A. Ozcan dankt die Unterstützung der Presidential Early Career Award für Wissenschaftler und Ingenieure (PECASE), Army Research Office (ARO) Young Investigator Award, der National Science Foundation (NSF) CAREER Award, Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Award und National Institutes of Health (NIH) Director New Innovator Award DP2OD006427 aus dem Büro des Direktors, National Institutes of Health.

In diesem Abschnitt stellen wir die experimentelle Protokolle für unsere Handy-Basis Weitfeld-Mikroskopie 13 und opto-fluidischen Imaging-Zytometrie Plattform 14. Wir verwenden fluoreszierenden Perlen und fluoreszenzmarkierten weißen Blutkörperchen, diese bildgebende Plattformen testen. A. Herstellung von Cell-phone Basierend Weitwinkel-Fluoreszenzmikroskop und Optofluidikvorrichtung Imaging Durchflusszytometer Das Mobiltelefon basiert wide-field Fluoreszenzmikroskop oder Durchflusszytometer besteht aus zwei Hauptteilen: ein Kamera-Handy und ein kompaktes opto-Fluidik-Befestigung. Ein. Der Camera Phone Während die vorgestellten Techniken auf fast jedes Kamera-Handy sind, haben wir Sony Erickson Aino als Basis für diese Geräte gewählt. Diese Zelle-Telefon verfügt über ein ~ 8 MegaPixel RGB CMOS-Sensor installiert ist und eine eingebaute Linse, die eine Brennweite (f 1) von ~ 4,65 mm hat. </p&gt; 2. Optofluidikvorrichtung Aufsatz für Weitwinkel-Fluoreszenz-Mikroskopie Die optische Befestigung durch Autodesk entworfen und wird von einer Dimension Elite 3-D-Drucker mit ABSplus thermoplastischen Material gedruckt. In diesem Druckvorgang werden Modell und Trägermaterialien in einem Extrusionskopf in dem Drucker erhitzt und abgeschiedene Schicht für Schicht auf einer Modellierung Base. Wenn dieser Schritt abgeschlossen ist, kann das Trägermaterial gelöst, so dass ein robuster 3D-Modell des gewünschten Prototyps Unsere Vorsatzoptik Ausführung besteht aus LEDs (Mittenwellenlänge bei ~ 470 nm, Digikey), einen Kunststoff-Filter (# NT54-46, Edmund Optik), eine Probenschale und eine plankonvexe Linse f 2 = 15 mm (# NT45-302, Edmund Optics). Alle LEDs und Kunststoff-Filter kann leicht anhand der Fluorophore &#39;Spektren geändert werden. Die Schritte für die Montage dieses opto-fluidischen Anlage gehören: <ol><li> Legen Sie die Linse in der Anlage im Rahmen ihrer spezifischen Linsenhalter Position. </li><li> Setzen Sie die Kunststoff-Filter auf den Filter-Fach und schieben Sie sie in die Halterung, oder kleben Sie das Kunststoff-Filter vor der Handy-Kamera. </li><li> Legen Sie die LED Fach in der Anlage. </li><li> Legen Sie die Probe Glasträger in den Probenteller. Schieben Sie den Probenteller in die Anlage. Stell dich den LEDs auf die Probe. </li><li> Stecken Sie den Aufsatz auf dem Mobiltelefon, so dass die zusätzliche Linse direkt in Kontakt mit dem Mobiltelefon Kameralinse. </li><li> Verwenden Sie den Schalter auf die Befestigung auf der LEDs einzuschalten. </li><li> Bild der Probe von Interesse mit der Handy-Kamera-Einheit mit seiner &quot;Nacht-Modus&quot;. </li></ol> 3. Optofluidikvorrichtung Aufsatz für Fluorescent Imaging Cytometry Wenn es notwendig ist, große Mengen an flüssigen Proben für den Nachweis von seltenen Ereignissen screenen, könnte optofluidischer Durchflusszytometrie Vorrichtung bevorzugt sein. Wir ändern unsere wide-field Fluoreszenzmikroskop Design und wandeln es in einem Durchflusszytometer, whier ein PDMS basierten mikrofluidischen Kanal verwendet wird, kontinuierlich liefern die flüssige Probe durch das Bildgebungsvolumen. Die optische Anlage wird auch von Autodesk entwickelt und gedruckt von Dimension Elite 3-D-Drucker. Es besteht ebenfalls aus LEDs (Mittenwellenlänge bei ~ 470 nm, Digikey), einen Kunststoff-Filter (# NT54-46, Edmund Optics), einem Probenteller und einer asphärischen Linse (f = 4,5 mm) (Produkt # C230TME-A; Thorlab). Die Schritte für die Montage dieses opto-fluidischen Anlage gehören: <ol><li> Legen Sie die asphärische Linse in der Anlage. </li><li> Setzen Sie die Kunststoff-Filter auf den Filter-Fach und schieben Sie sie in die Halterung, oder kleben Sie das Kunststoff-Filter vor der Handy-Kamera-Objektiv. </li><li> Schieben Sie den mikrofluidischen Kanal in die gleiche opto-fluidischen Anlage. </li><li> Stecken Sie den Aufsatz auf dem Mobiltelefon, so dass die zusätzliche Linse direkt in Kontakt mit dem Mobiltelefon Kameralinse. </li><li> Verwenden Sie den Schalter auf die Befestigung auf der LEDs einzuschalten. </li><li> Verbinden Sie den mikrofluidischenIC-Kanal an den Spritzenpumpe und liefern die flüssige Probe in die Mikrofluidik-Vorrichtung bei einer konstanten Flußrate. </li><li> Nehmen Sie einen Film der fluoreszierenden Zellen / Partikel, die durch den mikrofluidischen Kanal mit Hilfe der Video-Modus der Handy-Kamera. </li></ol> B. Probenvorbereitung 4. Herstellung von optischen Micro-Partikel-Proben <ol><li> Fluoreszierende Kügelchen mit 10 Mikrometer Durchmesser (rot Perlen: product # F8834 Anregung / Emission 580nm/605nm; grünen Perlen: product # F8836: Anregung / Emission 505nm/515nm) von Invitrogen (Carlsbad, CA) gekauft. </li><li> Mix 10 ul des grün fluoreszierenden Kügelchen, 10 ul rot fluoreszierende Kügelchen mit 40 ul DI-Wasser. </li><li> Place10 ul dieser Wulst Mischung auf einem Glasträger unter Verwendung einer Mikropipette und setzte noch einen Glasträger auf der Oberseite davon, um eine Sandwich-Struktur zu machen. </li><li> Legen Sie diese Sandwich-Struktur in den Probenteller und schieben Sie sie in die Handy-Befestigung. </li&gt; </ol> 5. Vorbereitung von fluoreszenzmarkierten White Blood Cells <ol><li> Nehmen SYTO16 Nukleinsäure Fluoreszenzmarkierung Kit (# S7578, Life Technology) und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) aus dem Kühlschrank und bringen sie auf Raumtemperatur. </li><li> Übertragen 200 ul Vollblut aus EDTA-Blutentnahmeröhrchen bis 1,5 ml Polystyrol-Röhrchen (# 05-408-129, Fisher Scientific). </li><li> 1 ml roter Blutkörperchen Lysepuffer (# R7757, Sigma-Aldrich) zu den 200 ul Vollblut und gründlich mischen. </li><li> Nach 5 min zentrifugieren lysierten Blutprobe und entfernen Sie die überstehende Lösung. </li><li> Resuspendieren des weißen Blutkörperchen Pellet in 200 ul PBS-Puffer und vorsichtig mischen sie. </li><li> Hinzufügen 5 ul 1 mM SYTO16 Lösung des weißen Blutzellprobe. Wickeln Sie die Probe mit Aluminiumfolie und inkubieren in dunkler Umgebung für ~ 30 min. </li><li> Zentrifuge die Probe wieder. Überstand wird entfernt und die markierten Leukozyten-Pellet wird erneutIn PBS-Puffer suspendiert. </li><li> Platzieren 5-10 ul markierten Leukozyten flüssigen Probe auf ein Deckglas, und legen ein zweites Deckglas auf der Oberseite der Probe. </li><li> Legen Sie die Sandwich Probenobjektträger in den Probenteller und Bild, das sie mit dem Handy-Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> Alternativ <ol start="10"><li> Kontinuierlich liefern die fluoreszenzmarkierten weißen Blutkörperchen durch einen mikrofluidischen Kanal mit Hilfe eines automatisierten Spritzenpumpe, aber auch die Erfassung eines fluoreszierenden mikroskopischen Film der fließenden Zellen unter Verwendung des Handy-Kamera im Video-Modus. Wir sollten auch betonen, dass eine tragbare batteriebetriebene Spritzenpumpe oder sogar Schwerkraft ausgenutzt werden, um die Strömung durch den mikrofluidischen Kanal anzutreiben. </li></ol>

<ol>
	<li>Sklar, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow Cytometry for BioTechnology. , (2005).</li><li>Nunez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , (2001).</li><li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to optical microscopy. , (2010).</li><li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+deeper+than+microscopy:+the+optical+imaging+frontier+in+biology.">Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology.</a> Nature Methods. 7, 603-614 (2010).</li><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+fluorescence+nanoscopy.">Toward fluorescence nanoscopy.</a> Nature Biotechnology. 21, 1347-1355 (2003).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+structured-illumination+microscopy:+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution.">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM.</a> Nature Methods. 3, 793-796 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+near-field+microscopy+of+DNA+at+sub-10+nm+resolution.">Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution.</a> Physical Review Letters. 97, 260801 (2006).</li><li>Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+standing+wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy:+superresolution+imaging+of+single+molecular+and+biological+specimens.">Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens.</a> Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).</li><li>Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -. W., G&#246;r&#246;cs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+without+lenses:+achievements+and+remaining+challenges+of+wide-field+on-chip+microscopy.">Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy.</a> Nature Methods. 9, 889-895 (2012).</li><li>Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -. W., Tseng, D., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+and+compact+wide-field+fluorescent+imaging+on+a+cell-phone.">Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone.</a> Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).</li><li>Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optofluidic+fluorescent+imaging+cytometry+on+a+cell+phone.">Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone.</a> Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).</li><li>Suzuki, S., Abe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+Visualand+Graphics.">Computer Visualand Graphics.</a> Image Processing. 30, 32-46 (1985).</li><li>Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+enabled+detection+of+Escherichia+coli+using+a+cell-phone.">Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone.</a> Analyst. 137, 2541-2544 (2012).</li><li>Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Rapid-Diagnostic-Test+Reader+Platform+on+a+Cellphone.">Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone.</a> Lab on a Chip. 12 (15), (2012).</li><li>Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+signal+recovery+from+incomplete+and+inaccurate+measurements.">Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements.</a> Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).</li></ol>

Dr. Ozcan ist der Gründer eines Start-up-Unternehmen, die Computational Imaging und Mikroskopie Werkzeuge zu vermarkten soll.

Wir haben unsere bisherigen Ergebnisse auf Mobiltelefons basierend Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und opto-fluidische Bildgebung Durchflusszytometrie unter Verwendung leicht und kompakt opto-fluidische Anhänge auf Handy-Kameras präsentiert. Mit dieser Plattform Technologie, die wir abgebildet fluoreszierenden Objekten einschließlich Mikro-Partikel und beschriftet weißen Blutkörperchen in Vollblutproben. Daher könnte diese kompakte und kostengünstige Handy-basierte Fluoreszenz-Bildgebung Toolset nützlich sein f?...

Mikroskopie und Durchflusszytometrie sind weit Techniken 1-12 in der biomedizinischen und der wissenschaftlichen Forschung sowie der klinischen Diagnostik zum Zählen und Charakterisierung von verschiedenen Zelltypen verwendet. Allerdings sind herkömmliche Mikroskope und Durchflusszytometrie Instrumenten relativ komplex und teuer, was ihren Einsatz begrenzt, hauptsächlich etablierten zentralen Labors. Vor kurzem haben wir eine kompakte und leichte Fluoreszenz-Bildgebung Durchflusszytometrie und Mikroskopie Gerät auf einem Handy, 13,14 integriert, zeigt Versprechen entwickelt kostengünstig übersetzen Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie und verwandten Mikro-Analyse Techniken, um mit begrenzten Ressourcen Umgebungen für verschiedenen Anwendungen der Telemedizin Auswirkungen der globalen Gesundheit. In der optofluidischer Durchflusszytometrie Konfiguration (siehe z. B. Abbildung 1C und 1D), ist ein speziell angefertigten Polydimethylsiloxan (PDMS) basiert mikrofluidischen Kanal positioned vor dem Mobiltelefon Kamera-Einheit, wobei Licht emittierende Dioden-(LED) sind an den Kanten des Kanals Stumpfschweißen gekoppelt. Diese mikrofluidischen Chip zusammen mit der flüssigen Probe im Inneren bildet einen opto-fluidische planaren Wellenleiter (zusammengesetzt aus beispielsweise PDMS-Flüssig-PDMS), so dass das Anregungslicht geführt wird, gleichmäßig zu pumpen die fluoreszierend markierten Proben innerhalb des Mikrokanals. Die Fluoreszenzemission von diesen markierten Objekte, z. B. Zellen, wird ferner durch eine zusätzliche Linse direkt nach dem Mobiltelefon Kamera-Einheit platziert abgebildet wird und auf dem Mobiltelefon Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS) Bildsensor abgebildet. Da die Fluoreszenzemission senkrecht zur Anregungslichtpfad gesammelt, ist eine kostengünstige Kunststoff Absorptionsfilter ausreicht, um das gestreute Anregungslicht zu entfernen und einen angemessenen Dunkelfeld-Hintergrund für Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich sind. Mit einer ähnlichen opto-fluidischen Design, können wir auch Bild die fluoreszierenden Objekte in statIC-Modus (siehe 1A und 1B), in dem die fluoreszierenden Teilchen zwischen zwei Glasplatten eingeschlossen sind gleitet statt Durchströmen eines mikrofluidischen Kanals und der Fluoreszenzemission von dieser fluoreszierenden Teilchen durch das Mobiltelefon CMOS-Bildsensor für Partikelzählung und eingefangen Charakterisierung. Basierend auf verschiedenen Anwendungsanforderungen, Durchflusszytometrie oder Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie ausgewählt werden. Zum Beispiel könnte Mobiltelefons Durchflusszytometrie Vorrichtung besonders nützlich zum Screening großer Volumina flüssiger Proben (zB ein paar ml) für die Detektion von seltenen Zellen oder Pathogenen. In diesem Manuskript wir einige unserer jüngsten Ergebnisse auf der Integration der Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Durchflusszytometrie Tools auf einem Mobiltelefon mit kompakten und kostengünstigen opto-fluidischen Anlagen. Diese cell-phone-basierten Mikro-Analyse, Imaging-Zytometrie und Sensorik Plattformen könnten bieten verschiedene Möglichkeitenfür Telemedizin und Point-of-Care-Diagnostik, insbesondere Auswirkungen auf unseren Kampf gegen die globale gesundheitliche Herausforderungen in beschränkten Ressourcen Regionen der Welt.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-phone</td>
			<td>Sony</td>
			<td>Sony Ericsson Aino</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plano-convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td># NT45-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspherical lens</td>
			<td>Thorlab</td>
			<td># C230TME-A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>#NT54-46</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>#365-1201-ND</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Battery</td>
			<td>Digikey</td>
			<td>#P032-ND</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#05-408-129</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell lysing buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R7757</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red fluorescent beads (10 &mu;m)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#F8834</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green fluorescent beads (10 &mu;m)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#F8836</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td># S7578</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wide-field fluorescent microscopy and fluorescent imaging flow cytometry on a cell-phone

Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie sind weit Werkzeugen in der biomedizinischen Forschung und der klinischen Diagnostik eingesetzt. Allerdings sind diese Geräte sind in der Regel relativ sperrig und teuer, so dass sie weniger wirksam in den beschränkten Ressourcen-Einstellungen. Potenziell Bewältigung dieser Einschränkungen haben wir vor kurzem die Integration von Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Durchflusszytometrie Tools auf Handys gezeigt mit kompakten, leichten und kostengünstigen opto-fluidischen Anlagen. In unserem Durchflusszytometrie Design sind fluoreszenzmarkierte Zellen durch einen mikrofluidischen Kanal, der über dem bestehenden Handy-Kamera positioniert gespült wird. Batteriebetriebenen Leuchtdioden (LEDs) sind an der Seite des mikrofluidischen Chips, die effektiv wirkt als Multi-Mode-Wellenleiter, wobei das Anregungslicht geführt gleichmäßig erregen die fluoreszierenden Meßobjekten wird stumpf gekoppelt. Das Mobiltelefon Kamera ein Zeitraffer-Film der fluoreszierenden Zellen fließt durchdie mikrofluidischen Kanal, wo die digitalen Rahmen des Films verarbeitet, um die Anzahl der markierten Zellen in der Ziellösung von Interesse zählen sind. Unter Verwendung eines ähnlichen opto-fluidische Aufbau kann auch diese Bild fluoreszenzmarkierte Zellen im statischen Modus durch zB die fluoreszierenden Teilchen sandwichartig zwischen zwei Glasplatten und Erfassung ihrer fluoreszierenden Bildern unter Verwendung des Mobiltelefons Kamera, die eine räumliche Auflösung von z. B. erreichen kann ~ 10 um über einen sehr großen Feld-of-view von ~ 81 mm 2. Diese Handy-Basis Fluoreszenz-Bildgebung Durchflusszytometrie und Mikroskopie-Plattform könnte besonders in beschränkten Ressourcen-Einstellungen nützlich sein, z. B. Zählen von CD4 + T-Zellen in Richtung Überwachung von HIV + Patienten oder für die Erkennung von Wasser-borne Parasiten im Trinkwasser.

Mit unserem opto-Fluidpumpsystem / Anregungsschema (1C und 1D), können fluoreszenzmarkierte Zellen kontinuierlich in den mikrofluidischen Kanal mit einer Spritze Pumpe geliefert werden, während der Handy-Kamera ein Zeitraffer fluoreszierende mikroskopischen Film der fließenden Zellen. Diese fluoreszierenden Filme können dann rasch analysiert werden unter Verwendung Kontur-Erkennung und Tracking-Algorithmen 14,15 zur automatischen Bestimmung der absoluten Anzahl und die Di...

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Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wir überprüfen unsere jüngsten Ergebnisse auf der Integration der Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Durchflusszytometrie Tools auf einem Mobiltelefon mit kompakten und kostengünstigen opto-fluidischen Anlagen. Diese Handy-Basis Mikro-Analyse-Geräte könnte für durchflusszytometrische Analyse nützlich, wie die Ausführung verschiedener Zellzählung Aufgaben sowie für High-Throughput-Screening von z. B. Wasserproben in beschränkten Ressourcen-Einstellungen.

Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und Fluoreszenz-Imaging Durchflusszytometrie auf einem Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

wide-field-fluorescent-microscopy-fluorescent-imaging-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.5K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Wir überprüfen unsere jüngsten Ergebnisse auf der Integration der Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Durchflusszytometrie Tools auf einem Mobiltelefon mit kompakten und kostengünstigen opto-fluidischen Anlagen. Diese Handy-Basis Mikro-Analyse-Geräte könnte für durchflusszytometrische Analyse nützlich, wie die Ausführung verschiedener Zellzählung Aufgaben sowie für High-Throughput-Screening von z. B. Wasserproben in beschränkten Ressourcen-Einstellungen.

Serie: Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Forschung

Biotechnik

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

Ohne Linsen auskommt, Fluoreszenz-Mikroskopie auf einem Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Probenvorbereitung, Imaging-und Analyse-Protokolle für Knife-edge-Scanning-Mikroskopie

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome formulation, liposomes may be preferentially taken up by different cell types in the body. This may influence the efficacy of the therapeutic particle as progression of different diseases is tissue- and cell-type-specific. In this protocol, we present one method for synthesizing and fluorescently labeling liposomes using DSPC, cholesterol, and PEG-2000 DSPE and the lipid dye DiD as a fluorescent label. This protocol also presents an approach for delivering liposomes in vivo and assessing cell-specific uptake of liposomes using flow cytometry. This approach can be used to determine the types of cells that take up liposomes and quantify the distribution and proportion of liposome-uptake across cell types and tissues. While not mentioned in this protocol, additional assays such as immunofluorescence and single-cell fluorescence imaging on a cytometer will strengthen any findings or conclusions made as they permit assessment of intracellular staining. Protocols may also need to be adapted depending on the tissue(s) of interest.

The goal of this protocol is to synthesize fluorescently-labeled liposomes and use flow cytometry to identify in vivo localization of liposomes at a cellular level.

Vorbereitung, Verabreichung und Bewertung der in vivo gewebespezifischen zellulären Aufnahme von fluoreszierenden farbstoffmarkierten Liposomen

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...