Wir danken Osman Kaftanoglu für hilfreiche Beratung und Unterstützung während der Dreharbeiten. Wir möchten die anonymen Gutachtern für wertvolle Kommentare. Diese Arbeit wurde von der Research Council of Norway (gewährt 180504, 191699, 213976 und), Marie Curie/FP7 (Projekt-ref. 238665), des National Institute on Aging (NIA Zuschuss AG22500 P01) und den Pew Charitable Trusts unterstützt.

1. Die Entkopplung von Seneszenz chronologischen Alter Dieser Abschnitt beschreibt die Einrichtung von Doppel Kohorte Kolonien, die aus einer Gruppe von Individuen identifiziert, die den gleichen chronologischen Alter (&quot;single Alterskohorte&quot;) und eine Kohorte von Bienen Nest Aktien bestehen. Gleiche Alter Individuen der einzelnen Alterskohorte wird schließlich in verschiedenen Arbeiter-Typen mit unterschiedlichen Alterungsdynamik zu trennen - das sind Krankenschwester Bienen mit verlangsamter und Sammlerinnen mit beschleunigten Funktionsabnahme. Alle Verfahren sind für eine experimentelle Kolonie beschrieben. Wir empfehlen jedoch Experimente für mindestens zwei Kolonie durch repliziert, so dass Kolonie Effekten kann (zwei Replikat-Design) gesteuert werden. <ol><li> Vorbereiten Bienenstock-Boxen für den Doppel Kohorte Kolonien: Bereiten Sie eine regelmäßige Struktur ein, die zwei Lebensmittel Kämme mit Honig erhält, einen anderen Lebensmittelkamm mit Pollen, und zwei leere Kämme. Achten Sie auf eine gepaart Königin sowie ein Spender Kolonie mit mehr als 3.000 lokalisierenNest Bienen. (1.3) beide später eingeführt werden. </li><li> Beziehen und Kennzeichnung Individuen mit ähnlichen chronologischen Alter: Sammeln Kämme mit verdeckelten Brut, die im Entstehen ist. Für ein Replikat erwarten, Kämme mit insgesamt 3.000-5.000 verdeckelten Brutzellen zu sammeln. Für jede Wiederholung verwenden eine ausgewogene Menge an Brut aus mindestens drei verschiedenen Quellen, um Bienenstock schiefen Verteilungen von Genotypen (Bienenstock Herkunft) zu vermeiden. <ol><li> Zeigen Brutwaben in einem Inkubator auf 34 ° C mit 60 bis 70% relative Feuchte eingestellt. Achten Sie darauf, Kämme in einer Weise, dass die Schwellen Brut nicht entweichen kann speichern. </li><li> Lassen Bienen entstehen für zwei Tage und markieren diese Bienen mit einer kleinen Lack-Tag auf den Brustkorb (zB Uni POSCA, Mitsubishi Pencil Co. Ltd.) Die Farbmarkierung ermöglicht die Identifizierung der Bienen der einzelnen Altersjahrgangs (Tag der Entstehung) und um sie von anderen Replikat-Kolonien zu unterscheiden. </li></ol></li><li> Einrichten einer Doppel Kohorte Kolonie, die die Kohorte von i enthältdentified, single Alter Bienen: An dem Tag, jungen Bienen markiert wurden, sammeln etwa 2.500-3.000 Nest Bienen von einem Spender Kolonie (vgl. Abschnitt 1 in Diskussion.) und fügen Sie diese nicht markierten Bienen in den Bienenstock-Box, die vor vorbereitet wurde (siehe Schritt 1.1). Letztere wird den nicht identifizierten Personen Nest Biene Kohorte bilden. <ol><li> Fügen Sie die Königin, die zunächst zu einem Doppelkäfig (im Handel erhältlich) beschränkt wird. Verschließen Sie den Käfig mit essbaren Süßigkeiten (zB Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Deutschland), um Arbeitsbienen geben langsam die Königin. </li><li> Fügen Sie die neu entstandenen und markierte Bienen, die die einzelnen Altersjahrgangs darstellen wird. Diese Bienen sind die einzigen markierten Individuen, und sind die Fokusgruppe für alle folgenden Schritte. </li></ol></li><li> Überwachung der Nahrungssuche Beginn und Kennzeichnung Sammlerinnen: Zur Entstehung und Dynamik der Krankenschwester-to-Häcksler Übergang in eine einzige Alterskohorte zu bewerten, überwachen die demographische Entwicklung der Sammelaktivität esehr anderen Tag für jeden Kolonie. Beginnen Zählen fünf Tage nach Kolonien wurden (Abbildung 1) gesetzt. <ol><li> Zählen Sie die Anzahl der Bienen Rückkehr aus Futtersuche Flüge (Eingang zählt) innerhalb von 3 x 20 min Beobachtungszeiträume zu festen Zeiten. Achten Sie darauf, die Bienen in Zeiten der Orientierung Flüge zählen nicht (siehe Diskussion). </li><li> Als Eingang zählt zeigen erhebliche Futtersuche zu beginnen (&gt; 100 Eingang counts / Tag), beginnen Kennzeichnung Häcksler. Um dies zu tun, Sammlerinnen der einzelnen Alterskohorte (Einzel markierten Individuen) erhalten eine zweite Farbmarkierung nach der Rückkehr von ihrer ersten Flüge Nahrungssuche. Diese Farbmarkierung wird der Tag der Futtersuche Beginn anzugeben, und wird es ermöglichen, später identifizieren die Nahrungssuche für jedes Alter Häcksler. </li><li> Täglich wiederholen Markierungen, bis eine ausreichende Anzahl von Bienen wurde markiert. Für die Abschätzung einer ausreichenden Anzahl von markierten Sammlerinnen, erwarten eine Wiederfindungsrate von nicht mehr als 5-10%, nachdem diese Bienen war gealtert worden, in der Regel nach 14 TagenFuttersuche. </li></ol></li><li> Sampling: Da alle ursprünglich markierten Bienen haben eine ähnliche chronologische Alter kann altersgleichen Gruppen von Krankenschwestern und alte Sammler gleichzeitig gesammelt werden, als Sammlerinnen haben für ≥ 14 Tage Futter gesucht. <ol><li> Einzel deutliche Krankenschwester Bienen im Bienenstock gesammelt und werden von Pflegeverhalten (Fütterung und Reinigung der Larven mit Kopf nach unten in offenen Brutzellen setzen) identifiziert. </li><li> Doppel markiert Sammlerinnen sind auch in den Bienenstock gesammelt vor der täglichen Futtersuche beginnt. </li><li> Bienen sammeln in Käfigen (Tuben, Schachteln), die eine ausreichende Belüftung zu gewährleisten, halten und dunkel bis zur Weiterverarbeitung. Alternativ zur Transkriptom-, Proteom-oder epigenetische Studien direkt Snap Bienen Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Sammeln ausgewogene Zahl von Personen aus allen Testgruppen und zu replizieren Kolonien. </li></ol></li></ol> 2. Umkehr der Arbeiter mit Rapid auf Arbeitnehmer mit Verlangsamte Aging durch Ändern der Hive Demographie &lt;/ P&gt; Dieser Abschnitt enthält Details, wie die Umkehrung von Arbeitnehmern mit beschleunigten Alterung (Häcksler) Arbeitnehmer mit verlangsamter Alterung (Krankenschwester Bienen) durchgeführt wird. Solche Verhaltensumkehr induziert wird, als Sammlerinnen erleben einen Mangel an Ammen, die normalerweise in der Brutpflege zu engagieren. Die Reversion Verfahren wird getrennt eine einzelne Kolonie in zwei Bienenstöcke zu replizieren: Bienenstock mit der Krankenschwester Biene Fraktion (&quot;Krankenschwester-abgeleitete&quot;), und eine andere mit dem Häcksler Fraktion (&quot;Häcksler abgeleitete&quot;). Nach der erfolgreichen Umkehr, mögliche Symptome von Kunststoff-und umgekehrt Alterung in der einzigen Alterskohorte mit rückgängig Arbeiter, weiterhin Sammlerinnen, Weiterbildung Krankenschwester Bienen und neu eingestellten Sammlerinnen untersucht werden. Nach wie vor identifiziert Bienen der einzelnen Altersjahrgangs, nicht die Kohorte von nicht identifizierten Nest Bienen bilden die experimentellen Fokusgruppe. <ol><li> Zubereitung: Replizieren Nesselsucht mit Krankenschwestern (Einzel markiert) und Häcksler (Doppel markiert) zur Verfügung gestellt werden, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Achten Sie darauf, nicht anfangen Reversion mit weniger als 500 markierte Sammler pro Wiederholung Kolonie, um eine ausreichende Abruf nach der Rückkehr abgeschlossen ist sicherzustellen. <ol><li> Für die sichere Identifikation von Testgruppen nach Umkehr ist es entscheidend, dass die gesamte Bevölkerung in den Häcksler ursprünglichen Bienenstock wurde, bevor Reversion markiert. Das folgende Verfahren ist für ein Replikat beschrieben. </li><li> Am Tag vor der Rückkehr, bereiten eine weitere Bienenstock-Box für den Häcksler-abgeleitete Struktur (siehe Schritt 1.1). Suchen Sie zwei Damen und zwei Brutwaben aus Spendernesselsucht. Vor der Übergabe an den experimentellen Kolonien Pinsel entfernt alle erwachsenen Bienen aus diesen Kämme. Ein Käfig Königin (siehe Schritt 1.3) und eine Brutwaben wird Königin und Brutwaben in der ursprünglichen Struktur ein ersetzen. Die andere Gruppe von Königin und Brutwaben werden am nächsten Tag für den neuen Bienenstock-Box verwendet werden. Ähnliche Zuteilung neuer Brutwaben und Alien-Königinnen für beide, das Original und die neue Bienenstock wird empfohlen, um sicherzustellen, dass getrennte Sammlerinnen und Krankenschwesters gleichermaßen Erfahrung verändert Bienenstock Cues (&quot;hive Geruch&quot;). </li></ol></li><li> Reversion: Morgens, kurz vor der Rückkehr, fügen Sie den Käfig Königin und die Brut Kamm zu der neuen Box, die die Häcksler-abgeleiteten Fraktion erhalten wird. Warten Sie, bis der Spitzennahrungssuche beginnt. Dann bewegen Sie die ursprüngliche Kolonie markiert mit Häcksler und Krankenschwester Bienen mindestens 100 m entfernt von der ursprünglichen Position. <ol><li> Am ursprünglichen Standort, Einrichtung der neuen Box für den Häcksler-abgeleiteten Bienenstock mit Brut und nur Königin. </li><li> Foragers verlassen die dislozierten ursprünglichen Struktur ein, und zurück an den ursprünglichen Speicherort. Lassen Sie den Häcksler an den ursprünglichen Speicherort für 2 Stunden, um zu erreichen neben Trennung der Häcksler Bevölkerung von Bienen Nest vervollständigen zurückzukehren. </li><li> Dann, um die Trennung zu beenden, schließen Sie das Original, jetzt &quot;Krankenschwester-abgeleitete&quot; Bienenstock, und es auf dem Bienenstand mindestens 3 km entfernt. </li></ol></li><li> Hive Wartung und Überwachung für erfolgreiche gesellschaftliche AufgabeAuflösung: Überprüfen Sie die experimentelle Bienenstöcke regelmäßig für gesunde, offene Brut. <ol><li> In den ersten Tagen nach der Kolonie Manipulation ersetzen unbeaufsichtigt und tote Brut, um mögliche Erreger Last zu reduzieren. </li><li> Um erfolgreich zu Umkehr in der Häcksler-abgeleiteten Bienenstock zu validieren, machen Sie Fotos von Brutwaben vor der Einführung dieser und wieder, wenn Kämme ersetzt werden oder wenn die Reversion Experiment abgeschlossen ist (Abbildung 2). Bereiche mit zuvor unverschlossen Brut und mit offenen, Live-Brut sind zuverlässige Marker der Pflegetätigkeit in Häcksler abgeleitete Kolonien. </li></ol></li><li> Sampling: Physiologische Effekte, die soziale Umkehrung begleiten kann 3-8 Tage nach Häcksler und Pflegepersonal erkannt werden getrennt. <ol><li> Wir beraten Probenahme alle Testgruppen, dh rückgängig Arbeiter-und Weiterbildung Häcksler (Häcksler abgeleitete Bienenstock), sowie die anhaltenden Krankenschwestern und neu eingestellten Sammlerinnen (Krankenschwester-Bienenstock abgeleitet) von 8 Tagen nach Umkehr eingeleitet wird. </li><li> Collect Proben wie in Schritt 1.5 beschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Analyse Worker-Typ-spezifische zelluläre Seneszenz-Muster durch Quantifizierung von Lipofuszin Lipofuszin ist ein universeller Biomarker für zelluläre Seneszenz. Als intrinsische Akkumulations Produkt kann lipofuscin spezifischen Autofluoreszenz (Emissions max = 530-650 nm) zur Detektion 18 verwendet werden. <ol><li> Dissection und Fixierung: Schauer Bienen auf Eis, bis unbeweglich, zu entfernen und sezieren die gewünschte Gewebeprobe. <ol><li> Transfer in die Fixierlösung (4% Paraformaldehyd in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, PBS, pH 7,2) für eine Inkubation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> 3 mal in PBS waschen Proben. </li></ol></li><li> Gewebeverarbeitung und Montage: Schneiden von Gewebeproben in Abschnitte mit nicht mehr als 40 &amp;mgr; m Dicke, beispielsweise unter Verwendung eines Mikrotoms Schwingklinge, z. B. Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Deutschland). <ol><li&gt; Für die Reinigung, Inkubation Gewebeschnitte über Nacht in 30% Glycerin (PBS), und weitere 2 h in 50% Glycerin (PBS). </li><li> Montieren Abschnitte auf Objektträger in 50% Glycerin (PBS). Für die langfristige Lagerung Dichtungsdeckel rutscht mit Nagellack. </li></ol></li><li> Bildaufnahme: Um Lipofuszin erkennen, empfehlen wir die Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das Laserlinien bietet mit λ = 514, 561nm oder ähnliche für die Anregung, mit der Detektor Bandbreite von 570 bis 650 nm eingestellt. <ol><li> Zur besseren Identifizierung von Lipofuszin, einen zweiten Kanal, und tun eine gleichzeitige Abtastung bei kürzeren Wellenlängenspektren (Anregung = 405 nm, Emission = 410 bis 450 nm). Die längere Wellenlängenkanal wird sowohl durch autofluoreszierenden Luftröhre und andere nicht-körnige Strukturen offenbaren, granulare Lipofuszin, aber auch unspezifische &quot;Hintergrund&quot;. Der zweite, kürzere Wellenlängenkanal nur unspezifische Autofluoreszenz zeigen, aber nicht Lipofuszin. So kann Lipofuszin Identifizierung Facili sein<html> durch Vergleich der Signale in den beiden Kanälen, wobei nur einer von ihnen offenbart die Granulate mit Lipofuscin spezifische Fluoreszenz tated. </li><li> Zum Erwerb der Bilder mit hoher Auflösung verwenden ein Objektiv mit 40-facher Vergrößerung oder höher, und vorzugsweise einer numerischen Apertur von 1,25 oder höher. Scan-Bildstapeln mit den Abmessungen von ca. 100 x 100 x 10 um drei. Und jeder einzelne Gewebeprobe, die von mehreren Bildstapel dargestellt werden. </li><li> Um intra-individuelle und inter-individuelle Unterschiede durch technische Veränderung zu reduzieren, der stets Laserleistung und Empfindlichkeit des Detektors konstant. </li><li> Um Verzerrungen durch Tag zu Tag technische Varianten reduzieren scannen gleich Probennummern aller Testgruppen in jeder der verschiedenen Scan-Sitzungen. </li></ol></li><li> Bildverarbeitung: Mit Software-Pakete mit Modulen, die für erweiterte Verarbeitung von mikroskopischen Bildstapeln zu ermöglichen, zum Beispiel ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA,gej.nih.gov / ij / &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Generieren Sie ein 2D-Projektions maximal für jeden der 3D-Bildstapeln. </li><li> Tragen Sie eine Gauss-Filter mit einem bescheidenen Kerngröße, um Hochfrequenzrauschen zu dämpfen und um Strukturen mit Abmessungen von Lipofuszingranula bewahren. </li><li> Zusammenführen beider Farbkanäle, um die Identifizierung von Lipofuszin (siehe Schritt 3.2) zu erleichtern. </li></ol></li><li> Imageanalysen: Vergewissern Sie sich, dass das Thema der Durchführung der Quantifizierung Schritte werden blind für die Gruppenidentität zu testen. <ol><li> Für alle Bilder, zuerst eine Region von Interesse (ROI), die die entsprechenden Strukturen bedeckt, und hat ähnliche Abmessungen wie der ROIs von anderen Bildern zu wählen. </li><li> Dann wählen Sie die gewünschte Anzahl von Lipofuszingranula, die jede ROI darzustellen. Bei der Auswahl Lipofuszingranula innerhalb einer ROI, wird die Anwendung der folgenden Regeln subjektive Bias zu reduzieren. <ol><li> Wählen Sie einen einheitlichen Ort für die Auswahl der ersten Granulatle. Dies kann, zum Beispiel, wird die am weitesten links Kante eines ROI, und das Granulat, das am nächsten zu der Kante ist immer die erste Wahl sein. </li><li> Einer nach dem anderen werden die Granulat gewählt, die am nächsten zu der vorherigen Auswahl (nächste Nachbarn) sind. </li><li> Bei der Wahl des nächsten Nachbarn, bewegen sich nur in eine Richtung, beispielsweise nur richtig suchen, von der vorherigen Auswahl. Diese Regel verhindert, dass die Auswahl durch gelegentliche Cluster von dicht gepackten Granulat dominiert. </li><li> Bei Auswahl abgeschlossen ist, beurteilen die Größe der einzelnen Partikel durch Lipofuszin skizziert und die Messung der jeweiligen Granulatbereich. Verwenden Sie geeignete statistische Tests, um Personen der verschiedenen Testgruppen vergleichen. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Wir übernehmen hier zuvor beschriebenen Ansätze 8,16,17,19,20, und integrieren sie in einem einzigen Workflow, der das Studium flexibel Alterung in Honigbienen erleichtern wird. Unser Ziel ist es, die Anfänger sind Wissenschaftler auf diesem Gebiet mit einem standardisierten Werkzeugsatz, um relevante Probenmaterial zu erhalten, liefern und experimentelle Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Forschungsteams zu verbessern. Während unsere Verfahren werden vereinfacht und nicht spezielle Ausrüstung wie...

Die komplexen Strukturen der Kolonie sehr soziale Tiere werden durch das Zusammenspiel eines Fortpflanzungs Kaste gehalten und ein Helfer Kaste der Regel nicht-Wiedergabe Arbeitnehmer mit unterschiedlichen sozialen Aufgabe Verhaltensweisen. In den verschiedenen Arbeiter, spezifische physiologische Anpassungen ermöglichen deutliche sib Pflege Verhalten und werden auch extreme Unterschiede Lebensdauer verbunden. Honigbienen und Nacktmulle stellen die besten entwickelten Tiermodell zu untersuchen, wie Sozialität ist, um Muster der beschleunigten, unerheblich oder umgekehrt Alterungs 3.1 verknüpft. In Bienenvölkern ist eine einzige eierlegende Königin von Tausenden von Arbeitnehmern, die die Brut-, Futter für Lebensmittel sind in der Regel unterstützt wird, und bei der Bewachung, Thermoregulation oder hygienische Verhaltensweisen 4 eingreifen. Unter dieser Arbeiter sind die extrem kurzlebige Häcksler, Krankenschwester Bienen mit Zwischen-und Winter (diutinus) Bienen mit der längsten Lebensdauer. Menschen sind jedoch nicht permanent an einem bestimmten WO gebundenrker-Typ, aber zeigen eine flexible Verhaltens Ontogenese, sie von einer sozialen Aufgabe, Verhalten ändern, um eine andere (&quot;zeitliche Kasten&quot;). Callow Bienen zum Grübeln neigen Krankenschwester Bienen verändern, was kann schließlich außerhalb Futtersuche ändern. Allerdings kann callow Nest Bienen auch in langlebigsten Winterbienen zu verwandeln, und kurzlebig Häcksler kann sogar in der Regel langlebiger Krankenschwestern zurück. Arbeitnehmer mit extremen (Winterbienen) und Mittelstufe (Krankenschwester Bienen) Lebensdauer verfügen über gut entwickelte Lebensmittelproduktion und Speicherorgane mit reichlich Ressourcen - im Gegensatz zu kurzlebigen Häcksler (in 1,5 bewertet). Jedoch, dass die Regelung von Einzel Lebensdauer geht über einfache Änderungen in Ressourcenbilanz eines Menschen ist durch die Forschung auf einem Eigelb-Protein, das vielfältige angepasst Funktionen in der Nicht-Wiedergabearbeiterkaste hat, wie Gelee Produktions 6, hormonelle Steuerung 7, Immun vorgeschlagen 8 und antioxidative Verteidigungs 9. Patterns of functional Rückgang (Seneszenz) Spiegel Lebensdauer Ungleichheiten unter den Arbeitnehmern, wie für andere Riechhirn oder motorischen Funktionen 10-13 gegründet, und auch. Insbesondere der deutliche Rückgang der Lernfunktion nach nur zwei Wochen der Nahrungssuche entspricht eine ähnliche Mortalitätsverlauf in Sammler 14, im Gegensatz zu dem Fehlen von nachweisbaren Rückgang (vernachlässigbare Seneszenz) in langlebigen Winterbienen 15. Um die molekularen Fingerabdrücke der Alterung wir flexible angepasst etablierten experimentellen Paradigmen, die für die Überwachung und Manipulation Aging-Typ-Übergänge ermöglichen 8,16,17 identifizieren. Versuch 1 Details, wie man Proben, in denen die Auswirkungen der chronologischen Alter und Arbeitnehmertyp-spezifische soziale Verhaltensweisen auf die Alterung getrennt werden können, zu erhalten. Experiment 2 beschreibt die Umkehrung der Häcksler mit beschleunigten in Krankenschwester Bienen mit verlangsamten Alterungsdynamik. Experiment 3 liefert einen Ansatz zur Untersuchung von Auswirkungen von zellulärer Seneszenz durch anatomical Quantifizierung eines etablierten Biomarker für Zellalterung (Lipofuszin) 18.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apifonda</td>
 <td>S&uuml;dzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>paraformaldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>158127</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>phosphate-buffered saline</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.04094.1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

obtaining specimens with slowed, accelerated and reversed aging in the honey bee model

Gesellschaften sehr soziale Tiere verfügen über große Lebensdauer Unterschiede zwischen nahe verwandten Individuen. Unter sozialen Insekten, ist die Honigbiene, die am besten etablierten Modell zu untersuchen, wie die Plastizität der Lebenserwartung und Alterung wird durch soziale Faktoren erklärt. Die Arbeiterkaste der Honigbienen gehören Krankenschwester Bienen, die die Brut neigen und Sammlerinnen, die Nektar und Pollen zu sammeln. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Gehirnfunktionen und Flugleistung altern schneller in Sammlerinnen als in Krankenschwestern. Allerdings kann die Gehirnfunktionen zu erholen, wenn Häcksler wieder zurück zu Pflegeaufgaben. Solche Muster der beschleunigt und umgekehrt Funktions Seneszenz sind an veränderte Stoffwechsel Ressource Ebenen verknüpft sind, um Veränderungen in der Proteinmenge und die Immunfunktion. Vitellogenin, einem Eigelb Protein mit angepassten Funktionen in hormonelle Steuerung und zelluläre Abwehr, kann als eine wichtige regulatorische Element in einem Netzwerk, das die unterschiedlichen Alterungsdynamik in Arbeiter steuert dienen. Hier beschreiben wir, wie die Entstehung von Krankenschwestern und Sammlerinnen können überwacht werden, und manipuliert werden, einschließlich der Auflösung von in der Regel nur von kurzer Dauer Sammlerinnen in langlebiger Krankenschwestern. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, wie Individuen mit ähnlichen chronologischen Alter differenzieren sich in Sammlerinnen und Krankenschwester Bienen unter experimentellen Bedingungen. Wir veranschaulichen, wie Verhaltensumkehr von Sammlerinnen zurück zu Krankenschwestern können validiert werden. Schließlich zeigen wir, wie verschiedene Zellalterung kann durch Messen der Akkumulation von Lipofuscin, eine universelle Biomarker der Alterung geprüft. Für die Untersuchung Mechanismen, die soziale Einflüsse verbinden kann und Alterungs Plastizität, bietet dieses Protokoll ein standardisiertes Tool, um relevante Probenmaterial zu erwerben, und die Vergleichbarkeit der Daten bei zukünftigen Studien zu verbessern.

Protokoll Abschnitt 1 und 2 ausführlich, wie Testgruppen erhalten, um die Attribute des beschleunigten studieren, verlangsamt und umgekehrt Alterung in Kolonien mit einer einzigen Alterskohorte. Um Arbeitnehmer-Typ-Differenzierung, die den normalen Ontogenese wir beurteilt Häcksler Zahlen (&quot;Eingang zählt&quot;) für 6 Kolonien (Abbildung 1, vgl. Abschnitt 1) begleitet überwachen. Die Grafiken zeigen, dass erhebliche Veränderung von der Krankenschwester auf den Häcksler Zustand ist in der Rege...

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Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

In Arbeitsbienen, hängt Altern auf Sozialverhalten und nicht auf das chronologische Alter. Hier zeigen wir, wie Arbeiter-Typen mit sehr unterschiedlichen Alterungsmuster erhalten und für die zelluläre Seneszenz analysiert werden.

Beziehen Proben mit verlangsamt, Beschleunigte und Umge Aging in der Honig-Bienen-Modell

Societies of highly social animals feature vast lifespan differences between closely related individuals. Among social insects, the honey bee is the best ...

obtaining-specimens-with-slowed-accelerated-reversed-aging-honey-bee

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Aufrufe.  Norwegian University of Life Sciences.  In Arbeitsbienen, hängt Altern auf Sozialverhalten und nicht auf das chronologische Alter. Hier zeigen wir, wie Arbeiter-Typen mit sehr unterschiedlichen Alterungsmuster erhalten und für die zelluläre Seneszenz analysiert werden. 

Serie: Obtaining Specimens with Slowed, Accelerated and Reversed Aging in the Honey Bee Model

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

Brain-Banking: Making the Most Ihrer Forschung Proben

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1.  To ...

Forschung

Biologie

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Imaging von Pilzkörper Neuronen während olfaktorischen Lernen in der Honigbiene

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualisierung des schlagenden Herzens in Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Methoden zum Vergleich der Nährstoffe in Bienenbrot Hergestellt von Africanized und europäischen Honigbienen und die Auswirkungen auf die Hämolymphe Protein Titer

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Dissection und Beobachtung von Honey Bee Dorsal Schiff für Untersuchungen der Herzfunktion

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment methods. Here we describe methods to measure the quantities of adult bees, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, by photographing frames, and by installing hives on scales and with internal sensors. Data from these periodic evaluations are then combined with running average and daily detrended data on hive weight and internal hive temperature. The resulting datasets have been used to detect colony-level effects of imidacloprid applied in a sugar syrup as low as 5 parts per billion. The methods are objective, require little training, and provide permanent records in the form of sensor output and photographs.

Sublethal doses of pesticides may affect colonies in ways that are difficult to detect using only periodic or visual methods. Methods to measure total adult bee mass, brood, and food resources by weighing hives and hive parts, photographing frames, and installing sensors, are provided. Data analysis is also addressed.

Überwachung der Kolonie-Ebene Auswirkungen der subletalen Schädlingsbekämpfungsmittelbelichtung auf Honigbienen

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee (Bombus) Hive Entrances

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis. This has traditionally been done by netting foragers at nest entrances or on flowers, chilling the bees on ice, and then removing the pollen loads from the corbiculae with forceps or a brush. This method is time and labor intensive, may alter normal foraging behavior, and can result in stinging incidents for the worker performing the task. Pollen traps, such as those used on honey bee hives, collect pollen by dislodging corbicular pollen loads from the legs of workers as they pass through screens at the nest entrance. Traps can remove a large quantity of pollen from returning forager bees with minimal labor, yet to date no such trap is available for use with bumble bee colonies. Workers within a bumble bee colony can vary in size making size selection of entrances difficult to adapt this mechanism to commercially reared bumble bee hives. Using 3D printing design programs, we created a pollen trap that successfully removes the corbicular pollen loads from the legs of returning bumble bee foragers. This method significantly reduces the amount of time required by researchers to collect pollen from bumble bee foragers returning to the colony. We present the design, results of pollen removal efficiency tests, and suggest areas of modifications for investigators to adapt traps to a variety of bumble bee species or nest box designs.

A 3D Printed Pollen Trap for Bumble Bee Bombus Hive Entrances

We present a non-lethal and automated mechanism to collect pollen from bumble bee (Bombus) workers returning to a hive. Instructions for producing, preparing, installing and using the devices are included. By using 3D-printed objects, modification to the design was timely, efficient and allowed for quick turnaround for testing.

Eine 3D-gedruckte Pollenfalle für Hummel (Bombus) Bienenstockeingänge

To verify the plant sources from which bumble bees forage for pollen, individuals must be collected to remove their corbicular pollen loads for analysis.  ...

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in all vertebrates by providing feedback to the brain and pituitary. Teleost fishes possess a higher degree of tissue plasticity and variation in reproductive&#160;strategies compared to mammals and appear to be useful models to investigate the role of sex steroids and the mechanisms by which they act. The removal of the main source of sex steroid production using gonadectomy together with blood sampling to measure steroid levels has been well-established and fairly feasible in bigger fish and is a powerful technique to investigate the role and effects of sex steroids. However, these techniques raise challenges when implemented in small size teleost models. Here, we describe the step-by-step procedures of gonadectomy in both males and female Japanese medaka followed by blood sampling. These protocols are shown to be highly feasible in medaka indicated by a high survival rate, safety for the life span and phenotype of the fish, and reproducibility in terms of sex steroid clearance. The use of these procedures combined with the other advantages of using this small teleost model will greatly improve the understanding of feedback mechanisms in the neuroendocrine control of reproduction and tissue plasticity provided by sex steroids in vertebrates.

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

The article describes a quick protocol to gonadectomize and sample blood from the small teleost fish, using Japanese medaka (Oryzias latipes) as a model, to investigate the role of sex steroids in animal physiology.

Gonadektomie und Blutentnahmeverfahren im Small Size Teleost Modell Japanische Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...