Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Gesellschaft für Verhütung von Blindheit (JCC, AAF), uneingeschränkte Mittel an die Klinik für Augenheilkunde von der Forschung bis Blindness (RPB) Verhindere, NY und RPB Medical Student Fellowship Grants unterstützt (JCC).

1. Retinal Vorbereitung <ol><li> Enucleate die Maus Auge. Mit einer Hand, öffnen Sie die Augenlider so dass das Auge sichtbar ist. Mit der anderen Hand, mit einer gebogenen Pinzette (gebogen nach oben), Druck auf superior und inferior Aspekte der Umlaufbahn, bis die Kugel ragt. Schließen Sie vorsichtig Zange am hinteren Teil des Auges und heben in einer kontinuierlichen Bewegung, um das Auge entkernen. </li><li> Fix Auge mit 10% neutral gepuffertem Formalin für mindestens 24 Stunden. </li><li> Augenmarker in PBS-Lösung in eine kleine Petrischale. </li><li> Sezieren Netzhaut sorgfältig unter dem Mikroskop, wobei darauf zu achten induzieren große Tränen. Machen Sie eine erste Schnitt in der Hornhaut mit Dissektion Schere. Dann während die Schnittfläche mit geraden Pinzette, mit einer Schere entlang der Grenze der Hornhaut und Lederhaut Entfernen der Hornhaut geschnitten. Mit feinen gebogenen und geraden Pinzette vorsichtig schälen die Lederhaut und Aderhaut weg von der Netzhaut zum Sehnerven. Dieser Schritt erfordert Geduldschnell die Befreiung der Netzhaut kann zu Tränen führen. Nehmen Sie den Objektivdeckel und überschüssige Iris und Schmutz von der Netzhaut 16. </li></ol> 2. Wasser wäscht <ol><li> Platz Netzhaut in eine 24-Well-Platte und Deckel mit Wasser (etwa 500 ul, mit mindestens einem 45 um-Filter gefiltert). </li><li> Wechseln Sie das Wasser alle 30 min-1 h, mindestens 4-5 mal. </li><li> Lassen Sie über Nacht in Wasser unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. </li></ol> Hinweis: Die Waschschritte sind sehr wichtig, da sie zu trennen, die neuralen retinalen Schichten aus den Blutgefäßen zu helfen. 3. Trypsin Digest <ol><li> Entfernen Sie das Wasser und Inkubation Netzhaut in einer Lösung von 3% Trypsin (Difco 1:250) in 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,8) bei 37 ° C unter leichtem Schütteln keiner. Trypsin verdauen ist abgeschlossen, wenn das Gewebe beginnt Anzeichen des Zerfalls (ca. 1,5 h). Hinweis: Vermeiden Sie schnelles Schüttelnda dies zu Schäden am Gefäßsystem. </li><li> Vorsichtig aus Trypsin Pipette in einem separaten und mit Hilfe eines Mikroskops zu vermeiden, berühren die Netzhaut. Dieses überschüssige Trypsin kann später verwendet werden, wenn die Manipulation der Gefäße unter dem Mikroskop, in Schritt 4.3. </li></ol> 4. Die Trennung des Gefäßsystems <ol><li> In gefiltertes Wasser an der Netzhaut. Dann schälen versuchen aus dem inneren Grenzmembran mit einer Pinzette, mit der Schere, wenn nötig. Schütteln Sie unter leichtem Rühren für 5 min. Vorsichtig Pipette das Wasser unter dem Mikroskop, um eine Beschädigung der Netzhaut. </li><li> Wiederholen Wasserwaschungen (jeweils 5 min), um kostenlos das Netzwerk von Schiffen aus der anhaftenden Netzhautgewebe helfen. Wasser wäscht abgeschlossen sind, wenn es wenig bis gar keine Trümmer im Wasser nach dem Waschen. </li><li> Sorgfältige Manipulationen unter einem Dissektionsmikroskop nun weiter frei bis das Netzwerk von Schiffen benötigt. Nachfolgend finden Sie einige nützliche Techniken, die in Sequenz oder ind verwendet werden kannividually zur Erreichung des gewünschten Ergebnisses zu technischen Präferenz: <ol class="lalpha"><li> Mit einer 200 ul Pipette vorsichtig pipettieren Wasser nach oben und unten neben Schiffen, bläst Wasser bei Schiffen, was leichtem Rühren. </li><li> Mit 200 ul Pipette pipettieren das Trypsin nach oben und unten zu beschichten Wände der Pipette helfen. Anschließend vorsichtig mit Pipette das gesamte Gefäß-Netzwerk einmal auf und ab zu helfen, brechen nicht-vaskulären Gewebe. Hinweis: Zentrieren der Pipettenspitze an der Sehnerven nicht die Kanten des vaskulären Netz kann auch verhindern, dass das Gefäßsystem Kleben an der Spitze. </li><li> Heben Gefäßsystem mit feinen Pinzette aus dem Wasser, um nicht-vaskulären Komponenten zu entfernen. </li><li> Wenn die oben genannten Schritte nicht funktionieren, fügen Trypsin auf die Netzhaut zu helfen, brechen das Gewebe, und Inkubation bei 37 ° C für mehrere Minuten. Dann entfernen Trypsin und wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.3. </li></ol></li></ol> &lt;strong&gt; Hinweis: Achten Sie darauf, zu beschichten alle Instrumente, die in Kontakt mit den Gefäßen in Trypsin (zB Pipette, Pinzette) wird kommen. Dies wird Ihnen helfen zu vermeiden Haftung Gefäßsystem an die Ausrüstung. 5. Visualisierung des Gefäßsystems <ol><li> Geben Sie einen Tropfen Wasser auf einen sauberen Objektträger. Mit einer 200 ul Pipette oder Pinzette, übertragen Sie die verdaut Schiffe ins Wasser. Stellen Sie sicher, dass das vaskuläre Flachbild-Halterung entfaltet. Die Oberflächenspannung des Wassers hilft, die jetzt durchsichtig Gefäßnetz entfalten. Wenn das Gewebe nicht zu entfalten ist, fügen Sie zusätzliche Wasser und schütteln Sie die Folie zu erleichtern Entfaltung. </li><li> Überschüssiges Wasser sehr langsam durch Pipettieren oder mit einem Papiertuch. </li><li> Lassen Sie die Objektträger vollständig trocknen. </li><li> Stain Folien über entsprechende Protokoll entweder mit PAS / Hämatoxylin oder H &amp; E-Färbung. Hinweis: PAS / Hämatoxylin ist nützlich zur Identifizierung von Gefäßwand und Zellkerne, H &amp; E ist nützlich für demonstration von RBC als gut. </li><li> Entwässern und montieren (Permount Eindeckmediums). </li></ol>

<ol>
	<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture.">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change.">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li><li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti.">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li><li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRP/trypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature.">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li><li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model;+SHR/N:Mcc-cp+rat.">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li><li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution.">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li><li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models.">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li><li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db/db+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio.">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+30.">Chapter 30.</a> Diabetic Retinopathy. , (2005).</li><li>Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.19+Diabetic+Retinopathy.">Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmology. , (2008).</li><li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease.">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li><li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li><li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats.">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy.">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Trypsin Digest ist ein Standardverfahren, um die Vaskulatur des Retina zu bewerten. Leider ist es technisch anspruchsvoll und kann in hohen Rate von Probe verloren gehen, wenn sie nicht ordnungsgemäß durchgeführt. Darüber hinaus ist das Verfahren besonders schwierig in Mäusen, welche die Anwendung dieser Technik bei den üblicherweise verwendeten genetischen Tiermodellen für Erkrankungen des Auges zu begrenzen. Dieses Papier gibt Hinweise, wie das Verfahren effektiv und konsequent durchzuführen, Maus Augen. <...

Visualisierung des Gefäßsystems der Netzhaut ist ein äußerst wichtiger Ansatz, um die Mechanismen der verschiedenen Augenkrankheiten wie diabetischer Retinopathie sezieren. Er erlaubt es, die frühesten Gefäßveränderungen, einschließlich Mikroaneurysmen, Kapillar-Degeneration und Verlust pericyte 8,9 bewerten. Bis heute gab es mehrere Techniken entwickelt, um die retinale Gefäßsystem zu analysieren. Perfusion verschiedener Farbstoffe verwendet worden ist, um die Gefäße zu markieren, sondern alle ähnliche Grenzen geteilt. Injection selten hebt die gesamte Netzhaut Gefäßsystem, es sei denn bei einem hohen Druck, das Aufbrechen und schädigen die Gefäße 1 Risiken gegeben. Immunfärbung von vaskulären Endothel mit fluorophormarkierten G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugierten; I21413; Invitrogen; Verdünnung 1:100) und retinale flachen Halterungen können markieren Sie die gesamte Architektur der Schiffe, aber ohne detaillierte Visualisierung der Kapillaren, Basalmembranen und Perizyten . Es wurde von dem bekanntenFriedenwald, dass die Schiffe durch Färbung Flachbild-Halterungen der Netzhaut mit periodischen acid-Schiff (PAS) oder Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E)-Färbung 10 können hervorgehoben werden. Allerdings war Färbung nicht spezifisch für die Gefäße und markiert die nicht-vaskulären Gewebe sowie, was es schwierig macht, die Gefäße zu unterscheiden. In den 1960er Jahren entwickelt und Cogan Kuwabara das Trypsin zu verdauen Technik, die es einfacher, die retinalen Gefäße durch Verdauen des vaskulären Komponenten der Netzhaut 1 sichtbar gemacht. Seit dieser Zeit hat sich das Trypsin Digest zum Goldstandard-Methode bei der Analyse der Gefäße der Netzhaut 2-5. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass andere alternative Techniken, um das Gefäß zu isolieren beschrieben wurden. Die Verwendung von osmotischen Lyse wurde verwendet, um die Gefäße zu isolieren und damit biochemische Untersuchungen des Gewebes 11,12, aber das Verfahren ist nicht als primäre Methode anatomischen Studie verwendet. Das Gewebe Druckmethode wurdeverwendet werden, um große Teile der Mikrovaskulatur zu isolieren und ermöglicht die Fähigkeit, die elektrotonischen Architektur des Gefäßsystems 13 zu studieren. Theoretisch könnte diese Technik auch verwendet werden, um anatomische Veränderungen zu untersuchen, wie die Qualität der Gefäße hoch ist. Es ist jedoch nur in der Lage, um Segmente des gesamten Gefäßsystem Netzwerk zu isolieren. Obwohl diese Methoden nicht ersetzen kann Trypsin verdauen, ist es wichtig zu beachten, dass sie unterschiedliche Vor-und Nachteile haben und sind in dieser Hinsicht ergänzen. Das Trypsin Digest-Methode ist technisch anspruchsvoll und schwierig ist, konsequent 6,7 durchzuführen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Trypsin Digest besonders schwierig ist auf einem Maus-Modell, insbesondere, wenn man wünscht, die gesamte Gefäßarchitektur der Netzhaut 6,7 bewahren. Herausforderungen umfassen (1) über-Verdauung der Netzhaut, Verlust sowohl das Gefäßsystem sowie nicht-vaskulären Gewebe verursacht, (2) unter-Verdauung, erfordernumfangreiche mechanische Präparation wodurch wiederum führen zu Schäden des Schiffes Bett, (3) einer schlechten Trennung des nicht-vaskulären Gewebes aus dem Gefäßsystem zu nicht-spezifischen Färbung. Mehrere Manuskripte haben diese Herausforderungen hervorgehoben, aber keine haben eine detaillierte und konsistente Protokoll vorgesehen, um sie zu überwinden 14,15. Dieses Manuskript wird es eine Schritt-für-Schritt-Methodik detailliert die Technik, um das Trypsin zu verdauen auf Maus und Ratte Netzhaut führen mit speziellen Tipps für den Umgang mit den besonders schwierigen Schritte. Eine schematische Übersicht ist in Fig. 1 gezeigt.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1:250)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0458-50G</td>
			<td>Make 3% trypsin in 0.1 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop sterile vacuum bottle</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Create filtered water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps (Inox)</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forcepts (Dumostar)</td>
			<td>Dumont #7</td>
			<td>11297-10</td>
			<td>Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>BDG59442</td>
			<td>Shaker optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-132</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model

Trypsin verdauen ist der Goldstandard Methode, um die retinale Gefäßsystem 1-5 zu analysieren. Es ermöglicht die Visualisierung des gesamten Netzwerks von komplexen dreidimensionalen retinalen Blutgefäßen und Kapillaren, indem eine zweidimensionale Flachbild-Halterung der miteinander verbundenen Gefäßkanäle nach Aufschluss der nicht-vaskulären Komponenten der Netzhaut. Dies erlaubt es, verschiedene pathologische Gefäßveränderungen, wie Mikroaneurysmen Kapillare Degeneration und abnorme Endothelzellen zu pericyte Verhältnisse zu studieren. Allerdings ist das Verfahren technisch anspruchsvoll, vor allem bei Mäusen, die haben sich die am weitesten verbreitete Tiermodell, um die Netzhaut wegen der Leichtigkeit der genetischen Manipulationen 6,7 studieren. In der Maus Auge, ist es besonders schwierig, vollständig zu entfernen, die nicht-vaskulären Komponenten, während die allgemeine Struktur der Blutgefäße der Netzhaut. Bis heute gibt es einen Mangel an Literatur, die Trypsin verdauen Technik beschreibt im Detail, in die Maus. Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Methodik des Trypsin Digest in Maus Netzhaut, sondern schafft auch Tipps zur Fehlerbehebung schwierige Schritte.

Das Endprodukt eines erfolgreichen Verfahrens ist ein Flachbild-Halterung des gesamten Netzes der Maus retinalen Gefäßen, mit der Architektur gehalten, gefärbt entweder mit PAS / Hämatoxylin oder H &amp; E, wie in den Figuren 2-4 gezeigt. Klare Differenzierung von Endothelzellen und Perizyten zu sehen, wie in Abbildung 3 gezeigt. In der Netzhaut sind die Kerne von Endothelzellen oval oder länglich und liegen vollständig innerhalb der Gefäßwand. Perizyten Kerne sind klein, kugelf...

Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin Digest ist eines der am häufigsten verwendeten Methoden, um retinale Gefäßsystem zu analysieren. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren im Detail, einschließlich der wichtigsten Änderungen, die Technik zu optimieren und entfernen Sie die nicht-vaskulären Gewebe und gleichzeitig die gesamte Architektur der Schiffe.

Trypsin Digest Protokoll zum Analysieren des retinalen Gefäßsystem eines Maus-Modell

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

trypsin-digest-protocol-to-analyze-retinal-vasculature-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K Aufrufe.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Trypsin Digest ist eines der am häufigsten verwendeten Methoden, um retinale Gefäßsystem zu analysieren. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren im Detail, einschließlich der wichtigsten Änderungen, die Technik zu optimieren und entfernen Sie die nicht-vaskulären Gewebe und gleichzeitig die gesamte Architektur der Schiffe.

Serie: Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Ein Optic Nerve Crush Injury Mausmodell zur retinalen Ganglienzellen Survival Study

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Morphometrische Analysen von Netzhautschnitte

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain proper, that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis. The tissue harvested is suitable for biochemical and physiological analysis, and the MAV has been shown to be sensitive to damage produced by amphetamine and hyperthermia 1,2. As well, the major and minor cerebral vasculatures harvested in MAV are of potentially high interest when investigating concussive types of head trauma. The MAV dissected in this presentation consists of the pial and some of the arachnoid membrane (less dura) of the meninges and the major and minor cerebral surface vasculature. The choroid plexus dissected is the structure that resides in the lateral ventricles as described by Oldfield and McKinley3,4,5,6. The methods used for harvesting these two tissues also facilitate the harvesting of regional cortical tissue devoid of meninges and larger cerebral surface vasculature, and is compatible with harvesting other brain tissues such as striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. The dissection of the two tissues takes from 5 to 10 min total. The gene expression levels for the dissected MAV and choroid plexus, as shown and described in this presentation can be found at GSE23093 (MAV) and GSE29733 (choroid plexus) at the NCBI GEO repository. This data has been, and is being, used to help further understand the functioning of the MAV and choroid plexus and how neurotoxic events such as severe hyperthermia and AMPH adversely affect their function.

This video presentation shows a method of harvesting the two most important highly vascular structures that support forebrain function. They are the cerebral surface (superficial) vasculature along with associated meninges (MAV) and the choroid plexus which are necessary for cerebral blood flow and cerebrospinal fluid (CSF) homeostasis.

Ein Visual Beschreibung der Dissektion der Hirnoberfläche Gefäßsystem und assoziierten Hirnhäute und der Aderhaut Plexus aus Rattenhirn

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and hypothalamus that supplies blood to the brain and surrounding structures. It has been implicated in several cerebrovascular disorders, including cerebral amyloid angiopathy (CAA)-associated vasculopathies, intracranial atherosclerosis and intracranial aneurysms. Studies of the molecular mechanisms underlying these diseases for the identification of novel drug targets for their prevention require animal models. Some of these models may be transgenic, whereas others will involve isolation of the cerebro-vasculature, including the CoW.The method described here is suitable for CoW isolation in any mouse lineage and has considerable potential for screening (expression of genes, protein production, posttranslational protein modifications, secretome analysis, etc.) studies on the large vessels of the mouse cerebro-vasculature. It can also be used for ex vivo studies, by adapting the organ bath system developed for isolated mouse olfactory arteries.

We describe here a reproducible protocol for isolating the mouse circle of Willis.

Protokoll für die Maus Kreis von Willis Trenn

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a detailed method pointing out critical steps is provided with recommendations for optimization to achieve consistently successful occlusion rates across different genetically modified mouse strains. The RVO mouse model consists primarily of the intravenous administration of a photosensitizer dye followed by laser photocoagulation using a retinal imaging microscope attached to an ophthalmic guided laser. Three variables were identified as determinants of occlusion consistency. By adjusting the wait time after rose bengal administration and balancing the baseline and experimental laser output, the variability across experiments can be limited and a higher success rate of occlusions achieved. This method can be used to study retinal diseases that are characterized by retinal edema and hypoxic-ischemic injury. Additionally, as this model induces vascular injury, it can also be applied to study the neurovasculature, neuronal death, and inflammation.

Here, we describe an optimized protocol for retinal vein occlusion using rose bengal and a laser-guided retinal imaging microscope system with recommendations to maximize its reproducibility in genetically modified strains.

Optimierung des Mausmodells mit retinalen Venenverschlüssen zur Begrenzung der Variabilität

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...