Dieses Protokoll bietet eine detaillierte immunhistochemische Methode zur Identifizierung, Validierung und gezielten funktionell relevanten Caspasen in komplexen Geweben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Abfrage zelltypspezifischer apoptotischer und nicht-apoptotischer Caspase-9-Funktionen ermöglicht und auf andere komplexe Gewebe und Caspasen von Interesse angewendet werden kann. Das Verständnis der Funktionen von Caspasen kann dazu beitragen, das aktuelle Wissen in der Zellbiologie zu erweitern und kann auch vorteilhaft sein, um potenzielle therapeutische Ziele aufgrund ihrer Beteiligung an Krankheiten zu identifizieren.
Beginnen Sie mit der Quantifizierung der Caspase-Spiegel mit konfokalen Mikroskopiebildern von gefärbten Netzhautschnitten. Ziehen Sie dazu die Bilddateien von 405, 470, 555 und 640 Kanälen auf die Konsole von Fidschi. Klicken Sie auf die Registerkarten Bild, Farbe und Kanäle zusammenführen, um den Dateien Farben zuzuweisen.
Komprimieren Sie dann den Z-Stapel, indem Sie auf den Bildstapel und das Z-Projekt klicken. Wählen Sie den Projektionstyp als maximale Intensität aus. Öffnen Sie die Benutzeroberfläche des Kanals, indem Sie auf das Bild und anschließend auf das Werkzeug des Farbkanals klicken.
Öffnen Sie als Nächstes die Helligkeits- und Kontrastschnittstelle. Um die Parameter pro Kanal auszuwählen, gehen Sie zur Registerkarte des Kanals und wählen Sie einen Kanal aus. Platzieren Sie den Cursor über dem Hintergrund und kommentieren Sie den Pixelwert.
Setzen Sie dann den Cursor auf die Caspase-ausgedrückte Zelle und kommentieren Sie den Pixelwert. Um die Parameter zu testen, gehen Sie zur Helligkeits- und Kontrastschnittstelle und klicken Sie auf Auswählen. Geben Sie den angezeigten Mindestwert oder den Pixelwert der Caspase-Zelle ein.
Geben Sie dann den maximal angezeigten Wert oder den Hintergrundpixelwert ein, bevor Sie auf OK klicken. Wählen Sie die Zufallsbilder von verblindetem Gewebe und wiederholen Sie die Auswahl der Parameter pro Kanal, um die Parameter für alle Kanäle zu testen. Sobald die Parameter festgelegt sind, öffnen Sie die Bilddateien und komprimieren Sie den Z-Stapel.
Fügen Sie die Helligkeits- und Kontrastparameter für den Caspase-Kanal und das Isolectin für den vaskulären Markerkanal hinzu. Verwenden Sie das Punktwerkzeug und quantifizieren Sie die Anzahl der positiven vaskulären Bereiche unter Verwendung der Kolokalisierung des vaskulären Markers mit Caspase-Expression als Auslesen positiver Bereiche. Verwenden Sie dann Haken als Marker für positive neuronale Bereiche, um die Anzahl der positiven vaskulären Bereiche zu quantifizieren.
Kommentieren Sie die Werte in einer Tabelle pro Bild und mitteln Sie die Werte nach Abschnitt. Mittelwert der Abschnittswerte, die die Anzeige pro Auge darstellen. Das Protokoll identifizierte die zelluläre Lokalisation der Caspasen und der neuronalen Netzhautschichten, in denen die Caspasen exprimiert werden.
Der Netzhautquerschnitt ermöglichte die Visualisierung von Netzhautkernen in der retinalen Ganglienschicht oder RGL, internukleären Schicht oder INL und der äußeren Kernschicht oder ONL, wenn sie mit Haken gefärbt wurden. Im Querschnitt erschienen die retinalen Blutgefäße getrennt und getrennt und versorgten die plexiformen Schichten zwischen RGL und INL sowie zwischen INL und ONL. Netzhautquerschnitte identifizierten auch die stark regulierte Caspase-9, einen Tag nach dem Netzhautvenenverschluss.
Die Caspase-9-Hemmung war wirksamer bei der Reduzierung der neuronalen Caspase-7-Expression in Endothelzell-Knockout-Mäusen, was die funktionelle Relevanz von endothelialer Caspase-9 bestätigte. Die repräsentative Analyse zeigte, dass die Hemmung der Caspase-9-Aktivität pharmakologisch die Caspase-7-Expression nach dem Netzhautvenenverschluss blockiert. Der Erfolg der Technik beruht auf einer sorgfältigen Gewebevorbereitung sowie IHC- und mikroskopischen Bildgebung, um die Konsistenz, Gültigkeit und Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.
Diese Methode könnte mit der Western-Blotting-Analyse kombiniert werden, um den Caspase-Signalweg semi-quantitativ zu vergleichen. Die Technik lieferte die Schritte, um die Wirksamkeit eines therapeutischen Ansatzes zu hinterfragen, der auf aktives Caspase-9 in RVO abzielt. Dieser Ansatz kann auch auf andere Gewebe, einschließlich des Gehirns, angewendet werden.
