Dieses Protokoll ist nützlich in vielen biologischen und toxikologischen Studien von Honigbienen, die mit Pestiziden behandelt wurden. Es hilft, die zellulären Reaktionen von Honigbienengewebe von Akariziden zu erkennen, die in Bienenvölkern zur Behandlung von Varroamilben eingesetzt werden. Es ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Nachweis von sub-kleinen Auswirkungen auf das Gewebe in Kombination mit dem Verhalten von Bienen oder anderen nützlichen Insekten.
Nehmen Sie zunächst vorsichtig eine Arbeiterbiene mit einer Pinzette und legen Sie sie zwei Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius auf Eis oder Gefrierschrank, um sie zu immobilisieren. Stecken Sie die Biene auf der Petrischale diagonal durch den obersten hinteren Teil des Thorax zweimal von links nach rechts und von rechts nach links. Schlechte Insektensalzlösung, um den Körper zu bedecken.
Stellen Sie die Petrischale unter das Stereomikroskop, fokussieren und justieren. Um den Mitteldarm zu sezieren, beginnen Sie mit dem Bauch, indem Sie einen Punkt der Schere unter dem Tergit A5 in der Mitte der rechten Seite des Bienenkörpers einführen. Auf den Tergit A2 schneiden. Halten Sie die innere Klinge der Schere parallel zur Körperseite, um eine Beschädigung der inneren Organe zu vermeiden.
Drehen Sie die Schere nach links und schneiden Sie. Öffnen Sie vorsichtig den linken Teil des Bauches und stecken Sie ihn fest. Ziehen Sie mit einer Hand die Honigbiene vorsichtig nach oben und schneiden Sie mit einer Schere in der anderen Hand ganz am Ende der Speiseröhre.
Ziehen Sie den Magen und den Mitteldarm vom Bauch weg und schneiden Sie am Rektum ab. Verwenden Sie eine Pipette mit Insektenkochsalzlösung und entfernen Sie Kot oder Teile des Gewebes. Zur Dissektion der hypopharyngealen Drüsen immobilisieren Sie eine Arbeiterbiene auf Eis wie zuvor beschrieben.
Schneiden Sie den Kopf ab und legen Sie ihn mit der Antenne nach oben auf eine kleinere Platte. Sichern Sie den Kopf mit zwei Stiften, einen durch das linke Facettenauge und den zweiten durch das rechte Facettenauge. Machen Sie einen Schnitt über das erste Facettenauge auf der Innenseite der Stifte, fahren Sie weiter zum Labrum und machen Sie dann einen weiteren Schnitt auf der anderen Seite über das zweite Facettenauge.
Schneiden Sie die Antennen ab. Heben Sie die Maske ab und schneiden Sie sie dort ab, wo sie noch befestigt ist. Nehmen Sie die Pinzette und entfernen Sie vorsichtig die Drüsen zusammen mit dem Gehirn und einem Teil der Facettenaugen.
Für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung legen Sie die entwachsten, rehydrierten Abschnitte fünf Minuten lang in Hämatoxylin. Dann legen Sie sie vorsichtig für zwei Minuten unter fließendes Leitungswasser. Dann legen Sie sie für eine Minute in destilliertes Wasser und Eosin für vier Minuten.
Legen Sie die Objektträger 96% Ethanol für eine Minute, dann 2-Propanol für zwei Minuten und schließlich für zwei Minuten in das Clearing-Agent. Fügen Sie ein Montagemedium und ein Deckglas hinzu und lassen Sie sie trocknen. Unter einem Lichtmikroskop beobachten.
Coplin-Gläser vorbereiten. Proteinase-K vorbereiten. Nach dem Entwachsen und Rehydrieren der Abschnitte legen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in PBS.
Legen Sie die Objektträger flach in den Behälter und fügen Sie Proteinase-K hinzu. Die Objektträger in destilliertem Wasser waschen. Quench in endogener Peroxidase bei Raumtemperatur.
Spülen Sie die Objektträger mit PBS oder Wasser ab. Legen Sie die Objektträger flach in den Behälter und tragen Sie den Gleichgewichtspuffer für 10 Sekunden bei Raumtemperatur auf. Nach dem Abwischen des Gewebes fügen Sie jedem Abschnitt das terminale Desoxynukleotidyltransferase-Enzym hinzu und inkubieren Sie in einer befeuchteten Kammer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.
Legen Sie vor der Inkubation angefeuchtete Papiertücher in das Tablett um die Objektträger und bedecken Sie sie mit Plastikfolie. Nach der Inkubation legen Sie die Proben auf das Gestell und lassen Sie sie im Stop-Wash-Puffer. Nachdem Sie die Objektträger in PBS gewaschen und um das Gewebe gewischt haben, fügen Sie zwei Tropfen warmes Anti-Digoxigenin-Peroxidase-Konjugat zu den Abschnitten hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten in einem befeuchteten Behälter.
Nach dem Waschen in PBS Arbeitsstärke-Peroxidase-Substrat vorbereiten, die Abschnitte mit Peroxidasesubstrat abdecken und fünf Minuten einfärben. Legen Sie den Objektträger unter das Mikroskop und bestimmen Sie den optimalen Färbezeitpunkt. Nachdem Sie die Objektträger in einem Färbegestell und destilliertem Wasser gewaschen haben, inkubieren Sie die Objektträger fünf Minuten lang in destilliertem Wasser.
Gegenfärbung mit Hämatoxylin für zwei Minuten. Waschen Sie die Objektträger, indem Sie sie drei Minuten lang unter fließendes Leitungswasser und dann in destilliertem Wasser legen. Montieren Sie die Dias unter Glasdeckel und Montagemedium und lassen Sie sie flach trocknen.
Unter einem Lichtmikroskop beobachten. Der Prozentsatz der betroffenen Zellen wurde mit einem Lichtmikroskop berechnet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit Oxalsäure die Zellen im Mitteldarm signifikant beeinflusste.
Die Immunfärbung zeigte positive rote oder braune Reaktionsprodukte in den apoptotischen Kernen der hypopharyngealen Drüsen. Ein positives Reaktionsprodukt nach Imidacloprid- oder Coumaphos-Behandlung wurde in der Mehrzahl der Drüsenzellen bestimmt. Achten Sie beim Anheben der Maske des Bienenkopfes darauf, die Teile der Hypopharynxdrüsen nicht zu beschädigen oder abzuziehen.
Diese Technik erkennt subklinische Veränderungen bei Bienen und eignet sich auch zum Nachweis anderer Umwelteinflüsse auf Bienen und einige andere lebende Organismen.
