzhautschäden und ermöglicht so eine genaue Abschätzung der möglichen Schäden, die durch die Klebrigkeit und epiretinalen Array verursacht.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Chem-Supply</td><td>AA008</td><td>Propanone BHD Medical grade</td></tr><tr><td>Epo-Tek 301 Epoxy</td><td>Epoxy Technology</td><td>Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70-75% v/v</td><td>Merck PTY LTD</td><td>4.10261</td><td>Alcohol</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck PTY LTD</td><td>90143</td><td>Alcohol</td></tr><tr><td>Toluidine blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TegraPol grinding/polishing machine</td><td>Struers</td><td>TegraPol-25</td><td></td></tr><tr><td>AccuStop specimen holder</td><td>Struers</td><td>Accustop</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Leica</td><td>2.0x Planapo Objective</td><td></td></tr><tr><td>Digital Microscope Camera</td><td>Leica</td><td>DFC-420C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>Application Suite v4.1.0</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Die Fixierung Protokoll erheblich reduziert artifactual Ablösung und Delamination der Netzhaut 16. Orientierung der Probe innerhalb des Epoxydblock wurde durchweg unter Verwendung der beschriebenen zweistufigen Einbettungsprozess erreicht. Die inkrementelle Schleifvorgang erforderlich eine moderate manuelle Geschicklichkeit, um optimale Ergebnisse zu erzielen, wurde aber durch die einstellbare Probenhalter, die Feineinstellung der Schrittauflösung vorgesehen unterstützt. In allen Fällen (n = 5) der Klebrigkeit wurde entfernt und Boden / mit erwünschten und konsistente Ergebnisse poliert. Die Netzhaut neben den Reißzwecken wurden aufgelöst und entsprechend gefärbt. Polieren der Oberfläche der Epoxidharz-Block mit der Note P # 800 Siliciumcarbidpapier war ausreichend, um Bild die zelluläre Makrostruktur der eingebetteten Gewebe. Schleifpapier höher oder Diamantsuspension verwendet werden, um die Oberfläche weiter zu polieren zu einem bestimmten Tiefe, falls gewünscht. Ein Dissektionsmikroskop und Glasfaser &quot;Schwanenhals&quot; light Quelle wurde als geeignet für die Abbildung der Oberfläche der Masseblock und der eingebetteten Gewebeprobe sein. Die Position der Lichtquelle wurde durch Versuch und Irrtum variiert, um eine Position und Winkel, die die beste Ausleuchtung und Kontrast durch das Mikroskop ergab finden. Indem ein Tropfen destilliertes Wasser auf die Oberfläche des Blocks, oberhalb der Probe, war nützlich für Lichtweg Beugung und / oder glatte Verzerrungen am Epoxy-Luftschnittstelle zu verringern, Fig. 4 zeigt beispielhafte Bilder von Retinagewebe sichtbar unmittelbar neben einer Titan retinalen tack mit dieser Technik. Nicht artifactual Netzhautablösung und Faltung kann auf beiden Seiten des Silikon (4A) gesehen werden. Die Klebrigkeit Welle sichtbar ist in Silikon eingebettet ist; der Leiter der Wende hat sich die Netzhaut und Lederhaut eingedrungen. Es ist nicht artifactual Netzhautablösung im ungefärbten Retina beiden Seiten des Silikon (4C). Die Technik hat sich gezeigt, daß in diesem Fall there Netzhaut Desorganisation neben dem Tack und Kompression der Netzhaut auf der einen Seite durch eine schräge Einführungswinkel. Beachten Sie, dass die gezeigten Bilder sind lediglich Illustrationen der Erfolg der Technik, nicht repräsentativ für klebe Schäden Histopathologie im Allgemeinen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Platzierung eines epiretinalen Elektrodenarray. (A) Schematische Darstellung des Auges zeigt eine vergrößerte Querschnitt des hinteren Lederhaut, Aderhaut und Netzhaut degeneriert (ohne Photorezeptoren). Eine Elektrodenanordnung ist in blau dargestellt, epiretinal angebracht. (B) den computergestützten Darstellung einer epiretinalen Elektrodenarray. a, integrierten Schaltungen (&quot;Chip&quot;) und Elektrodenpaket; b, Titan Netzhaut Tack; c, medizinischem Silikon Gehäuse; d, Blei Austrittsstelle. Panel A geändert von ursprünglich illustratiauf zur Verfügung gestellt von Bionic Vision Australia, Copyright Beth Croce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Elektrodenentfernung und Präparation des Auges. Hoher Dynamikbereich Makroaufnahmen einer entkernten Katzenauge mit epiretinalen tack in situ. (A) Beitrag Fixierung mit Davidsons Fixiermittel, die mit Retina-Architektur 16 zu erhalten, wurde die entkernte Auge seziert. Die Elektrodenanordnung Paket wurde von dem Siliconträger entfernt (gestrichelte quadratischen Umriss zeigt ursprüngliche Position Elektrodenanordnung) mit der Klebrigkeit (Pfeil) und Silikonkörper des verbleibenden Implantats. (B) Das Auge wurde mit der Längsquerschnitt angrenzend an die seziert Stift(Gestrichelte Linie). Die Klebrigkeit bleibt in der hinteren Wand der Augenmuschel (Pfeil) eingebettet ist, stabilisiert überwiegend von der Lederhaut. Der Gewebeschnitt, der die Klebrigkeit wurde zur Harzeinbettung und Schleifen (rechtes Segment) erstellt, während der Abschnitt, der die Netzhaut unter dem entfernten Elektroden-Array wurde für Standard-histologische Verarbeitung 16 (linkes Segment) erstellt. Ein Herrscher mit 0,5-mm-Raster ist an der Unterkante jeder Platte angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Epoxy Einbettung und Schleifen der Klebrigkeit und Netzhautgewebe. Fotos der Epoxy eingebettet und ausgerichtet Gewebeprobe, Schleifen, Beizen und Bildgebung des Tack und Netzhautgewebe. (A) Die tac<html> k Probe wurde in ein Epoxyharz Block eingebettet. Unter Verwendung der Form wurde die Probe so ausgerichtet, die Längsebene parallel zum Boden der Form ist. (B) Die ausgehärtete Epoxid Block die Klebrigkeit Probe enthält. (C) Das Epoxid Block wurde in einem Schleifprobenhalter montiert, bereit zum Schleifen . (D) Die Probe wurde die Bodenoberfläche der so orientiert abgebildeten Teile der Grundgewebe enthalten die Netzhautzellschichten und Längsachse des Tack. (E) Die Probe wurde gemahlen mit Siliziumkarbid-Papier auf einem Rotationsschleifer. (F) der Block mit Toluidinblau, um die Netzhautschichten zu identifizieren gefärbt. (G) Der Block wurde in Leitungswasser gespült, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. (H) Die Toluidinblau gefärbten Netzhautschichten und Tack wurden mit einem Hochleistungs-Dissektion Umfang abgebildet. ad / 52.348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4: Hohe und niedrige Strom Bilder der Klebrigkeit und Netzhaut. An verschiedenen Stellen während des Schleifprozesses Bilder wurden mit einem Binokular aufgenommen wurde, die Längsschnitte der Tack (Sternchen) durchdringt das Auge und Verlassen der Lederhaut (&#39;S&#39; ), angrenzende Silikon (Hash) und Toluidinblau gefärbt und ungefärbt Netzhaut (&quot;R&quot;). Beachten Sie, das sind lediglich Beispiele, die vorliegende Visualisierungstechnik zu demonstrieren und sind nicht repräsentativ für alle epiretinalen Implantat oder tack Einsetzen Histologie Ergebnisse. Boden Reste der Platin Verdrahtung sind sichtbar in Platten AD (&quot;W&quot;). (A) Niedriger Stromverbrauch, ungefärbten Bild des Tack Eindringen in die Netzhaut und Lederhaut. (B) Leistungsstarke Bild der Netzhautablösung und Falten in ungefärbten Netzhaut angrenzenden an den Silikonträger Bild A. (C) Low Bildleistung in der Mitte am Bolzenschaft. <strong&gt; (D) Hohe Leistungsbild der Mitte des Tack in Bild C (E) In einer separaten Probe, ohne Silikonträger wird ein Hochleistungs-Bild der Toluidinblau gefärbten Netzhaut unter dem Tack Griff gezeigt, unmittelbar vor Schleifen der tack Welle (F) Normale Toluidinblau gefärbten Netzhaut Architektur (GCL: retinalen Ganglienzellschicht; INL: innere Körnerschicht; ONL: äußere Körnerschicht; PR: Photorezeptoren; T: Katzen Tapetum lucidum). mit dem gleichen Schleiftechnik visualisiert . Maßstabsbalken in jeder Platte sind: A und C = 2 mm; B und D = 500 um; E = 200 um; F = 100 um.

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Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Techniken für die Verarbeitung Augen mit einer Netzhautprothese für Implantierte Lokalisierte histopathologische Analyse: Teil 2 Epiretinale Implantate mit Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

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Serie: Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Forschung

Neurowissenschaften

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Techniken für die Verarbeitung Augen mit einem Netzhautprothese für lokalisierte Histopathologische Analyse Implantierte

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Medizin

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal pigmented epithelium (RPE) is a key pathobiological event in AMD. To understand the mechanisms that lead to RPE dysfunction, mouse models can be utilized by researchers. It has been established by previous studies that mice can develop RPE pathologies, some of which are observed in the eyes of individuals diagnosed with AMD. Here, we describe a phenotyping protocol to assess RPE pathologies in mice. This protocol includes the preparation and evaluation of retinal cross-sections using light microscopy and transmission electron microscopy, as well as that of RPE flat mounts by confocal microscopy. We detail the common types of murine RPE pathologies observed by these techniques and ways to quantify them through unbiased methods for statistical testing. As proof of concept, we use this RPE phenotyping protocol to quantify the RPE pathologies observed in mice overexpressing transmembrane protein 135 (Tmem135) and aged wild-type C57BL/6J mice. The main goal of this protocol is to present standard RPE phenotyping methods with unbiased quantitative assessments for scientists using mouse models of AMD.

Mouse models can be useful tools for investigating the biology of the retinal pigmented epithelium (RPE). It has been established that mice can develop an array of RPE pathologies. Here, we describe a phenotyping protocol to elucidate and quantify RPE pathologies in mice using light, transmission electron, and confocal microscopy.

Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Genetik

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

Beurteilung der Gefäß Regeneration im ZNS Verwenden der Maus Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma auslösende Verfahren in ein<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Modell und Whole-mount Retina Vorbereitung

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Biologie

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

Optimierung des Aufbaus und der Bedingungen für das Ex-vivo-Elektroretinogramm zur Untersuchung der Netzhautfunktion bei kleinen und großen Augen

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Vollkreiskauterisierung des limbalen Gefäßplexus bei chirurgisch induziertem Glaukom bei Nagetieren

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Charakterisierung einer neuartigen humanen organotypischen Netzhautkulturtechnik

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

Netzhautexplantat der adulten Mausnetzhaut als Ex-vivo-Modell zur Untersuchung neurovaskulärer Netzhauterkrankungen

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...