Nützliche Gespräche mit Isja de Feijter und Matt Baker dankbar anerkannt.

1. Synthese der Sensoren <ol><li> Im folgenden Abschnitt stellen wir ein Verfahren für die Konjugation von pH-Indikatoren, um PAMAM-Dendrimere. Das gleiche Protokoll können mit minimalen Änderungen auf alternative Lager Amin-Dendrimere angewendet werden. 5,17,13,14 Handel erhältliche Dendrimere und Farbstoffe können ohne weitere Reinigungen verwendet werden. </li><li> Löse das Dendrimer in wasserfreiem DMSO (50 &amp;mgr; M Endkonzentration). Bereiten 10 mM Stammlösungen von Fluorescein-NHS und Tetramethyl-Rhodamin-NHS (TMR) in wasserfreiem DMSO. </li><li> In den Dendrimer-Lösung die gewünschte Menge an Fluorescein und TMR. Das Molverhältnis in der Mischung die Menge an Farbstoffen auf dem Dendrimer geladen reflektieren. Typischerweise 1 ml G4-PAMAM-Dendrimer-Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 8 eq (40 ul) von Fluorescein und 8 eq (40 ul) des TMR umgesetzt. Man rührt die Lösung bei Raumtemperatur für 12 Stunden. </li><li> Verdünnen 1:10 mit VE-Wasser und laden Sie die ReaktionMischung in einem Dialysebeutel (MWCO = 10 kDa). Dialyse für 24 Stunden gegen deionisiertes Wasser häufig Ersetzen des Wassers in dem Behälter. </li><li> Die Lösung wird in einem Glasfläschchen und gefriertrocknen 24 Stunden. Ein lila Pulver erhalten werden sollte. Gewicht der erhaltene Feststoff zu und löse es in Milli-Q-Wasser bei einer Endkonzentration von 10 uM. Aliquot der Lösung und bei -20 ° C </li></ol> 2. In-vitro-pH-Messungen <ol><li> Für die in vitro-Kalibrierung bereiten eine Lösung von Dendrimer 500 nM in PBS (2 mM Phosphat) in einer Quarzküvette. Die Verwendung einer sehr verdünnten PBS-Puffer (2 mM), um plötzliche Änderungen des pH-Wertes während der Titration zu vermeiden, wird empfohlen. </li><li> Messung der Emissionsspektren der Fluorescein (exc 488 nm) und TMR (exc 550 nm) und die Optimierung der optischen Einstellungen des Fluorimeters um ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erreichen. </li><li> Führen Sie eine pH-Titration durch Zugabe geringer Mengen von NaOH 0,1 N und 0,1 N HCl Nach jeder Zugabe schütteln Sie die Küvettezum Mischen, 1 min warten zur Äquilibrierung und Messung der pH mit Hilfe eines pH-Mikroelektrode. Emissionsspektren von Fluorescein und TMR sollte für jeden Schritt ohne irgendeine Änderung der optischen Einstellungen aufgezeichnet werden. </li><li> Zeichnen Sie die Fluoreszenzintensität vs pH-Wert für die Titration. Die Rhodamin-Signal sollte von pH-Wert (&lt;10%) davon unberührt. Die Fluorescein-Signal sollte eine sigmoidale Kurve sein und sollte mit einer einzigen Bindungsmodell mit pK = 6.4 ausgestattet werden. </li></ol> 3. Zellkultur und Elektroporation <ol><li> Kultivieren HeLa-Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin (Invitrogen) ergänzt. Halten der Zellkultur bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre. </li><li> Für Dendrimer Elektroporation, wenn die Zellen konfluent, entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen mit DPBS (Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung). Entfernen Sie die DPBS und fügen Trypsin-EDTA. Neutralisieren Sie das TRYPsündigen, indem Medium mit Serum, jedoch keine Antibiotika. Zentrifuge bei 900-1200 Umdrehungen pro Minute für 2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Medien und spülen Sie die Pellets mit DPBS. </li><li> Zählen Sie die Zellen und nehmen 4 * 10 6 Zellen. Zentrifuge bei 1200-1500 rpm für 2 min bei Raumtemperatur. </li><li> Zellpellet in 200 ul Mikroporation Puffer (durch Mikroporator Hersteller) und übertragen Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In Dendrimer wässrigen Lösung in resuspendierten Zellen. Die Menge des Dendrimer pro Probe erforderlich ist, ist abhängig von der PAMAM-Typ (typischerweise 250 nm für die kationische und 2 uM für neutrale Dendrimere). </li><li> In Elektroporationspuffer (von Mikroporator Hersteller) in einer Mikroporation Röhre. Pipettieren Sie die Zellen und Dendrimere Gemische mit Elektroporation Spitze von 100 ul Volumen-Größe. Legen Sie die Mikroporator Pipette in die Pipettenstation. Stellen Sie die Puls Bedingung für Mikroporation: Impulsspannung = 1,005 V; Puls width = 35 ms, Pulszahl = 2 ist. </li><li> Nachdem die Impulsübertragungszellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und Zellen für 5 min bei 1200 UpM um den Überschuss an Dendrimer in dem Medium zu entfernen. Die Platte 10 ul Elektroporation von Zellen auf 35 mm Glasbodenschalen (WillCo Schale GWSt-3522) mit frischem Medium w / o Antibiotika. </li></ol> 4. pH Sensing in Wohn HeLa-Zellen <ol><li> Bildzellen mit einem konfokalen Mikroskop 12 h nach der Elektroporation. </li><li> Standard-Filtersatz für Fluorescein und Rhodamin verwendet werden. Wenn abstimmbaren Filter sind ein Satz grünen Kanal 500 bis 550 nm und eine rote Kanal von 580 nm bis 650 nm auf. Anregung bei 488 nm ist optimal für Fluorescein während Rhodamin könnte entweder mit dem 543nm oder 561 Laserlinie abgebildet werden. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf die Probe und stellen Laser und Detektoren Macht zu gewinnen, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Wenn die Elektroporation erfolgreich war hell fluoreszierende Zellen sollten in beiden Kanälen sein. DieLokalisierung hängt von der Größe und Ladung des Dendrimer verwendet. Oft einige lysosomale Lokalisation (kleine perinukleären Vesikeln) vorhanden ist, durch Endozytose oder Abschottung. Wenn die lysosomale Lokalisierung wiegt, dh die meisten der Fluoreszenz innerhalb Vesikeln lokalisiert und schlechten Signal im Cytosol beobachtet, so bedeutet dies, Toxizität und Messung verworfen werden sollte. Erwerben Sie nacheinander die beiden Kanäle, bei Bedarf mehrere Bilder erwerben und der Mittelwert der Bilder, um die Bildqualität zu verbessern. </li><li> Zur Kalibrierung Klemmzelle unter Verwendung von Puffern mit pH-Ionophoren bei verschiedenen pH und erwerben mindestens 20 Zellen pro pH-Wert wie oben beschrieben. Für eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens und der Zusammensetzung der Puffer bitte Bizzarri und Mitarbeiter beziehen. 16. Wir empfehlen, mindestens 5 Punkte von pH = 5,5 bis pH = 7,5 zu messen. pH-Wert unter 6 sind giftig für Zellen, sondern für kurze Zeit geduldet, schlagen wir vor, um die Bilder so schnell wie möglich zu erwerben. Wenn Zellenzeigen Anzeichen von Apoptose, entsorgen Sie die Zellen und neu zu starten. </li><li> Verwenden Sie ImageJ oder analoge Software für die Datenanalyse. Importieren Sie die Bilder von der grünen und roten Kanal, subtrahieren Hintergrund und erstellen Sie eine Pixel für Pixel Ratio Imaging mit dem Werkzeug &quot;Bild-Taschenrechner&quot;. </li><li> Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) Auswahl der gewünschten Zelle und Messung der intrazellulären Grün-zu-Rot-Verhältnis. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder zu zeichnen und dann das Verhältnis gegenüber dem pH-Wert. Im Bereich von 5,5 bis 7,5 ist der Trend linear sein. Die lineare Anpassung der erhaltenen Punkte der Eichkurve, die verwendet werden, um grün zu rot-Verhältnis auf pH-Wert konvertieren, werden zu geben. </li><li> Als weitere Kontrolle zu erlangen mehreren unbehandelten Zellen (keine Ionophore) und versuchen, pH-Wert mit der erhaltenen Eichkurve zu berechnen. Ein Wert zwischen 7,2 und 7,4 erhalten werden sollte. </li></ol> 5. In-vivo-Probenvorbereitung <ol><li> Die Experimente wurden auf C57Bl/6J (Männer und Frauen), die zwischen der postnatalen d durchgeführtay 28 und 70. Betäubt die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Urethan (dh Ethylcarbamat) (20% w / v in physiologischer Kochsalzlösung, 20 mg / kg Urethan). Die Tiere wurden nach dem Versuch mit einer Überdosis Urethan, gefolgt von einer intrakardialen Injektion der gleichen Narkose getötet. </li><li> Ausführen einer intramuskulären Injektion von Dexamethason-Natriumphosphat (2 mg / kg Körpergewicht) die kortikale Stressantwort und Hirnödem während der Operation zu verringern. </li><li> Rasieren Sie den Kopf des Tieres und gelten 2,5% Lidocain-Gel auf die Kopfhaut. </li><li> Mit einer Schere, um die Klappe der Haut, die den Schädel beider Hemisphären geschnitten </li><li> Waschen Sie die freiliegenden Knochen mit Kochsalzlösung und entfernen Sie vorsichtig die Knochenhaut mit einer Pinzette. Dadurch wird eine bessere Basis für Klebstoff und Zahnzement mit haften. </li><li> Tragen Sie eine maßgeschneiderte Stahlkopf Post mit einem zentralen Bildraum und kleben Sie es mit Sekundenkleber in einer Ebene etwa parallel mit dem Schädel über den kortikalen Bereich von interest und fixieren Sie ihn mit weißen Zahnzement (Paladur). </li><li> Befestigen Sie den Kopf der Maus, um eine Kraniotomie von 2-3 mm Durchmesser über der Region von Interesse gebohrt durchzuführen. </li><li> Versuchen, die Erwärmung des Cortex während der Operation, Dura Tränen oder Blutung zu minimieren. </li><li> Halten die Rinde mit sterilem ACSF (126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO 3, 2,4 mM CaCl 2 strömt, 15 mM Glucose, 1,2 mM HEPES in destilliertem H 2 O , pH = 7,4). </li></ol> 6. pH-Bildgebung in der Maus-Gehirn <ol><li> Während des Experiments Hilfe tierischen Atmung Bereitstellen O 2-angereicherter Luft. Sauerstoff wird bis zu 80% angereichert. O 2-Partialdruck und Fluss wird häufig angepasst werden, um eine richtige Atmung Hilfe zu erhalten. Halten der Körpertemperatur konstant bei 37 ° C mit einer rückkopplungsgesteuerten Heizdecke. </li><li> Befestigen Sie das Tier durch den Stahlpfosten unter dem Ziel einer Zwei-Foton Bildaufbau. </li><li> Um den Sensor in der Hirnrinde zu injizieren laden einer Glaspipette, die ein AgCl-Elektrode (Spitzendurchmesser 4 mm) mit der Dendrimer-Lösung (1 uM). Die Elektrode wird es ermöglichen, die extrazelluläre Feldpotentiale zu erfassen. </li><li> Mit einer Mikroinjektion Setup legen Sie die Pipette in der Hirnrinde bei etwa 150 um Tiefe. Injizieren für 1-2 Minuten bei einem Druck von 0,5 psi. </li><li> Optimieren Sie den optischen Aufbau für die Bildgebung. Laserleistung sollte so eingestellt werden, Bleichen und Lichtschäden zu minimieren. Typischerweise Laserleistung eingesetzt wird, ist etwa 20 mW und PMT-Verstärkung wurde bei 667 V konstant gehalten, da Kalibrierungen ergab, dass diese Spannung gibt die beste S / N-Verhältnis. </li><li> Für die Bildgebung erregt den Sensor bei 820 nm und erkennen gleichzeitig Fluorescein und Rhodamin-Fluoreszenz durch FITC und TRITC Standardfilter. </li><li> Für zeitaufgelöste Messungen erwerben Zeitserie mit 2 Hz. </li><li> Für Hintergrundkorrektur erwerben einen dunklen Rahmen mit dem laser Verschluß geschlossen, um den mittleren thermischen Rauschens sich in den PMTs und dem Sockel in der Regel von der Elektronik hinzugefügt messen. </li><li> Für die Datenanalyse nach dem gleichen Verfahren in Abschnitt 4 angegeben. </li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure+termination+by+acidosis+depends+on+ASIC1a.">Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a.</a> Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).</li></ol>

Standard: Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die kritischen Schritte zur erfolgreichen pH-Bildgebung mit Dendrimer-Sensoren sind: i) die Auswahl der richtigen dendritischen Gerüsts und der Anzahl von Indikatoren, die es konjugiert ist, und ii) die Optimierung der Sensorübermittlungsprotokoll in Zellen oder in vivo. Das synthetische Verfahren ist relativ einfach und kann praktisch zu jedem Amin-tragenden hyperverzweigten Polymeren aufgebracht werden. Die Sensoren können aus kommerziell erhältlichen Dendrimere und NHS-aktivi...

Die Verwendung von fluoreszierenden Molekülen zu bestimmten biologisch relevanten Molekülen Etikett vollständig, wie biologische Systeme untersuchen wir verändert. Widefield und konfokale Mikroskopie für eine Echtzeit hochauflösende Visualisierung biologischer Prozesse und heute erlaubt zählen zu den beliebtesten Techniken der biologischen Ereignisse in vitro, in Zellen und in vivo zu untersuchen. 1 Eine relevante Verbesserung wurde durch die Entwicklung von Fluoreszenzindikatoren dargestellt , dh Farbstoffe, deren Fluoreszenz ist abhängig von der Konzentration eines spezifischen molekularen Einheit. pH-und Calcium-Indikatoren insbesondere hatte einen dramatischen Einfluss auf die Untersuchung der Zellphysiologie aufgrund der enormen Bedeutung von H + und Ca 2 +-Ionen in der Biologie. 2,3 I) Schwierigkeiten bei der subzellulären targeti: Allerdings sind die meisten der anwesenden Erkundung mehrere Farbstoffe immanente Grenzen ihrer kleinen Molekül Verhalten wie im Zusammenhangng, ii) schlechte Löslichkeit in Wasser und damit schlechte Biokompatibilität;. iii) Zell Leckage und damit der Mangel an lang Zeitraffer-Bildgebung Fähigkeit 4 Darüber hinaus wird das Signal von vielen Sonden kann nicht für die Abhängigkeit von der Farbstoffkonzentration korrigiert werden (nicht ratiometrische Bildgebung), und daher ist keine absolute Messung in Zellen oder in vivo möglich. Wir haben kürzlich eine einfache und effektive Methode, um diese Einschränkungen zu überwinden, bezogen auf die Konjugation von Sensor Farbstoffe auf einem Dendrimer-Gerüst. 5 monodispersen Dendrimere sind hochverzweigte Polymere mit sehr ansprechenden Eigenschaften für biologische Anwendungen. 6 Insbesondere mehreren dendritischen Architekturen entwickelt und verwendet Drogen 7 und Gen-Lieferung. 8 Erst in jüngster Zeit einige Gruppen begonnen, das Potenzial der Moleküle als Gerüst für die Erfassungsvorrichtungen zu erforschen. 9,10,11 Wir haben vorherbeschrieben, einen einfachen Syntheseweg zur Funktionalisierung von verschiedenen Polyamidoamin (PAMAM)-Gerüst basierend auf NHS-Aktivester. 12 Konjugate können in einem einzigen Schritt durch Dialyse als nur Reinigung erhalten werden. Interessanter dieser Ansatz leicht zu einer Vielzahl von dendritischen oder polymere Gerüste angewendet werden. 13,14 Um ratiometrische Bildgebung Dendrimere zu erreichen waren doppelt markierte mit zwei Sätzen von Farbstoffe: i) ein pH-Indikator (z. B. Fluorescein) und ii) eine pH-unabhängige fluoreszierende Gruppe (dh Rhodamin). Dies erlaubte uns, eine genaue pH-Bildgebung als das Verhältnis zwischen Fluorescein und Rhodamin ist nur abhängig von dem pH-Wert und nicht mehr von der Konzentration der Sonde durchzuführen. Ein weiterer interessanter Ansatz für dieses Problem wird durch die Verwendung von Lebenszeit-basierte Sonden. Vertreten 15 Da die Lebensdauer nicht von Sondenkonzentration hängen diese Messungen müssen nicht ein ratiometrisches Korrektur. Jedoch LIFetime Messungen erfordern eine kompliziertere Instrumental Setup und deren zeitliche Auflösung für schnelle physiologische Prozesse suboptimal, was ihre Einsatzmöglichkeiten einschränkt. Um intrazelluläre Bildgebung durchzuführen, muss die Sonde durch die Plasmamembran in das Cytosol abgegeben werden. Da die Dendrimere nicht durchlässige Membran aufgrund ihrer Größe und Hydrophilie, die intrazellulären Abgabe durch Elektroporation erreicht werden. Mit Hilfe dieser Technik, die weithin in der Biologie zur Transfektion verwendet werden, können markierte Makromoleküle effektiv in Zellen geliefert hohe Bildqualität durchzuführen. Außerdem mit der Elektroporation werden die Komplikationen Dendrimer Endozytose Zusammenhang kann vermieden werden, da die Makromoleküle werden direkt in das Zytoplasma geliefert. Interessanter nach der Elektroporation verschiedenen Dendrimere zeigt deutliche Lokalisation innerhalb der Zellen auch in Abwesenheit von spezifischen Zielsequenz. 5 Dieses passive Targeting, nur aufgrund der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Dendrimers kann genutzt werden, um Organellen-spezifische pH-Bildgebung zu erzielen. Ratiometrische Bildgebung können mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie werden. Fluorescein und Rhodamin, die kovalent an das dendritische Gerüst konjugiert ist, wurden separat abgebildet wird und ein Pixel-für-Pixel-Verhältnis der Karte erstellt wurde. Mehrere Verfahren zur intrazellulären pH in lebenden Zellen durch Ionophore steuern berichtet. Ionophore sind kleinen hydrophoben Molekülen, die Ionen über die Plasmamembran zu transportieren; Ionophore für H +-Ionen, wie Nigericin, sind verfügbar und können verwendet werden, um Dendrimer-Sensoren zu kalibrieren 16. Diese Messungen zeigten eine lineare Reaktion auf pH-Wert ähnlich zu dem, was beobachtet. in vitro. Auf der Grundlage der Eichintrazellulären pH-Wert genau gemessen werden konnte. Diese Messungen zeigen, dass Dendrimer-basierten Sensor kann ein wertvolles Werkzeug in der Studie H + homeost seinasis in lebenden Zellen und pathologischen Prozesse, die Fehlfunktionen beinhalten pH-Regulierung. Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Dendrimer-basierten pH-Sensoren können auch in vivo angewendet werden, die Durchführung pH-Bildgebung im Gehirn von betäubten Mäusen. 17. Aufgrund der komplexen Umgebung von lebendem Gewebe eine hohe Qualität in vivo-Mess ist technisch anspruchsvoll. Hier zeigen wir eine detaillierte Beschreibung des experimentellen Verfahren zur In-vivo-Bildgebung mit Schwerpunkt pH-Wert der entscheidenden Fragestellungen im Hinblick auf eine genaue pH-Bildgebung im Gehirn durchzuführen. Zwei-Photonen-Mikroskopie hat aus zwei Gründen eingesetzt: i) die Verwendung von Infrarotlicht ermöglicht es, den Mangel an Gewebepenetration von Standard-konfokale Mikroskopie überwinden, ii) die breite Zwei-Photonen-Absorption von Fluorescein und Rhodamin zulassen, dass ihre gleichzeitige Anregung der Vermeidung Komplikationen die Verwendung von zwei Wellenlängen zur Anregung stehen. pH-Messungen in Maushirn warenerfolgreich durchgeführt; Sensoren leicht auf Hypoxie reagieren induzieren Änderung des pH-Wertes im Gehirn extrazellulären Raum. Diese Messungen zeigen, dass die Dendrimer-basierten Indikatoren können erfolgreich verwendet werden, um physiologische und pathologische Veränderung des pH in vivo in einem Tiermodell hervorzuheben.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
		 <td>Company</td>
		 <td>Catalogue number</td>
		 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
	 <tr>
	 <td>PAMAM G4</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>412449</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Carboxyfluorescein NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1311</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>TMR NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1171</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>DMSO</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>D8418</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Dyalsis bags</td>
		 <td>Spectrum Labs</td>
		 <td>132117</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>WillCo Dishes</td>
		 <td>WillCo Wells</td>
		 <td>GWSt-3512</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Urethane</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>U2500</td>
		 <td></td>
	 </tr>
 </tbody>
</table>

synthesis, cellular delivery and in vivo application of dendrimer-based ph sensors

Die Entwicklung von Fluoreszenzindikatoren eine Revolution für die Lebenswissenschaften. Genetisch kodierte und synthetische Fluorophore mit Sensor Fähigkeiten erlaubt die Visualisierung von biologisch relevanten Spezies mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Synthetische Farbstoffe sind von besonderem Interesse, dank ihrer hohen Abstimmbarkeit und das breite Spektrum der messbaren Analyten. Allerdings sind diese Moleküle leiden mehrere Einschränkungen auf kleine Molekül Verhalten bezogen (schlechte Löslichkeit, Schwierigkeiten bei der Targeting, oft nicht ratiometrische Bildgebung erlaubt). In dieser Arbeit wird die Entwicklung der Dendrimer-basierten Sensoren führen wir und stellen ein Verfahren für die pH-Messung in vitro, in lebenden Zellen und in vivo. Wir wählen Dendrimere als ideale Plattform für unsere Sensoren für ihre viele wünschenswerte Eigenschaften (Monodispersität, einstellbaren Eigenschaften, Multivalenz), die ihnen eine weit verbreitete Gerüst für verschiedene biomedizinische Geräte gemacht. Die Konjugation von fluoreszierenden pH-WertIndikatoren für die Dendrimer-Gerüst führte zu einer Verbesserung ihrer Leistungen Erfassungs. Insbesondere Dendrimere eine verminderte Zell Leckage, verbesserte intrazelluläre Targeting und erlauben ratiometrische Messungen. Diese neuartigen Sensoren wurden erfolgreich eingesetzt, um pH-Wert in lebenden HeLa-Zellen und in vivo im Gehirn der Maus zu messen.

Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung der Konjugation des Erfassens Farbstoffe, verschiedene dendritischen Gerüste. Die resultierenden Indikatoren können in einem einzigen Syntheseschritt aus kommerziell erhältlichen Produkten erhalten werden. Amin-tragende Dendrimere mit NHS-aktivierten Farbstoffe in DMSO umgesetzt und durch Dialyse gereinigt. Dieses allgemeine Verfahren wurde bereits erfolgreich für die Kennzeichnung von mehreren Dendrimere verwendet: i) PAMAM-Dendrimer der Generation 2, 4 u...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Fluoreszenz-Sensoren sind mächtige Werkzeuge in Life Science. Hier beschreiben wir eine Methode zu synthetisieren und zu verwenden Dendrimerbasis Fluoreszenzsensoren auf pH in lebenden Zellen und in vivo zu messen. Die dendritische Gerüst verbessert die Eigenschaften von konjugierten Fluoreszenzfarbstoffe, die zu verbesserten Sensoreigenschaften.

Synthesis, Cellular Lieferung und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Anwendung der Dendrimer-basierten pH-Sensoren

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Unit 1

Acid–Base Titration

Acid-base and Solubility Equilibria

SCIENTISTS IN ACTION

11.6K Aufrufe.  Eindhoven University of Technology & NEST, Scuola Normale Superiore and Istituto Nanoscienze-CNR.  Fluoreszenz-Sensoren sind mächtige Werkzeuge in Life Science. Hier beschreiben wir eine Methode zu synthetisieren und zu verwenden Dendrimerbasis Fluoreszenzsensoren auf pH in lebenden Zellen und in vivo zu messen. Die dendritische Gerüst verbessert die Eigenschaften von konjugierten Fluoreszenzfarbstoffe, die zu verbesserten Sensoreigenschaften. 

Serie: Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. The synthesis of hypervalent iodonium alkynyl triflates can be facile, but difficulties stem from their isolation and reactivity. In particular, the necessity to use filtration under inert atmosphere at -45 &deg;C for some HIATs requires special care and equipment. Once isolated, the compounds can be stored and used in reactions with azides to form cyanocarbene intermediates. 
The evidence for cyanocarbene generation is shown by visible extrusion of dinitrogen as well as the characterization of products that occur from O-H insertion, sulfoxide complexation, and cyclopropanation. A side reaction of the cyanocarbene formation is the generation of a vinylidene-carbene and the conditions to control this process are discussed. There is also potential to form a hypervalent iodonium alkenyl triflate and the means of isolation and control of its generation are provided. The O-H insertion reaction involves using a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and methanol as solvent/substrate. The sulfoxide complexation reaction uses a HIAT, sodium azide or tetrabutylammonium azide, and dimethyl sulfoxide as solvent. The cyclopropanations can be performed with or without the use of solvent. The azide source must be tetrabutylammonium azide and the substrate shown is styrene.

Herein is described the synthesis, isolation, and reactions of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) with azides to generate cyanocarbenes. The procedures will involve air-sensitive and cryogen techniques, including cold filtration under an inert atmosphere. Handling and safety of the synthesized compounds will also be discussed.

Synthese von hypervalenten Iodonium Alkinyl triflaten für die Anwendung der Gene Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Forschung

Chemie

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended solvent window, low background currents, corrosion resistance, etc., arise from the catalytically inert nature of the surface. However, if during the growth process, non-diamond-carbon (NDC) becomes incorporated into the electrode matrix, the electrochemical properties will change as the surface becomes more catalytically active. As such it is important that the electrochemist is aware of the quality and resulting key electrochemical properties of the BDD electrode prior to use. This paper describes a series of characterization steps, including Raman microscopy, capacitance, solvent window and redox electrochemistry, to ascertain whether the BDD electrode contains negligible NDC i.e. negligible sp2 carbon. One application is highlighted which takes advantage of the catalytically inert and corrosion resistant nature of an NDC-free surface i.e. stable and quantifiable local proton and hydroxide production due to water electrolysis at a BDD electrode. An approach to measuring the local pH change induced by water electrolysis using iridium oxide coated BDD electrodes is also described in detail.

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

A protocol is described for the characterization of the key electrochemical parameters of a boron doped diamond (BDD) electrode and subsequent application for in situ pH generation experiments.

Beurteilung der bordotierten Diamantelektrode Qualität und Anwendung auf<em&gt; In-situ-</em&gt; Änderung des Local pH durch Elektrolyse von Wasser

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Synthesis and Exfoliation of Discotic Zirconium Phosphates to Obtain Colloidal Liquid Crystals

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and engineers. Growth of such anisotropic nanocrystals through a simple chemical method is a challenging task. In this study, we fabricate discotic nanodisks of zirconium phosphate [Zr(HPO4)2&#183;H2O] as a model material using hydrothermal, reflux and microwave-assisted methods. Growth of crystals is controlled by duration time, temperature, and concentration of reacting species. The novelty of the adopted methods is that discotic crystals of size ranging from hundred nanometers to few micrometers can be obtained while keeping the polydispersity well within control. The layered discotic crystals are converted to monolayers by exfoliation with tetra-(n)-butyl ammonium hydroxide [(C4H9)4NOH, TBAOH]. Exfoliated disks show isotropic and nematic liquid crystal phases. Size and polydispersity of disk suspensions is highly important in deciding their phase behavior.

A two dimensional model material of discotic zirconium phosphate was developed. The inorganic crystal with lamellar structure was synthesized by hydrothermal, reflux, and microwave-assisted methods. On exfoliation with organic molecules, layered crystals can be converted to monolayers, and nematic liquid crystal phase was formed at sufficient concentration of monolayers.

Synthese und Exfoliation von diskotischen Zirkoniumphosphaten Erhalten Kolloidales Liquid Crystals

Due to their abundance in natural clay and potential applications in advanced materials, discotic nanoparticles are of interest to scientists and ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI). Their purpose is to enhance the relaxation rate of water protons in tissue, thus increasing the MR image contrast and the specificity of the MRI measurements. Current clinically approved contrast agents are low molecular weight molecules that are rapidly cleared from the body. The use of dendrimers as carriers of paramagnetic chelators can play an important role in the future development of more efficient MRI contrast agents. Specifically, the increase in local concentration of the paramagnetic species results in a higher signal contrast. Furthermore, this CA provides a longer tissue retention time due to its high molecular weight and size. Here, we demonstrate a convenient procedure for the preparation of macromolecular MRI contrast agents based on poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers with monomacrocyclic DOTA-type chelators (DOTA &#8211; 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). The chelating unit was appended by exploiting the reactivity of the isothiocyanate (NCS) group towards the amine surface groups of the PAMAM dendrimer to form thiourea bridges. Dendrimeric products were purified and analyzed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry, and elemental analysis. Finally, high resolution MR images were recorded and the signal contrasts obtained from the prepared dendrimeric and the commercially available monomeric agents were compared.

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

This protocol describes the preparation and characterization of a dendrimeric magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent that carries cyclen-based macrocyclic chelates coordinating paramagnetic gadolinium ions. In a series of MRI experiments in vitro, this agent produced an amplified MRI signal when compared to the commercially available monomeric analogue.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung der für Magnetresonanz-Kontrastmittel Dendrimer-basierten

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical properties, which allow for the absorption of near-infrared (NIR) light and can subsequently convert it into multiplexed emissions that span over a broad range of regions from the UV to the visible to the NIR. This article presents detailed experimental procedures for high-temperature co-precipitation synthesis of core-shell UCNs that incorporate different lanthanide ions into nanocrystals for efficiently converting deep-tissue penetrable NIR excitation (808 nm) into a strong blue emission at 480 nm. By controlling the surface modification with biocompatible polymer (polyacrylic acid, PAA), the as-prepared UCNs acquires great solubility in buffer solutions. The hydrophilic nanocrystals are further functionalized with specific ligands (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) for localization on the cell membrane. Upon NIR light (808 nm) irradiation, the upconverted blue emission can effectively activate the light-gated channel protein on the cell membrane and specifically regulate the cation (e.g., Ca2+) influx in the cytoplasm. This protocol provides a feasible methodology for the synthesis of core-shell lanthanide-doped UCNs and subsequent biocompatible surface modification for further cellular applications.

A protocol is presented for the synthesis of core-shell lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) and their cellular applications for channel protein regulation upon near-infrared (NIR) light illumination.

Synthese von Kern-Schale Lanthanid-dotierte Großbildschirmen Nanokristallen für mobile Anwendungen

Lanthanide-doped upconversion nanocrystals (UCNs) have attracted much attention in recent years based on their promising and controllable optical ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

Eine schnelle Synthese-Methode für Au, Pd und Pt-Aerogelen über lösungsorientierte Direktreduktion

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis of Soft Polysiloxane-urea Elastomers for Intraocular Lens Application

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses (a-IOLs). Aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes (PDMS) were previously prepared via the ring-chain equilibration of the cyclic siloxane octamethylcyclotetrasiloxane (D4) and 1,3-bis(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane (APTMDS). Phenyl groups were introduced into the siloxane backbone via the copolymerization of D4 and 2,4,6,8-tetramethyl-2,4,6,8-tetraphenyl-cyclotetrasiloxane (D4Me,Ph). These polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers were synthesized for increasing the refractive indices of polysiloxanes. For applications as an a-IOL, the refractive index of the polysiloxanes must be equivalent to that of a young human eye lens. The polysiloxane molecular weight is controlled by the ratio of the cyclic siloxane to the endblocker APTMDS. The transparency of the PSU elastomers is examined by the transmittance measurement of films between 200 and 750 nm, using a UV-Vis spectrophotometer. Transmittance values at 750 nm (upper end of the visible spectrum) are plotted against the PDMS molecular weight, and &#62; 90% of the transmittance is observed until a molecular weight of 18,000 g&#183;mol&#8722;1. Mechanical properties of the PSU elastomers are investigated using stress-strain tests on die-cut dog-bone-shaped specimens. For evaluating mechanical stability, mechanical hysteresis is measured by repeatedly stretching (10x) the specimens to 5% and 100% elongation. Hysteresis considerably decreases with the increase in the PDMS molecular weight. In vitro cytotoxicity of some selected PSU elastomers is evaluated using an MTS cell viability assay. The methods described herein permit the synthesis of a soft, transparent, and noncytotoxic PSU elastomer with a refractive index approximately equal to that of a young human eye lens.

This study describes synthetic routes for aminopropyl-terminated polydimethylsiloxanes and polydimethyl-methyl-phenyl-siloxane-block copolymers and for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers. It presents the application of PSUs as accommodating an intraocular lens. An evaluation method for in vitro cytotoxicity is also described.

Synthese von weichen Polysiloxan-Harnstoff-Elastomeren für Intraokularlinsen Anwendung

This study discusses a synthesis route for soft polysiloxane-based urea (PSU) elastomers for their applications as accommodating intraocular lenses ...

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the designing of poly(ethylenimine) grafted with polyethylene glycol (PEI-g-PEG) copolymer functionalized gold nanoparticles (AuNPs) with loaded aptamer (AS1411) and DOX through amide reactions. AS1411 is specifically bonded with targeted nucleolin receptors on cancer cells so that DOX targets cancer cells instead of healthy cells. First, PEG is carboxylated, then grafted to branched PEI to obtain a PEI-g-PEG copolymer, which is confirmed by 1H NMR analysis. Next, PEI-g-PEG copolymer coated gold nanoparticles (PEI-g-PEG@AuNPs) are synthesized, and DOX and AS1411 are covalently bonded to AuNPs gradually via amide reactions. The diameter of the prepared AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs is ~39.9 nm, with a zeta potential of -29.3 mV, indicating that the nanoparticles are stable in water and cell medium. Cell cytotoxicity assays show that the newly designed DOX loaded AuNPs are able to kill cancer cells (A549). This synthesis demonstrates the delicate arrangement of PEI-g-PEG copolymers, aptamers, and DOX on AuNPs that are achieved by sequential amide reactions. Such aptamer-PEI-g-PEG functionalized AuNPs provide a promising platform for targeted drug delivery in cancer therapy.

In this protocol, doxorubicin-loaded AS1411-g-PEI-g-PEG modified gold nanoparticles are synthesized via three-step amide reactions. Then, doxorubicin is loaded and delivered to target cancer cells for cancer therapy.

Synthese von Aptamer-PEI-g-PEG Modifizierte Gold-Nanopartikel, die mit Doxorubicin für die gezielte Arzneimittelabgabe geladen werden

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...