Dieses Protokoll zeigt die Bedingungen, die erforderlich sind, um die Netzhautfunktion in ex vivo ERG aufrechtzuerhalten, insbesondere die extrem empfindliche B-Welle, die von ON-bipolaren Zellen erzeugt wird. Mit ex vivo ERG können wir die Funktion verschiedener Arten von retinalen Neuronen mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis messen und gleichzeitig die einfache Einführung pharmakologischer Wirkstoffe ermöglichen. Diese Methode ist besonders geeignet, um die Wirksamkeit pharmakologischer Wirkstoffe auf die Netzhautfunktion und -erkrankung zu quantifizieren.
Um zu beginnen, konvertieren Sie einen Multi-Elektroden-Array-Aufbau, indem Sie den ex vivo ERG-Probenhalter über eine Kopfstufe an einen Differenzverstärker anschließen. Der Verstärker muss an den Analogeingang der Schnittstellenkarte des Multi-Elektroden-Array-Systems angeschlossen werden. Verwenden Sie die Aufzeichnungssoftware für das Multi-Elektroden-Array, um die Eingangsdaten des Ex-vivo-ERG aufzuzeichnen und zu speichern.
Stellen Sie die Verstärkung des Differenzverstärkers auf 100 ein und fügen Sie eine zusätzliche 10-fache Spannungsverstärkung hinzu, abhängig von den Spezifikationen des Digitizers. Stellen Sie den Tiefpassfilter auf 100 Hertz ein. Alternativ können Sie zum Umrüsten eines Patchklemmaufbaus den ex vivo ERG-Probenhalter über eine Kopfstufe mit einem Differenzverstärker verbinden, der mit der Kopfstufe des Patchklemmverstärkers verbunden werden muss.
Verwenden Sie die Patchklemmsystemsoftware und den Digitizer, um die Eingangsdaten des ex vivo ERG aufzuzeichnen und zu speichern. Legen Sie die Parameter wie zuvor gezeigt fest. Verbinden Sie LEDs mit den entsprechenden Wellenlängen mit dem Mikroskop.
Um Lichtreize zu steuern, verwenden Sie einen LED-Treiber, der über analoge Ausgänge eines Digitizers gesteuert wird. Steuern Sie die LEDs mit einer Aufnahmesoftware, die das Auslösen von Lichtreizen ermöglicht. Anschließend kalibrieren Sie die Lichtleistung der LEDs an der Position der Netzhaut im Probenhalter mit einer Fotodiode.
Setzen Sie bei Bedarf Neutraldichtefilter ein, um die Lichtintensität im Lichtweg zu dimmen. Um die Elektrode vorzubereiten, führen Sie eine Silber-Silberchlorid-Pelletelektrode in einen Gewindeköderanschluss ein. Füllen Sie die Innenseite des Ködersteckers mit Heißkleber und stecken Sie eine zwei Millimeter lange Buchse von der Seite ohne Gewinde in den Heißkleber.
Löten Sie einen Silberdraht der EP-1-Elektrode an die zwei Millimeter große Buchse. Schrauben Sie die fertige Elektrode mit einem O-Ring am Gewinde in die Elektrodenanschlüsse des ex vivo ERG-Probenhalters. Bei großen Augen, einschließlich menschlicher Spenderaugen, reinigen Sie die Kugel des verbleibenden Bindegewebes und entfernen Sie das vordere Segment und die Linse.
Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt etwa drei Millimeter vom Limbus zu machen. Führen Sie eine gebogene Dissektionsschere in den Schnitt ein und schneiden Sie entlang des Limbus, um den vorderen Teil des Auges mit der Linse zu entfernen. Erhalten Sie Netzhautproben für die Ex-vivo-Elektroretinographie mit einem drei bis sechs Millimeter großen Einweg-Biopsiestempel.
Um das Gewebe auf dem Probenhalter zu montieren, legen Sie die untere Hälfte des Probenhalters in eine große Petrischale und füllen Sie sie mit sauerstoffreichem Ames-Medium, so dass die Kuppel des Probenhalters gerade untergetaucht ist. Fassen Sie den Rand der Netzhaut vorsichtig mit einer feinen Pinzette an und übertragen Sie die Netzhaut auf die Kuppel des ex vivo Probenhalters, Photorezeptorseite nach oben. Heben Sie den Probenhalter von der Ames-Lösung ab und achten Sie darauf, dass die Netzhaut an Ort und Stelle bleibt.
Trocknen Sie die Platte des Probenhalters vollständig ab, um Rauschen, elektrisches Übersprechen und Signalshunting zu minimieren. Dann montieren Sie beide Hälften des Probenhalters mit vier Schrauben und verbinden Sie die Perfusionsleitung. Treiben Sie die Elektrode in der unteren Hälfte des Probenhalters an und verbinden Sie das Anodenkabel mit der inneren Netzhautseite und das Kathodenkabel mit der Photorezeptorseite.
Perfundieren Sie den Probenhalter 10 bis 20 Minuten lang mit mindestens einem Milliliter Ames-Medium pro Minute, damit sich die Lichtreaktionen stabilisieren können. Ex-vivo-ERG ermöglichte die Aufzeichnung von Photorezeptor- und ON-bipolaren Zelllichtreaktionen von der Netzhaut der Maus. Die Aufzeichnung von Photorezeptorantworten von menschlichen Spendernetzhäuten war mit einer Verzögerung der Enukleation von bis zu fünf Stunden post mortem und einer Verzögerung von weniger als 20 Minuten für ON-bipolare Zellantworten möglich.
Unter idealen Bedingungen waren Reaktionsamplituden und Kinetik in beiden Zelltypen über die Zeit relativ stabil, zeigten aber 40 bis 45 Minuten nach der Montage der Netzhaut auf dem Probenhalter einen langsamen Rückgang. Eine reduzierte Temperatur im Probenhalter verlangsamte die Kinetik sowohl der Photorezeptoren als auch der ON-Bipolarzellen erheblich. Es verringerte jedoch die Amplitude der B-Welle, aber nicht der A-Welle.
Umgekehrt reduzierte die Verlangsamung der Perfusionsrate die Amplituden sowohl der Photorezeptor- als auch der ON-bipolaren Zellantworten, beeinflusste jedoch nicht die implizite Zeit der A- oder der B-Welle. Die Unterbrechung der Perfusion für 10 Minuten, gefolgt von einer Reperfusion, führte zu einem vollständigen Verlust der ON-Bipolarzellfunktion mit erhaltenen Photorezeptorantworten. Eine ausreichende Perfusionsgeschwindigkeit und physiologische Temperatur sind entscheidend für stabile Reaktionen, insbesondere von ON-Bipolarzellen im ex vivo ERG.
Dieses Protokoll ermöglicht die eingehende Erforschung der Unterschiede in der Photorezeptorfunktion in der menschlichen Makula und Peripherie und beantwortet Fragen, die bisher nur bei nichtmenschlichen Primaten durchgeführt werden konnten.
