Name: workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse CRUK 15.043 und 14.251 CRUK unterstützt. Wir danken Daniel Wetterskog und Ka Kei Ho für die technische Unterstützung und die kritische Durchsicht des Manuskripts.

1. Experimentelle Störungs und Zellmarkierung für Response-Marker (Rückwärts Transfektion siRNA-Bildschirm) <ol><li> In einer sterilen Gewebekultur Haube Pipette 70 ul von 200 nM siRNA in 1x siRNA Puffer in Vertiefungen einer sterilen, plain Platte mit 96 Vertiefungen. Verdünne Transfektion Lipids in 40 Volumina serumfreies DMEM-Medium und abzug 105 ul in jede Vertiefung, die siRNA. HINWEIS: Die Verdünnung 262,5 ul Lipids in 10,5 ml serumfreies DMEM ergibt einen Mastermix für eine ganze Platte mit 96 Vertiefungen von siRNA und liefert 2,6 &amp; mgr; l Lipid pro Vertiefung. Die Verwendung von 200 nM siRNA Ausgangskonzentration in diesem Schritt eine Arbeitskonzentration von 20 nM in Schritt 1.3 zu liefern, aber Verfahren für Arbeitskonzentrationen bis 5 nM, mit der Ausgangskonzentration entsprechend angepasst (dh 50 nM) zu arbeiten. Niedrigere Arbeitskonzentration kann Off-Target falsch positive Werte zu reduzieren, obwohl sie die Größe des auf dem Zielantwort zu reduzieren, was zu der auf dem targe erhöhent der falsch negativen Ergebnisse. </li><li> Mischen Sie die Platte durch sanfte Vibrationen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Eine Unterteilung der erhaltenen 175 &amp; mgr; l in drei 50 ul Wiederholungen pro Target auf einem undurchsichtigen, Gewebekultur-behandelten 96-Well-Platte mit durchsichtigem Boden. </li><li> Reverse transfizieren durch Dispensieren 8000 Zellen pro Vertiefung in 150 ul DMEM 10% Serum enthält, direkt auf die 50 &amp; mgr; l Lipid-siRNA-Komplexe. Verwenden HCT116 Dickdarmkrebs-Zellen, die ein GFP-markierten Marker Berichterstattung CDK2 Aktivität 5,8. Kein weiteres Mischen erforderlich. Verschließen Sie die Platte mit einer sterilen, Kleber, atmungsaktive Membran, um Feuchtigkeit zu kontrollieren und Teller &quot;Kanteneffekte&quot; zu vermeiden und legen Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden. </li><li> Saugen Sie die Medien, so dass eine geringe Restmenge an Medien in den Vertiefungen bleibt. Befestigen Sie die Zellen durch Zugabe von 100 ul 4% gepuffertem Formaldehyd in jede Vertiefung und inkubieren in einer Abzugshaube für 10 Minuten bei Raum temperatur. </li><li> Entfernen Sie die Befestigungslösung durch Absaugen der Platte. An diesem Punkt beendet wird der Versuch durch Waschen der Platte dreimal mit 100 &amp; mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und dann abgedichtet zu speichern, unter 100 &amp; mgr; l PBS in der Dunkelheit bei 4 ° C für bis zu einer Woche, oder gehen mit dem Permeabilisierung der Zellen. HINWEIS: Wir empfehlen die Verarbeitung Platten so schnell wie möglich nach der Fixierung und in der Regel bevorzugen die Lagerung von vollständig bearbeiteten Platten. Biozide Konservierungsmittel, wie Thimerosal, Natriumazid, oder kommerzielle Alternativen können hinzugefügt werden, um micoroganismal Wachstum zu verhindern. Zugabe von Phosphataseinhibitoren hilft, Phospho-Epitope zu erhalten, und andere Mittel, um die Proteinmodifikationszustände zu bewahren kann nützlich in relevanten Assay Kontexten </li><li> Entfernen PBS von der Platte und Permeabilisierung der Zellen durch Zugabe von 100 ul Permeabilisierung Lösung. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Saugen Sie das Permeabilisierung Lösung unter Verwendung einer MultiCHannel Pipette. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. </li><li> Blockieren die Zellen durch Zugabe von 100 ul Blocklösung pro Well für 30 min bei Raumtemperatur. Nehmen Sie den Block-Lösung durch Absaugen der Platte, dann mit 50 ul anti P-S780 RB1 Antikörper verdünnt 500fach im Block-Lösung für 2 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur zu untersuchen. </li><li> Dreimal waschen Sie die Platte mit 100 ul Waschlösung Platte, so dass die Lösung auf der Platte für jeweils 5 min. Sonde die Platte über Nacht im Dunkeln bei 4 ° C mit 50 ul fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper verdünnt 1000fach in Blocklösung mit 2 uM des Chromatins spezifischen DNA-Farbstoff Bisbenzimid ergänzt. Dreimal Vertiefungen wie zuvor und abgedichteten Speicher unter 100 ul PBS in der Dunkelheit bei 4 ° C. Bild die Platte innerhalb von zwei Wochen. </li></ol> 2. Bildgebung und Bildsegmentierung <ol><li> Verwenden Sie eine konfokale oder Spinnplattenfluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv getrennte nehmen 16-Bit, Graustufen- TIFF-Bildern in drei Kanäle, die der DNA-Farbstoff, GFP und Immunofärbung Fluorophore. Erfassen viele nicht-überlappende Bildsätze, die hier als Rahmen, um Bild etwa 1.000-2.000 Zellen pro Vertiefung. </li><li> Nennen Sie die Bilddateien systematisch, so dass jeder Dateiname ist eine einzigartige Kombination von &quot;Experiment Name&quot;, &quot;gut-Adresse&quot;, &quot;Bildnummer&quot; und &quot;Kanalkennung&quot;, in dieser Reihenfolge (Abbildung 3). Das Beispiel-Datensatz verwendet &quot;Blue&quot; (Chromatin-DNA-Färbung) oder &quot;Green&quot; (GFP) oder &quot;Red&quot; (die immungefärbten Fluorophor) als Kanalkennungen. Die gut Adresse, Rahmennummer und Kanalkennung sind weiter als die Bild-Metadaten bezeichnet. Verwenden Sie den Unterstrich zu verwirrend gut und Rahmen Metadaten zu vermeiden. </li><li> Benennen Sie die Dateien mit den Metadaten-Elemente in der angegebenen Reihenfolge. Dies ist notwendig, um sicherzustellen, dass die nachfolgende Softwareschritte Correctly Gruppe Gruppen von Bildern für die Analyse. </li><li> Downloaden und installieren Sie die Freeware-Zell Profiler, Aktive Perl Community Edition, R statistischen Programmierumgebung und RStudio. Akzeptieren Sie alle Standardoptionen bei der Installation; PC-Nutzer Installation von Active Perl sollte alle Möglichkeiten zu PATH, Dateierweiterung Verein und Skriptzuordnung in dem dazu aufgefordert werden können. Aktive Perl ist optional für Mac-Benutzer, aber sie werden sonst müssen Sie die Perl-Skript in Schritt 3.2 vom Terminal-Befehlszeile anstatt Symbol Klick ausführen. </li><li> Öffnen Sie die Zelle Profiler-Software, klicken Sie auf &quot;Datei&quot;, &quot;Import-Pipeline&quot; und dann &quot;Aus Datei&quot; und wählen Sie die Datei 3_channels_pipeline.cppipe (Abbildungen S1A und S1B). Die Datei enthält Anweisungen für die Software-Image-Datei-Metadaten aus dem beschriebenen Dateinamenskonvention interpretieren notwendig. Zell Profiler bezieht nun die Bilder, extrahiert Kern-DNA und Antikörper Intensitäten von thESE und verwendet den GFP-Kanal, um das Verhältnis von Kerngegen Cytoplasma Intensität für jede Zelle zu berechnen erfasst (Abbildungen 4 und 5). </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Ansicht Ausgabeeinstellungen&quot; in der linken unteren Ecke des Zell Profiler-Fenster. An der Spitze der neuen Bildschirm sind Textfelder &quot;Standardeingabeordner&quot; und &quot;Standard-Ausgabeordner &#39;beschriftet. Einer nach dem anderen finden Sie in den Ordner-Symbole auf der rechten Seite dieser Boxen und wählen Sie den Speicherort der Bilddateien für die Analyse und das Ziel für die extrahierten Daten, bzw. (Abbildung S1C). </li><li> Beginnen Sie mit der Bildanalyse, indem Sie die Schaltfläche &quot;Analysieren Images&quot; in der linken unteren Ecke des Zell Profiler. Am unteren Rand des Bildschirms beachten Sie die verbleibende Zeit für die Datenextraktion, der &#39;Stop Analysis &quot;und&quot; Pause &quot;Buttons. Bei Bedarf unterbrechen die Analyse, indem Sie die &quot;Pause&quot; -Taste jederzeit, was nützlich ist,wenn gerade die Bilder analysiert (in Schritt 2.8 beschrieben). </li><li> Optional können die Fenster für eine der Bildanalyseschritte, indem Sie auf die Augensymbole in der Platte auf der äußersten linken Rand des Programmfensters (Abbildung S1D). Das Fenster &quot;IdentifyPrimaryObjects&quot; und solche für &quot;Secondary&quot; und &quot;Tertiäre Objects beachten, um zu prüfen, dass die aktuellen Einstellungen in Cell Profiler ausführen Bildsegmentierung eignen (siehe Abbildung 1 und Diskussion für die Beratung über eine Veränderung dieser Einstellungen). </li><li> Klicken Sie auf &quot;OK&quot; im Meldungsfeld, wenn die Analyse abgeschlossen ist erscheint. Gehen Sie zu der Position &#39;Default Output Folder &quot;, in der alle Dateien mit den Ergebnissen werden als durch Kommata getrennte-Wert (CSV) Dateien (Abbildung S2A) gespeichert. </li></ol> 3. Datenextraktion <ol><li> Finden Sie die neue Datei &quot;Nuclei.csv&quot;, die nur einige der Highlights istAusgabe von Zell Profiler. Diese Datei enthält einzelne Zelldaten für fluoreszierende Antikörper Kernstärke, Kern-DNA Intensität und GFP-Reporter CDK2 Verhältniswerte (6A &amp; S2A). HINWEIS: Verschiedene Laboratorien werden, diese Art von Daten zu verarbeiten, um die Art der eigenen Assays angepasst werden soll. Für die aktuelle Daten empfohlenes ist die Verknüpfung der Zellen aus jeder Behandlungszustand nach den Antikörperdaten und die GFP-Reporter CDK2 Werte mit dem mitgelieferten Perl-Skript &quot;2_gate_classifier.pl &#39;. </li><li> Kopieren Sie die bereitgestellten Perl-Script-Datei &quot;2_gate_classifier.pl&quot; in denselben Ordner wie die &quot;Nuclei.csv &#39;Datendatei (Abbildung S2A). Doppelklicken Sie auf das Symbol für das Perl-Skript und, wenn Sie gefragt werden, geben Sie den vollständigen Namen der Datendatei gefolgt von einem &#39;.csv&#39; Dateiname Namen für die Datei, in der die Zellen ausgeblendet werden und schließlich die Gate Werte für die Antikörper sindFluoreszenz und GFP-CDK2 Reporter Daten. HINWEIS: Wie Sie in erster Linie festzustellen, Gate-Einstellungen und wenden diese zur Analyse der Daten sind unten in der Vertreter Abschnitt Daten und 6 diskutiert (um die Daten zur Verfügung gestellt Verwendung &quot;0.004&quot; und &quot;1,5&quot; bzw. zu analysieren). Mac-Anwender sollten das Perl-Skript aus der Terminal-Befehlszeile durch Eingabe ausführen: &quot;perl 2_gate_classifier.pl &#39;. </li><li> Achten Sie auf die neu erstellte Datei, die die rohen Einzelzellentestwerte von den ursprünglichen Zell Profiler Daten mit Subpopulation Etiketten, die, wie jede Zelle aus jeder Vertiefung führt gegen beide Tore (6C) zeigen, kombiniert. </li><li> Zeichnen Sie die Daten für jede Versuchsbedingung mit den einzelnen Zell-Subpopulation Etiketten durch Öffnen des RStudio Software. Klicken Sie auf &quot;Datei&quot; und &quot;Datei öffnen&quot;, wählen Sie die Datei &#39;versehen analysis.r&#39;. Beachten Sie die Befehle an den 6B plotten, <strong&gt; 7 und 8 in der oberen linken Fenster RStudio (Abbildung S2B). In der oberen linken Fenster, zwischen den Anführungszeichen Symbole in den Zeilen 5 und 6, geben Sie den Computeradresse des Ordners mit den gated Daten. Fügen Sie den Laufwerksbuchstaben und den Namen der Datei selbst, bzw. (zB &quot;C: / Ordner Analyse / Analyse-Ausgang&quot; und &quot;nuclei_gated.csv&quot;). HINWEIS: Wenn RStudio wird zum ersten Mal auf einem Computer verwendet wird, wird die R-Grafikpaket &quot;ggplot2&quot; müssen zuerst installiert werden. Dies ist ein nur einmal Schritt für eine neue Installation von RStudio, nach dem dieser Schritt überflüssig. Um &#39;ggplot2&#39; zu installieren, klicken Sie auf die Registerkarte namens &quot;Packages&quot; über dem Fenster in der unteren rechten Ecke des RStudio, klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Install Packages&quot;, die sich unter diesem geöffnet. Ein neues Fenster wird angezeigt. Type &#39;ggplot2 &quot;(Verzicht auf Zitate) in die&#39; Packages &#39;sTempo in diesem neuen Fenster ein und klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Installieren&quot;, um das Fenster zu schließen, installieren Sie die erforderlichen ggplot2 Funktionen und zum Haupt RStudio Fenster von Schritt 3.6 fort. </li><li> Markieren Sie die Zeilen 1 bis 17 in der oberen linken Fenster des RStudio, dann auf die Schaltfläche &quot;Ausführen&quot;. Dadurch werden die experimentellen Daten, Grenzwerte und auch Ortsangaben in R (Abbildung S2C) eingeben. R wird nun vorübergehend die relevanten Daten für das Plotten zu halten. </li><li> Markieren Sie einzelne Blöcke des verbleibenden kode Zeile 17, und erstellen Sie die entsprechenden Grundstücke, indem Sie auf &quot;Ausführen&quot; Taste wie zuvor. Beachten Sie die Grundstücke in das Fenster in der unteren rechten Ecke des RStudio und speichern Reihe von Formaten, indem Sie auf die Schaltfläche &#39;Export&#39; (Abbildung S2D). </li><li> Beim Schließen RStudio, klicken Sie auf &quot;Nicht speichern&quot;, wenn Sie dazu aufgefordert. Dies verhindert Verwechslungen bei der nächsten Verwendung RStudio, die sonst Daten enthalten wirdder vorherigen Sitzung. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Die beschriebene Arbeitsablauf stellt ein Verfahren für die Multiwell perturbance von Zellen mit siRNA, nachfolgenden Marker Erkennung und schließlich nutzen eine Reihe von softwaregestützten Schritte zur Gewinnung von quantitativen Daten aus den resultierenden Fluoreszenzmikroskopiebilder zu erleichtern. Der Ansatz beruht auf der Lieferung von nuklearen und zytoplasmatischen Intensitätswerte für einzelne Zellen, die breite praktische Anwendung in vielen zellbasierten Anwendungen hat konzentriert. Die Beispieldaten verwendet, hier in einer siRNA Bildschirmeinstellung, in der zwei fluoreszierende Assays für G1-Phase des Zellzyklus Transit getestet und zurück zu einer direkteren biophysikalischen Messung der Zellkern-DNA-Gehalt korreliert erzeugt. Die Verwendung eines fluoreszierenden DNA-Farbstoff, um Bild nukleäre DNA ist ein unverzichtbarer Schritt in der Bildsegmentierungsprozess, da es erlaubt die Identifizierung von individuellen Zellen, und die resultierende &quot;Nuclei Maske &#39;dient als Ausgangspunkt für die entsprechende cytoplasmi identifizierenc Regionen. Die GFP-markierten Reporter CDK2, die stabil in den Zellen exprimiert wird, gibt eine variable noch durchweg höher als Hintergrundsignals in das Zytoplasma durch die diese Kammer kann abgegrenzt werden. Die gleiche Analyse Leitung sollte für die Analyse von Protein Translokationsereignisse Verwendung anderer geeigneter Fluoreszenz-Reportern verbunden und ihre Reaktion auf perturbance sein. Auch Austausch des GFP-Reporter mit CDK2 Cytoplasma-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen erlauben würde die alternative Verwendung dieses Algorithmus, um die Abmessungen des Cytoplasmas und der relativen Größe der Zellen in den Bildern zu messen. Eine weitere Designüberlegung bei der hier beschriebenen Bildsegmentierungsstrategie ist die Verwendung von Zell Profiler integrierte Intensitätswerte für die Quantifizierung der DNA zu liefern. Integration der Intensitätswerte für die Kern-DNA-Färbung Daten ermöglichen mögliche Variationen in Kerngröße und stellt eine gute Übereinstimmung für die Quantifizierung Profile gesehenfür Propidiumiodid gefärbten FACS-Daten. Jedoch können integrierte Intensität nicht liefern ein geeignetes Mittel, um die Proteinfunktion zu kontrollieren, wo mittlere Konzentration von Durchschnittsintensität von Antigen Fluoreszenz exemplifiziert ist biologisch relevant als die integrierte Gesamtmenge an Protein (und assoziierten Fluoreszenz) in einem Zellkompartiment. Daher mittlere Intensität Werte wurden für die P-S780 RB1 und GFP-Daten verwendet. Die Option, zwischen den beiden Modi (Mittelwert oder integrierten) der Datenauswertung auf dem Panel des Zell Profiler Software &#39;ExportToSpreadsheet&#39; gefunden zu ändern. Die Analyse Einstellungen im 3_channels_pipeline.cppipe Datei für die Bilder in dem Beispiel Datensatz optimiert. Die Analyse der neuen Bilder-Sets mit diesem Protokoll wird verlangen, dass die Dateinamen übernehmen die oben beschriebene Namenskonvention (Abbildung 3). Auch Werte Empfindlichkeit um die Helligkeit des Zellkern-DNA-Färbung und Schwellenwerte für den Hintergrund anzupassenIntensitäten in den neuen Bildsätze können müssen innerhalb der Zelle Profiler-Einstellungen angepasst werden. Angesichts der Schlüsselrolle der DNA-Färbung hält für den Bau der verschiedenen Bildsegmentierung Masken, ist die Anwendung der richtigen Empfindlichkeitseinstellungen für diesen Kanal Schlüssel für die erfolgreiche Analyse der neuen Bilddaten mit der Zell Profiler Software. Die zur Verfügung gestellten Zell Profiler Einstellungsdatei (3_channels_pipeline.cppipe) enthält Hinweise auf die am häufigsten nützliche Parameter zur Anpassung der Analyse neuer Daten. Diese Hinweise sind in das Textfeld am oberen Rand des Bildschirms in der Zelle Profiler Hauptfenster und sind Leitlinien für die Änderung der Empfindlichkeitseinstellungen und Einstellung die Anzahl der Kanäle untersucht werden. Wie in Abschnitt 2.8-Protokoll, um die Einstellungen für neue Bilddaten zu testen angeklagt kann es notwendig sein, um die Bildsegmentierung während der Bildanalyse, indem Sie auf die offene &quot;Auge&quot; Symbole für jeden der zu beobachten &quot;Identifizieren ... Objekte&quot; Protokollschritte (Abbildung S1D </strong&gt;). Insbesondere wird die Visualisierung der Bilddaten durch &quot;IdentifyPrimaryOjects &#39;zeigen, wenn die Kerne Maske korrekt aus Bildern der DNA-Färbung identifiziert. Auf der Zell Profiler Software Seite für die &#39;IdentifyPrimaryOjects&#39; Modul ist der Schwellenwert-Korrekturfaktor. Versuch und Irrtum Einstellung dieses Wertes werden die meisten Kernerkennungsfehler zu beheben. Die Werte Gleichgewicht der DNA Kanal gegen die Hintergrundintensität für jedes Bild. Threshold Korrekturfaktor Werte Scharnier um 1, wobei mehr als dieses ist strenger (gut für klare Bilder) und weniger als 1 ist nachsichtig (um Bilder geeignet mit weniger Kontrast zwischen Färbung und Hintergrund). Das rohe Ausgabe einzelner Zellendaten aus Zell Profiler kann in unterschiedlicher Weise auf die Bedürfnisse der anderen Studien entsprechen analysiert werden. Hier dargestellt ist der Einsatz von einem Perl-Skript zu Toren, zwei der gemessenen Parameter pro Zelle, um das Extrahieren biologische Trends aus der Daten ein, um assistd Genehmigung Querverweise der identifizierten Untergruppen mit zusätzlichen Messungen. Zwar ist es auch möglich, Elemente der Anschnitt im Rahmen der Zell Profiler umfassen, die alternative Route verwendet hier eine größere Flexibilität und Geschwindigkeit, insbesondere wenn große Datenmengen zu beurteilen sein. Der langsamste Stufe in den post-Bildaufnahme Phasen des derzeitigen Protokolls ist der Betrieb des Zell Profiler Software. Zell Profiler hier wird ohne dass Tore, ein un-gated Rohdatensatz, die schneller mit der anschließenden Perl-Skript erneut analysiert werden können, erzeugen mit unterschiedlichen Gate-Werten führen und, wenn nötig, iterativ. Nicht alle Studien werden im Voraus wissen, die geeignet Tor Werte, da dies mit Reagenzien, an einem bestimmten Satz von Daten unterscheiden und möglicherweise im Laufe der Zeit. Es wird daher empfohlen, Histogramme Darstellung der Rohdaten Verteilung von Zell Profiler für positive Kontrollen und Mock-gestörten Zellen, um erhalten zu generieren, um geeignete Gate wertvolle identifizierenes für die Parameter von Interesse. Die Perl-Script geschrieben, um einen fest definierten Spaltenstruktur von Daten aus Zell Profiler akzeptieren und kann nicht mehr funktionieren, wenn ein Benutzer die Anzahl der Parameter Ausgabe von Cell Profiler mit den Einstellungen des &quot;ExportToSpreadsheet &#39;modifiziert. Als Beitrag zur Umsetzung Änderung der Einstellungen Noten innerhalb der Perl-Skript-Dateien enthalten. Um zu sehen, diese sehen können Sie das Skript in einem Texteditor, vorzugsweise Texteditor für Programmierer, um Farbcode Perl-Elemente gesetzt (zB http://www.activestate.com/komodo-edit). Diese Hinweise zeigen an, wo das Skript anpassen, um auf Änderungen im Datenformat anpassen. Ähnlich wie bei den Perl-Skripte, die R-Code-Datei zur Verfügung gestellt (analysis.r), enthält die Anweisungen für die Darstellung der Zahlen aus der Bildanalyse-Daten können in einem Texteditor oder RStudio Software gelesen werden, um zusätzliche Hinweise zur Verwendung und Anpassung zu sehen. Diese Notizen können mit Details zu regulären Ausdrücken und Perl &lt;ergänzensup&gt; 12 und die ggplot2 13 Paket für R, die beide bilden die Grundlage dafür, wie die Daten gelesen werden, kommentiert und aufgetragen sind. Neue Studien unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie sowie Rohdaten mit Open-Source-Publikationen hinterlegt sind zugänglich für Analysemethoden, wie sie hier beschrieben. Das Wesen der High-Content-Daten eignet sich für rekursive Analyse mit verschiedenen analytischen Schwerpunkte je nach Forschungsinteresse eines jeden Betrachters. Obwohl die Fragen, die von den Daten gefragt werden können, sind von den Sonden ursprünglich beschränkt Bilddaten können oft sinn über den Rahmen von Studien, die sie erzeugt, erneut analysiert werden.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Verwendung der frei verfügbaren Software-Zelle Profiler Algorithmus geführte Abbau von Fluoreszenzmikroskopische Bilder von anhaftenden Zellen, einzelne Zellen und definiert subzellulären Regionen zu identifizieren durchzuführen. Dieser Ansatz, der als Bildaufteilung bezeichnet, erlaubt die anschließende Mehrparameter-Analyse der abgebildeten Zellen durch Quantifizierung fluoreszenzmarkierten Markern in jede Zelle oder subzellulären Bereich (bezeichnet als segmentierten Objekten) lokalisiert. Dieser Workflow stellt eine Grundlage für ermöglicht High-Content-Analyse und soll als Werkzeug, das weiter ausgebaut werden kann und geändert werden, um Multi-parametrischen anpassen, einzelne Zellanalysen im Labor, ohne Zugang zu spezialisierten High-Content-Instrumenten oder proprietäre Software dienen. Die mit diesem Manuskript geliefert Dateien enthalten ein Testset relevanter Rohbilddaten, Algorithmus-Einstellungen und die Unterstützung Skripte, um die beschriebene Analyse zu generieren. Die zur Verfügung gestellten Algorithmus Einstellungen foder Zell Profiler sind für die Beispieldatensatz und der Diskussion Abschnitt Details, welche Anpassungen notwendig sein, um den Einsatz von Bilddaten aus anderen Studien ermöglichen optimiert. Sobald quantitativen Daten wurde mit Zell Profiler extrahiert, kann verschiedenen Labors unterschiedliche Anforderungen an, wie man das von den einzelnen Zellwerten im Rohdaten dargebotener Informationen haben; hier dargestellt ist ein Ansatz, mit dem Gatter werden auf die Rohdaten für jeden Assay verwendet. Verwendung dieser Gatter werden die Daten in binäre Bezug Reaktion umgewandelt, so dass die Visualisierung des Trends Verknüpfung verschiedener Behandlungen mit den Subpopulationen von Zellen, die eine Antwort durch den Gates definiert. Die Tore sind auf Beobachtungen der für die entsprechende negative und positive Kontrollen erhalten für jeden relevanten Messdaten Verteilungen eingestellt. Die Verwendung von Toren ist nur ein Beispiel dafür, wie man die rohe, zellbasierten Messungen fort. Auch hier dargestellt ist die Verwendung von Kern-DNA Intensität michasurements in ihrer Rohform als kontinuierlicher Wertebereich in Kombination mit den gated Daten. Andere Ansätze zur Verwaltung von Bildanalysedaten in Betracht gezogen werden, je nach der Art der Studie; statistische Alternativen zur Verwendung von Toren für die Zuordnung von Zellen, um Subpopulationen wurden berichtet 2 und systematische Vergleiche von Strategien, um High-Content-Daten zusammenzufassen über eine große Anzahl von Parametern berichtet worden 3. High-Content-Analyse von Bilddaten haben den Einsatz in Zellstudien von Medikamenten-Reaktion gefunden, reverse Genetik und Umweltbelastung Signal 4-6. Das Verdienst des Hochinhaltsanalyse beruht auf der Tatsache, dass algorithmische Analyse von Fluoreszenzmikroskopie Daten erlaubt die quantitative und räumliche Parameter gleichzeitig in einzelnen Zellen 7 betrachtet werden. Auf diese Weise können Zellergebnisse für mehrere Assays mit Querverweisen, Differentialverhalten Assay-d sein,efined Zell-Subpopulationen innerhalb Versuchsbedingungen und Assays verfolgt werden können Berücksichtigung der morphologischen Variablen umfassen. Die Strategien und Analyseablauf hier diskutiert, wie für die anderen High-Content-Ansätze sind in der Lage Liefern gemultiplexter Daten, die sich auf einzelne Zellen mit Querverweisen. High-Content-Methoden Anzug Studien, die Fluoreszenz-Mikroskop Bilder zu erzeugen und sind bis in die Tausende von Bildern für die Analyse von Daten, die von Zehn Bilder in geringem Durchsatz herkömmlicher Fluoreszenzbasis Mikroskopie erzeugt mit automatisierten High-Content-Screening-Plattformen produziert. Der Workflow wird hier mit Beispieldaten aus dem separaten Assays werden in Bezug auf die beiden Kernfluoreszenzmarker Intensitäten oder nuklearen / cytoplasmatischen Translokation eines fluoreszierenden Reporterproteins, gemessen dargestellt. Der Arbeitsablauf ist flexibel, da diese Tests können einzeln oder in Kombination betrachtet, je nach eac werdenh Fragestellung gegeben von verschiedenen Forschern. Die Beispieldaten sind als Teil einer RNA-Interferenz (RNAi) Experiment (1) hergestellt. Kleine interferierende RNA-Oligonukleotide (siRNA) werden verwendet, um bestimmte Proteine ​​in HCT116 menschlichen colorektalen Karzinomzellen, die in Änderungen für zwei fluoreszierenden Reportern von Cyclin-abhängigen Kinase (CDK) Aktivität führen Knockdown. Die CDK6-abhängige Phosphorylierung des Kern Retinoblastomprotein an Serin 780 (P-S780 RB1) durch Antikörper-Färbung beurteilt. In den gleichen Zellen wird ein grün fluoreszierendes Protein-markierten Reporter von CDK2 Aktivität (GFP-Reporter CDK2) durch sein Atom zu Plasma-Relation, wo in der Abwesenheit von CDK2 Aktivität der Reporter befindet sich im Kern und auf CDK2 Aktivierung Shuttles in das Zytoplasma beurteilt 8. Zusätzlich wird die Kern-DNA von jeder Zelle mit einem DNA-interkalierenden Farbstoff gefärbt, Bisbenzimid, die als Mittel, um Zellen in den Bildern zu erkennen und definieren Kerne Grenzen dient sowie einesa Maß der DNA Fluss die Informationen auf die Zellzyklusposition der Zelle (2). Die Aktivitäten der CDK6 und CDK2 sind als Zellen Transit von G1 nach S-Phase des Zellzyklus 5 nachweisbar und folgen einander 9,10 und als solche Übereinstimmung zwischen den beiden Reportern in einzelnen Zellen zu erwarten ist. Die Demonstration Datensatz verwendet hier analysiert als ein Beispiel die Wirkung von siRNA zielt CDK6 Retinoblastomprotein (RB1) und eine nicht-Ziel negative Kontrolle (Tabelle 1). Knockdown CDK6 sollte sowohl eine Abnahme des P-S780 RB1-Epitop und eine Ansammlung von Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus auszulösen. Das RB1 Zuschlags dient als Reagenz, um die Spezifität des Phospho-S780-Antikörper. Fluoreszenzmikroskopische Bilder von Formalin fixiert 11, fluoreszierend gefärbt HCT116 Gewebekulturzellen für das algorithmische Bildanalyse verwendet. Die resultierenden Zahlendaten werden dann verwendet,Querverweis die Reporter und messen die Auswirkungen der verschiedenen Zuschlags Staaten. Das Potential Größe der durch diese Art der Analyse gewonnenen Daten können eine Herausforderung zur normalen Analysewerkzeuge darstellen. Zum Beispiel können die einzelnen Zellendaten größer als einige Tabellenkalkulationssoftware aufzunehmen. Enthalten sind Perl-Skripte, die eine einfache, hoch repetitiv, überwacht die Verarbeitung der Daten durchzuführen, um Analyse grosser Datenmengen zu unterstützen. Die Perl-Skripte sind speziell für die von Cell Profiler, bei der Verarbeitung von Bilddateien mit einem bestimmten Dateinamenskonvention (Abbildung 3) erzeugten Ausgabedateien geschrieben und erlauben eine variable Anzahl von Feldern pro Vertiefung in die Analyse verwendet werden. Es ist zu Gate einzelnen Zellassay Daten häufig wichtig, Trends in Zellsubpopulationen 5 verfolgen und hier dargestellt, ist die Verwendung eines Perl-Skript flag jede Zelle basierend auf einem Satz Gate für jeden Test-Typ vorgegeben ist. Ebenfalls enthalten sind optionale Perl-Skriptenwelche eine Zusammenfassung der Daten Ergebnis für einzelne Vertiefungen (oder Bedingungen) liefert: Prozentsatz von Zellen innerhalb der eingestellten Gate und die Mittelwerte der Ausgangstestergebnisse. Letztere, homogener Art der Betrachtung der Daten ist gültig, wenn Antworten wirken sich auf alle oder die Mehrzahl der Zellen in einem gut. Wie oben erläutert, ist eine solche Beurteilung weniger nützlich, als die von den einzelnen Zelldaten Gating wo Reaktion auf eine Untergruppe von Zellen innerhalb einer Population beschränken lieferte. Die Nützlichkeit der beschriebenen Arbeitsablauf wird durch siRNA oder die beschriebenen Marker-Assays nicht auf Störung begrenzt. Studien haben diesen Ansatz verwendet, um Reaktionen in der Gewebekultur-Experimente mit Kombinationen von siRNA, chemische Inhibitoren und Strahlenbehandlung und für die Beurteilung der Ausnahme CDK6 Marker und CDK2 Aktivität 5 zu untersuchen. Konzeptionell kann die experimentelle Strategie eine Vielzahl von biologisch nützliche subzellulären Regionen automatisch registriert werdenin der Fluoreszenzmikroskopbilder vorhanden einzelnen Zellen. Auf diese Weise kann dieser Ansatz quantitative Multiplex Daten, aus denen biologische Informationen, die durch Techniken, die auf die Bevölkerung und nicht einzelne Zellen konzentrieren entgehen lassen kann ergeben. Mit geringfügigen Änderungen kann die Vorgehensweise und Analyse-Workflow beschrieben quantitative, einzelne Zelldaten für alle fluoreszenzbasierte Assay-Ausgänge und zellbiologischen Reaktionen, ergeben, wo quantitative Bewertung der DNA-Gehalt, Quantifizierung von Kern- oder Zytoplasma-Fluoreszenz oder das Pendeln von Markierungen zwischen diesen zwei Fächern entweder einzeln oder in einer Multiplexweise von Interesse ist. Als Publishing-Anforderungen sind in der Regel stärker auf die Einreichung der offen zugänglichen Rohdaten, den Zugang zu und die Vertrautheit mit kostenlosen Tools zur Bildmikroskopische Analyse, wie sie hier beschrieben wird, auch von unmittelbarem Interesse sein, Labore uns auf veröffentlichten Daten erneut analysieren.

<table><tbody><tr><td>AllStars negative control siRNA</td><td>Qiagen</td><td>1027280</td><td>Negative control siRNA.</td></tr><tr><td>CDK6 siRNA</td><td>Dharmacon/ Custom synthesis</td><td>NA</td><td>Antisense sequence: 5&#039; CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td></tr><tr><td>RB1 siRNA</td><td>Dharmacon/ Custom synthesis</td><td>NA</td><td>Antisense sequence: 5&#039; GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td></tr><tr><td>5x siRNA buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>B-002000-UB-100</td><td>To be diluted with nuclease-free, non-DEPC treated water.</td></tr><tr><td>Nulcease-free water (non-DEPC)</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9937</td><td>For dilution of siRNA buffer.</td></tr><tr><td>Hiperfect</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>Transfection lipid.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>Pyruvate and high-glucose supplemented tissue culture media.</td></tr><tr><td>96 well tissue culture plate</td><td>Falcon</td><td>3072</td><td>Plain, 96 well tissue culture plate for the parallel, compartmentalized mixing of transfection complexes.</td></tr><tr><td>Packard Viewplate</td><td>Perkin Elmer LAS</td><td>6005182</td><td>96 well TC plate with optical base on which cells are transfected, grown, fixed and eventually imaged. Supplied with opaque, adhesive plate seals, which are used during storage of used plates.</td></tr><tr><td>Breathable membrane</td><td>Alpha Labs</td><td>LW2783</td><td>Sterile, gas-permeable, adhesive membrane.</td></tr><tr><td>Neutral buffered formalin, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-1CS</td><td>10% Formalin (4% formaldehyde) fixative used neat in protocol.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100PC</td><td>Non-ionic detergent</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Trizma base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>For plate wash solution.</td></tr><tr><td>Anti-P-S780 RB1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab32513</td><td>Rabbit monoclonal</td></tr><tr><td>AlexaFluor647 Anti-rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>Highly cross-adsorbed, fluorescently labelled secondary antibody.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (Bisbenzimide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Fluorescent, chromatin-intercalating, DNA dye.</td></tr><tr><td>Permeabilization solution</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0.1% Triton X-100 in 50 mM Tris-buffered saline, pH 8.0.</td></tr><tr><td>Plate wash solution</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20.</td></tr><tr><td>Block solution</td><td>NA</td><td>NA</td><td>5% powdered milk in Tris-buffered saline and 0.1% Tween-20. For blocking plate prior to immuno-staining and dilution of antibodies.</td></tr><tr><td>Cell Profiler 2.1</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td></tr><tr><td>Active Perl Community Edition</td><td>ActiveState</td><td></td><td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td></tr><tr><td>R programming environment</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>http://www.r-project.org</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>http://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

workflow for high-content, individual cell quantification of fluorescent markers from universal microscope data, supported by open source software

Fortschritte im Verständnis der Kontrollmechanismen, die das Verhalten von Zellen in adhärenten Säugetierzellkultur-Modelle werden zunehmend abhängig von Arten der Einzelzellanalyse. Methoden, die zusammengesetzten Daten, die die mittleren Werte der Biomarker von Zellpopulationen liefern riskieren Subpopulation Dynamik, die die Heterogenität der untersuchten biologischen System zu reflektieren. In diesem Sinne werden die traditionellen Ansätze ersetzt, oder, komplexere Formen der zellulären Assay basiert auf der Beurteilung durch High-Content-Mikroskopie erlauben unterstützt. Diese Assays potenziell für eine große Anzahl von Bildern von fluoreszierenden Biomarkern, die von proprietären Softwarepakete begleitenden aktiviert, ermöglicht die Mehrparametermessungen pro Zelle. Jedoch haben die relativ hohe Kapitalkosten und overspecialization vieler dieser Vorrichtungen ihrer Zugänglichkeit für viele Forscher verhindert. Beschrieben wird hier einuniversell einsetzbare Arbeitsablauf für die Quantifizierung von multiplen Fluoreszenzmarker Intensitäten von spezifischen subzellulären Regionen einzelner Zellen, die zur Verwendung mit Bildern von den meisten Fluoreszenzmikroskope. Der Schlüssel zu diesem Workflow ist die Umsetzung des frei verfügbaren Zell Profiler Software ein, um einzelne Zellen in diesen Bildern, Segment sie in definierten subzellulären Regionen unterscheiden und liefern Fluoreszenzmarker Intensitätswerte spezifisch für diesen Regionen. Die Extraktion einzelner Zellintensitätswerte von Bilddaten ist das zentrale Ziel dieser Arbeitsablauf und wird mit der Analyse der Steuerdaten von einer siRNA-Bildschirm für G1-Checkpoint Regulatoren in adhärenten menschlichen Zellen veranschaulicht. Jedoch kann der Workflow hier dargestellt, um die Analyse von Daten von anderen mittels Zellstörung angewendet werden (beispielsweise Verbindung Bildschirmen) und andere Formen der Fluoreszenz zelluläre Marker und sollten somit für einen weiten Bereich von Labors.

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Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Dargestellt ist eine flexible Informatik Workflow ermöglicht Multiplex bildbasierte Analyse fluoreszenzmarkierten Zellen. Der Workflow quantifiziert nukleäre und zytoplasmatische Marker und berechnet Marker Translokation zwischen diesen Fächern. Verfahren für Störung von Zellen mit siRNA und zuverlässige Methode zur Markerdetektion durch indirekte Immunfluoreszenz in 96-Well-Formaten zur Verfügung gestellt.

Workflow für Hoch Inhalt, einzelne Zell Quantifizierung der Fluoreszenzmarker von Universal Mikroskop Daten, Unterstützung von Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

workflow-for-high-content-individual-cell-quantification-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Aufrufe.  UCL Cancer Institute.  Dargestellt ist eine flexible Informatik Workflow ermöglicht Multiplex bildbasierte Analyse fluoreszenzmarkierten Zellen. Der Workflow quantifiziert nukleäre und zytoplasmatische Marker und berechnet Marker Translokation zwischen diesen Fächern. Verfahren für Störung von Zellen mit siRNA und zuverlässige Methode zur Markerdetektion durch indirekte Immunfluoreszenz in 96-Well-Formaten zur Verfügung gestellt. 

Serie: Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biochemie

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Entwicklungsbiologie

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Biotechnik

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Biologie

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Schnelle Analyse und Exploration von Fluoreszenzmikroskopie Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do not allow for accurate interpretation of this interplay. Using a quantitative imaging-based approach, we present a high-content protocol for characterizing the dynamic phenotypic responses (i.e. morphology changes, proliferation, apoptosis) of heterogeneous cell populations to changes in environmental stimuli. We highlight our ability to distinguish between cell types based upon either fluorescence intensity or inherent morphology features depending on the application. This platform allows for a more comprehensive characterization of subpopulation response to perturbation while utilizing shorter time, smaller amounts of reagents, and lower likelihood of error than traditional cell biology assays. However, in some cases, cell populations may be difficult to identify and quantitate based on complex cellular features and will require additional troubleshooting; we highlight some of these circumstances in the protocol. We demonstrate this application using response to drug in a cancer model; however, it can easily be applied more broadly to other physiological processes. This protocol allows one to identify subpopulations within a co-culture system and characterize the particular response of each to external stimuli.

We have developed a novel protocol for studying heterocellular population dynamics in response to perturbations. This manuscript describes an imaging-based platform that produces quantitative datasets for simultaneous characterization of multiple cellular phenotypes of heterocellular populations in a robust manner.

Diskriminierung und Charakterisierung von Heterocellular Populationen mit quantitativen Imaging-Techniken

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Workflow für Hoch Inhalt, einzelne Zell Quantifizierung der Fluoreszenzmarker von Universal Mikroskop Daten, Unterstützung von Open Source Software

Zusammenfassung

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