Die Autoren danken Dr. Douglas Goetz (Institut für Chemische und Biomolekulare Ingenieurwissenschaften, Ohio University) und Dr. Fabian Benencia (Department of Biomedical Sciences, Ohio University) für aufschlussreiche Diskussionen und Kritik Manuskript danken. Wir danken auch Dr. Christopher Huppenbauer für hilfreiche technische Diskussionen (W. Nuhsbaum Inc.). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der National Science Foundation (CBET-1106118) und der National Institutes of Health (1R15CA161830-01) unterstützt.

1. Software-Installation <ol><li> Kaufen StreamPix 5 Multi-Kamera-Software mit SimulPix Modul oder andere Imaging-Software in der Lage, das Sammeln und Kombinieren von Bildern durch monochrome CCD-Kameras eingefangen. </li><li> Mindestanforderungen für StreamPix 5 sind: Ein PC mit Core 2 Duo ausgestattet mit 2,4 GHz oder besser mit 2 GB RAM oder höher. Ein unterstützter IEEE digitale oder analoge Kamera und kompatible Framegrabber. Windows-XP/7/Vista 32 oder 64 Bit. Ein Monitor mit Auflösung 1024 x 768 oder höher. Eine Grafikkarte mit guter 2D-Leistung (OCU auszudrücken 16x oder besser wird empfohlen) und 7200-RPM-Festplattenlaufwerk für die Aufzeichnung mit RAID-O-Konfiguration. </li></ol> 2. Installation von Dual-Kamera-System, das Zwei-Farben-Simultan-Echtzeit-Imaging <ol><li> Schließen Sie das DC2 Photometrics Emissions Splitter oder ähnliche Doppelkamera Emissionstrenneinrichtung, an das Mikroskop, indem Sie den DC2 C-Mount-Adapter in den Videoanschluss des MICROscope so dass das Gehäuse des dichroitischen auf der Vorrichtung zugänglich ist. </li><li> Legen Sie zwei monochrome CCD-Kameras in weibliche C-Mount-1 und weibliche C-Mount-2. Identische Kameras sind bevorzugt. Ähnliche Kameras verwendet werden, aber die Kompatibilität ist von internen Hardware, vor allem der CCD-Bildsensor. </li><li> Verwenden Imaging-Software, um Bilder von beiden Kameras anzuzeigen. Die folgenden Schritte (2.3.1 - 2.3.4) gelten für StreamPix 5 mit SimulPix Modul und muss für andere Multi-Kamera-Imaging-Software angepasst werden. <ol><li> Offene StreamPix 5 und wählen Sie &quot;Arbeitsplatz&quot; in der Task-Band. </li><li> Öffnen Sie &quot;Arbeitsbereich-Manager&quot; am rechten Bildschirmrand und wählen Sie &quot;neuen Arbeitsbereich&quot;. </li><li> Nach der Benennung eine Kamera, folgen Sie Software dazu aufgefordert, einen Grabber aus einem bereits besiedelten Liste auswählen. Wählen Sie den passenden Grabber das Kameramodell, und wiederholen Sie für die zweite Kamera Arbeitsbereich. Für die fusionierte Arbeitsbereich noch einmal wiederholen, aber &quot;alle Kameras im Einsatz sind&quot; Fehler message erscheint. Diese Meldung ist normal. </li><li> Sobald die fusionierte Arbeitsbereich geladen wird, weisen Kameras aus dem Arbeitsbereich 1 und 2 Arbeitsbereich zu dem neuen Arbeitsbereich in der auf der rechten Seite des Bildschirm befindet Docking Panel. </li></ol></li><li> Richten Kameras in der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem. <ol><li> Richten Kameras im Hellfeld oder Phasenkontrast mit dem Kalibrierungsgitter vom Hersteller mit einem PlanApo 40X-Objektiv (oder höher) zur Verfügung gestellt. </li><li> Senden Licht in die Mikroskop-Okulare, legen Sie die mit metallischem Überzug Kalibrierungsgitter, die vom Hersteller auf dem Mikroskoptisch zur Verfügung gestellt wurde, und die Quadratur des Rasters auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Bringen Sie das Gitter in den Fokus. </li><li> Verdrängen, aber nicht entfernen, den dichroitischen Gehäuse Kamera 1 (Bypass-Kamera) auszurichten. Zeigen Sie das Netz ohne Binning und ohne Autoskalierung. Stellen Sie das Bild mit dem Scharfstellknopf auf C-Mount-Anschluss ein. </li><li> Schieben Sie das Gehäuse in die dichroitischen Dual channel Fassungseinrichtung vollständig, so dass das Bild durch den dichroitischen beiden Kameras aufgeteilt. </li><li> Lösen Sie die drei 5/64 &quot;Stellschrauben drehen und die zweite Kamera auf der weiblichen C-Mount-2, bis die Ausrichtung des Rasters ist in beiden Bildern identisch. Mit der Fokus-Einstellung Wahl auf C-Mount-Anschluss 2, bringen das Bild von der Kamera 2 in den Fokus. </li><li> Schließen Sie die Ausrichtung mit dem kombinierten Bild in der zusammengeführten Arbeitsbereich der Bildbearbeitungssoftware. Dies erlaubt es, eine Echtzeit-Pseudoüberlagerung der beiden Bilder des Kalibrierungsgitter sehen. Anpassen der Bildpositionen kombiniert mit nur einem R / L-Knopf auf der rechten Seite des DC2. Stellen Sie diesen Regler, bis rechts / links vertikale Begrenzung der Bilder wird präzise ausgerichtet. </li><li> Verwenden Sie die U / D-Regler, um den Auf / Ab-Ausrichtung des zweiten Bildes anpassen, bis die horizontalen Gitterstäbe richtig ausgerichtet sind. </li><li> Wenn während der Auf / Ab-Ausrichtung eine leichte Drehung der Kamera auftritt, dieses Problem zu korrigieren, indem Sie die drei 5/64 &quot;Zoll Eindrehenws zur Kamera 2 und zu drehen, bis das angezeigte Bild richtig ausgerichtet ist. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Krebszellen für Parallel-Kennzeichen Flusskammer Adhäsionsassay <ol><li> Kultur BT-20-Brustkrebszellen in Minimum Essential Medium (MEM) ergänzt Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C und 5,0% CO 2, wie zuvor beschrieben 2 abzuschließen. </li><li> Ernte Krebszellen mit einer verdünnten Trypsin-Behandlung und zählen Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Wasch und Zellen zu suspendieren 10 7 Zellen / ml in 0,1% Albumin aus Rinderserum (BSA) in DPBS mit Calcium und Magnesium (DPBS +). </li><li> Verdünnte primäre Antikörper, gereinigtes Maus-anti-Mensch-CD24 und gereinigte Ratten HECA-452 (Anti-sialofucosylated Antigene), um eine vorbestimmte optimale Konzentration in 0,1% BSA-DPBS +. Zellen inkubieren 30 min 9, 10. </li><li> Centrifuge Zellen bei 1.200 min um ein Zellpellet zu erhalten. AspiRate primärer Antikörper, und waschen die Zellen zweimal mit 0,1% BSA DBPs +. </li><li> Verdünnte sekundäre Antikörper, Ziegen-Anti-Maus-IgG AlexaFluor 568 (Emissions max, 603 nm) und Ziege-anti-Ratte-IgM AlexaFluor 488 (Emissions max, 519 nm), um eine vorbestimmte optimale Konzentration in 0,1% BSA-DPBS +. Inkubieren Zellen für 30 min. </li><li> Waschen der Zellen zweimal auszusetzen 0,1% BSA in DPBS + 10 6 Zellen / ml in 0,1% BSA-DPBS +. </li></ol> 4. Herstellung von Reaktiv Substrat für Parallel-Kennzeichen Flusskammer Adhesion Assay <ol><li> Verbindung von zwei getrennten Rohrlängen zu den Einlass-und Auslassöffnungen der Parallelplattenflusskammer, die innerhalb eines 35-mm-Gewebekulturschale passt. Ein Rohr wird in das Reservoir der markierten Zellen in 0,1% BSA-DPBS + und das andere an der Spritzenpumpe, die Flüssigkeit bei einer bestimmten Strömungsgeschwindigkeit zurückzuziehen ausgesetzt verbinden. </li><li> Schließen Sie eine Vakuumleitung zur Strömungskammer ein. </li><li> Die Flusskammer Position über der 35 mm-Gewebekultur dish, das eine Monoschicht aus Ovarzellen des chinesischen Hamsters E-Selectin (CHO-E) exprimieren. CHO-E-Zellen wurden in MEM-Komplettmedium bei 37 ° C gezüchtet und 5,0% CO 2 2. </li><li> Die Durchflusskammer und / oder Strömungskammer Dichtung einen angemessenen Vakuumdichtung 1 zu gewährleisten. </li><li> Ziehen Flüssigkeit aus dem Behälter, die Überwachung der Durchflusskammer-Anordnung für die richtige Dichtung und ohne sichtbare Anzeichen von Luftblasenbildung ein. </li><li> Zeigen Flusskammer Montage auf Mikroskop (Leica DMI 6000B) ein. </li></ol> 5. Zwei-Farben-Bildaufnahme <ol><li> Strom ein Leica EL-6000 kompakte Lichtquelle, oder ein ähnliches Gerät, um Licht mit hoher Intensität und Paar es in einen Lichtleiter zu erzeugen. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, dieses Licht durch eine Kombination Filterwürfel, dh G / R (grün / rot) Filterwürfel passieren, um Fluorophore einer gewünschten Farbe / Intensität zu erregen. </li><li> Stellen Sie sicher, dichroitischen Gehäuse ist in der richtigen Arbeitsposition (depressiv) undnicht in den Bypass-Modus. </li><li> Betreiben Sie in der Fluoreszenz-Mikroskop-Modus und wählen Sie das richtige Fluoreszenzfilterwürfel (grün / rot). </li><li> Bestimmen Sie die Belichtungszeit und Gain-Kamera 1 (rot, 620 ± 60 nm) und die Kamera 2 (grün, 535 ± 40 nm). <ol><li> Drücken Sie den dichroitischen um Bilder sowohl in den roten und grünen Emissions Kanäle zu erhalten. Verwenden Sie eine Durchflusskammer-Assays mit Zellen nur mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff markiert und erhalten ein Bild in den roten Kanal, indem die Belichtungszeit der Kamera 1 in &quot;Live-Einstellungen&quot; der Imaging-Software. </li><li> Passen Sie die Belichtungszeit der Kamera 2 auf die Belichtungszeit der Kamera ein. Wenn ein Bild in den grünen Kanal beobachtet, vorliegen Durchbluten Artefakte und die Belichtungszeit in beiden Kameras verringert werden muss. </li><li> Halten der Belichtungszeitwert in der Kamera 1 und Kamera 2, die Belichtungszeit zu verringern, bis das Durchbluten Artefakt nicht mehr im grünen Kanal sichtbar. Stellen Sie die Verstärkung der Kamera ein Bild zu verbessern visibility im roten Kanal, falls erforderlich. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.4.1 - 5.4.3 mit Zellen nur mit dem grünen Fluorophor markiert, aber definieren Belichtungszeit mit der Kamera 2 Bildzellen im grünen Kanal ohne Durchbluten Artefakte im roten Kanal von Kamera 1 gesammelt. </li><li> Retitrate Antikörper, wenn Durchbluten Artefakte nicht beseitigt werden 11, oder wenn Belichtungszeiten von Kamera 1 und Kamera 2 wesentlich sind solche, die zusammengeführt Bilder können zeitlich falsch ausgerichtet sein. </li></ol></li><li> Verwenden Imaging-Software, um Bilder gleichzeitig von zwei monochrome CCD-Kameras in der Flusskammer Experiment gefangen zu sehen. </li><li> Merge Bilder von beiden Kameras mit dem SimulPix Modul StreamPix 5 oder eine alternative Software-Paket gesammelt. </li><li> Verwenden digitalen Korrekturanpassungen in SimulPix oder alternative Software, um räumlich richten Sie die zusammengeführten Bilder, falls erforderlich. Bilder können mit dem Modul SimulPix für horizontale, vertikale korrigiert werdenUnd Dreheinstellungen. </li></ol>

<ol>
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M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+(CXCL4)+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion.">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem hat die räumliche, zeitliche und optische Auflösung benötigt, um qualitativ hochwertige Bilder in Anwendungen, bei denen Zell-oder Molekularbewegung schnell ist zu erfassen. Bei der Erzeugung der repräsentative Ergebnisse, Parameter in der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, einschließlich Software-Einstellungen und Kameraeinstellungen wurden optimiert, um eine zusammengeführte Bildfolge, in der Walz-und adhärenten Zellen waren zeitlich und räumlich ausgerichtet zu erhalten. Di...

Verfahren zur Analyse von Molekülen auf der Zelloberfläche, wie z. B. Immunfärbung Sonden einzusetzen, die chemisch mit Fluorophoren konjugiert sind, was den Nachweis von Zielmolekülen. Live-Cell-Imaging-und hydrodynamischen Fluss-basierte Zelladhäsionsassays werden typischerweise mit monochromen CCD-Kameras entwickelt, um physiologische Prozesse auf zellulärer und / oder molekularer Ebene 1, 2 erfassen aufgezeichnet. Diese Kameras sind sehr empfindlich, liefern schnelle Bildraten (mehr als 30 Bilder pro Sekunde) und bieten außergewöhnliche zeitliche Auflösung (durch schnelle Bildraten und kurzen Belichtungszeiten). Allerdings kann nur Monochrom-Kameras erfassen einen einzigen Emissionskanal (Erfassung eines einzelnen Fluorophors), um Bilder zu sammeln. Einzelne Kamera Emissions Splitting-Systeme können integriert werden, um mehrere Emissionskanäle zu erfassen, aber oft reduzieren das Sichtfeld und benötigen die gleiche Belichtungszeit für die Abbildung aller Kanäle. Um das volle Farbspektrum von Zellen mit multip beschriftet erfassenle Fluorophore, eine Farbkamera kann als Alternative verwendet werden. Allerdings sind Farbkameras in der Regel nicht in der Lage, die für Live-Cell-Imaging in bestimmten Anwendungen gewünschten zeitlichen Auflösung. Eine weitere bildgebende Gerät ist für Anwendungen, bei denen es vorteilhaft ist, Bild lebenden Zellen bei mehreren Wellenlängen ist, unter Beibehaltung einer hohen zeitlichen Auflösung benötigt. Ein Hauptanwendungsgebiet ist die experimentelle Parallelplattenflusskammer Adhäsionstest, in denen Zellen in physiologisch relevanten Bedingungen über einen potentiell reaktive Substrat 1, 3 perfundiert. Zellen, die in Strömungs spezifische Zelloberflächenmoleküle exprimieren, haften und rollen auf dem Substrat, beispielsweise eine Zell-Monoschicht exprimieren Adhäsionsmoleküle oder Oberfläche adsorbiert extrazelluläre Matrixproteine, 4, 5. Rollzellen können Rotations-und Translationsbewegung in Bruchteilen einer Sekunde durchlaufen. Molekularen Eigenschaften auf Walzen und adhärente Zellen, wie Cluster von Zelloberflächenmolekülen, auch die Potentiometeral aktive Reorganisation auf der Zelloberfläche zu unterziehen. Somit muß Abbildungssysteme eine außergewöhnliche zeitliche Auflösung liefern (30 Frames pro Sekunde oder mehr und &quot;nahe Null&quot; Belichtungszeiten), um eine Bildfolge, die die Schritt-für-Schritt-Fortschreiten der Zelle Walzen 6, 7 veranschaulicht zu erzeugen. Dual-Kamera-Emissionsspaltsysteme sind in der Lage, diese Anforderungen zu erfüllen für die Bildgebung von Zellen mit mehreren Fluorophoren markiert. Dual-Kamera-Emissionsspaltsysteme aufgeteilt und Filterfluoreszenzkanäle in zwei ähnliche Kameras erfassen gleichzeitig zwei räumlich identisch, aber Fluorophor spezifische Bilder unter Beibehaltung der vollen Sichtfeld. Diese Technologie ermöglicht den direkten Vergleich der in Echtzeit in jedem Kanal aufgenommene Bild und ermöglicht dem Benutzer, schnell zwischen Kamera-Modelle wechseln mit verschiedenen Imaging-Funktionen. Diese Funktion ist nützlich, um Einstellungen für Bild-Capture-Einstellungen in eine Kamera, die besser damit das System zu erfassenFluorophore mit unterschiedlichen Intensitäten, Gültigkeitsdauer und Extinktionskoeffizienten 8. Gekoppelt mit Imaging-Software, Dual-Kamera-Emissionsspalt Systeme ermöglichen die Echtzeit-Aufzeichnung von Live-Cell-Imaging-Tests in mehreren Wellenlängen und kann in vitro-Assays, die Fluoreszenz zu verwenden, um das Verhalten der Zelle untersuchen zu verbessern.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

Multi-Color-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, um bestimmte Moleküle in der Zellmembran erkennen kann, mit Parallelplattenlaufkammer Assays zu Mechanismen, die Zell-Adhäsion unter dynamischen Strömungsbedingungen zu untersuchen gekoppelt werden. Beispielsweise können Krebszellen mit mehreren Fluorophoren über eine möglicherweise reaktive Substrat zu modellieren Mechanismen der Krebsmetastasierung perfundiert werden. Allerdings, Multi-Channel einzelnen Kamera-Systeme und Farbkameras zeigen Mängel in der Bildaufnahme für die Echtzeit-Live-Zellanalyse. Um diese Einschränkungen zu überwinden, eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem verwendeten wir gleichzeitig erfassen Echtzeit-Bildsequenzen von fluoreszenzmarkierten Zellen in der Flusskammer. Dual-Kamera-Systeme Emissionsspaltfilter definierten Wellenlängenbereichen in zwei monochrome CCD-Kameras, wodurch gleichzeitig erfassen zwei räumlich identisch, aber Fluorophor-spezifische Bilder. Anschließend werden psuedocolored Ein-Kanal-Bilder in einer einzigen kombiniertenEchtzeit-Sequenz zusammengeführt, die mehrere Zielmoleküle auf Zellen, die sich schnell über einen Bereich von Interesse offenbaren kann.

Eine Parallelplattenlaufkammer Haftung Assay wurde verwendet, um eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, die gleichzeitig in zwei Emissionskanäle erfasst Echtzeit-Bildsequenzen (Abbildung 1) zu demonstrieren. Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem erkannt BT-20-Zellen, die mit Fluoreszenz-Anti-Human-CD24 und HECA-452 (Erkennung sialofucosylated Antigene) monoklonale Antikörper und entsprechenden Sekundärantikörper (Abbildung 2) markiert waren. Einige Roll Zellen angezeigt rote Signale ...

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Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Dual-Kamera-Emissionsspaltanlagen für zwei-Farben-Fluoreszenz-Mikroskopie erzeugen Echtzeit-Bildsequenzen mit außergewöhnlichen optischen und zeitlichen Auflösung, einem Bedarf von lebenden Zellassays einschließlich Parallelplattenlaufkammer Adhäsions-Assays. Als Software wird verwendet, um Bilder von gleichzeitig erworben Emissionskanäle verschmelzen, pseudocolored Bildsequenzen produziert.

Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Aufrufe.  Ohio University.  Dual-Kamera-Emissionsspaltanlagen für zwei-Farben-Fluoreszenz-Mikroskopie erzeugen Echtzeit-Bildsequenzen mit außergewöhnlichen optischen und zeitlichen Auflösung, einem Bedarf von lebenden Zellassays einschließlich Parallelplattenlaufkammer Adhäsions-Assays. Als Software wird verwendet, um Bilder von gleichzeitig erworben Emissionskanäle verschmelzen, pseudocolored Bildsequenzen produziert. 

Serie: Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Studium der Zellmigration in Microfabricated Kanäle

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Echtzeit-Überwachung von intrazellulären Gallensäure Dynamics Mit Hilfe eines genetisch kodierte FRET-Gallensäure-Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

Hand-Held klinische photoakustische Imaging-System für Echtzeit-nicht-invasive kleine Tier Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Mikroskopie zur Echtzeitbestimmung der einzelzelligen Morphologie in Bioprozessen

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). Electrochemically reduced graphene oxide acts as the conducting layer and polyaniline acts as a pH-sensitive layer. The pH-dependent conductivity of polyaniline occurs by doping of holes during protonation and by the dedoping of holes during deprotonation. We found that an ERGO-PA solid-state electrode was not functional as such in fermentation processes. The electrochemically active species that the bacteria produce during the fermentation process interfere with the electrode response. We successfully applied Nafion as a proton-conducting layer over ERGO-PA. The Nafion-coated electrodes (ERGO-PA-NA) show a good sensitivity of 1.71 &#937;/pH (pH 4 - 9) for chemiresistive sensor measurements. We tested the ERGO-PA-NA electrode in real-time in the fermentation of Lactococcus lactis. During the growth of L. lactis, the pH of the medium changed from pH 7.2 to pH 4.8 and the resistance of the ERGO-PA-NA solid-state electrode changed from 294.5 &#937; to 288.6 &#937; (5.9 &#937; per 2.4 pH unit). The pH response of the ERGO-PA-NA electrode compared with the response of a conventional glass-based pH electrode shows that reference-less solid-state microsensor arrays operate successfully in a microbiological fermentation.

Here, we report the protocol for the fabrication of a Nafion-coated, polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide chemiresistive micro pH sensor. This chemiresistor-based, solid-state micro pH sensor can detect pH changes in real-time during a Lactococcus lactis fermentation process.

Herstellung von Nafion-beschichtet, reduziert Graphene Oxid/Polyaniline Chemiresistive Sensor Monitor pH in Echtzeit während der mikrobiellen Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...