Das Protokoll beschreibt, wie virale Injektionen durchgeführt und ein Schädelfenster für die Bildgebung von Gehirnzellen in wachen, kopfgefesselten Mäusen implantiert werden können. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass Struktur und Aktivität von Neuronen und Astrozyten wiederholt über mehrere Sitzungen abgebildet werden können. Mit diesem Ansatz kann bestimmt werden, wie neuronale Zellen in Modellen neurologischer Entwicklungsstörungen oder neurodegenerativer Erkrankungen verändert sind oder ob die erfahrungsabhängige Plastizität beeinträchtigt ist.
Beginnen Sie mit der Befestigung einer betäubten Maus an einem stereotaktischen Rahmen mit der Schnauzenklemme und den Ohrstangen. Schneiden und entfernen Sie die Haut mit sterilen chirurgischen Werkzeugen von den frontalen Nähten vor dem Bregma bis nach hinten zum Lambda. Kratzen Sie mit einer sterilen chirurgischen Klinge aus Kohlenstoffstahl der Größe 11 vorsichtig das gesamte Bindegewebe vom Schädel.
Bohren Sie mit Hilfe eines Zahnbohrers den Schädelknochen allmählich entlang des Umrisses der Öffnung in konzentrischen Kreisen, um eine gleichmäßige Ausdünnung des Knochens zu erleichtern. Fügen Sie nach jedem konzentrischen Durchgang einen oder zwei Tropfen Kochsalzlösung in den gebohrten Bereich ein und lassen Sie die Kochsalzlösung mindestens 10 Sekunden ruhen, bevor Sie das Bohren fortsetzen. Drücken Sie vorsichtig auf den zentralen Bereich des Schädelknochens mit einer feinen Pinzette, um zu überprüfen, ob der Schädel ausreichend ausgedünnt ist und sich bewegt.
Stellen Sie sicher, dass das darunter liegende Gefäßsystem, in dem die Bohrung stattgefunden hat, intakt ist und dass der Knochen nicht gerissen ist. Führen Sie vorsichtig eine 15-Grad-Miniatur-Spitzklinge in den ausgedünnten Knochen ein und schneiden und verwenden Sie den in Kochsalzlösung getränkten Gelschaum, um eventuell auftretende Blutungen zu stoppen. Verwenden Sie eine Pinzette, heben und entfernen Sie den Knochen vorsichtig und achten Sie darauf, die Dura Mater nicht zu beschädigen.
Für die Injektion eine sterile abgeschrägte Glaspipette mit einer 20-Mikrometer-Spitze mit der Virusmischung füllen. Senken Sie dann die Pipette ab, um die Oberfläche des Gehirns zu berühren, und senken Sie sie für weitere 200 bis 300 Mikrometer für Schicht-2/3-Injektionen weiter. Mit einem intrazellulären Mikroinjektions-Dosiersystem injizieren Sie das System 12 bis 15 Mal über zwei Minuten.
Für die Schädelfensterimplantation das Deckglas über die Öffnung im Schädel legen. Verwenden Sie eine Pinzette, um sicherzustellen, dass das Glas bündig über die Öffnung ist. Um die Kanten des Glasfensters mit dem Schädel zu versiegeln, tragen Sie Cyanacrylat-Klebegel um den Umfang der Glasoberfläche auf.
Über das Klebegel eine Schicht Klebstoff auftragen. Dann fügen Sie eine Schicht Zahnzementflüssigkeit hinzu. Wenn Zahnzement aushärtet, tragen Sie eine dünne Schicht Klebstoff um die zentrale Öffnung der Hubschrauberkopfplatte auf und legen Sie die Hubschrauberkopfplatte der entsprechenden Größe über das Deckglas.
Lassen Sie den Kleber trocknen. Fügen Sie Zahnzementpulver in einem 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen bis zur 0,1-Milliliter-Marke hinzu. Mischen Sie sieben bis acht Tropfen schnell aushärtenden Sofortkleber in das Pulver und ziehen Sie die resultierende Mischung in eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 19-Gauge-Nadel, die geschnitten wurde, um eine größere Öffnung zu schaffen.
Injizieren Sie die Pulvermischung durch die seitlichen Löcher der Hubschrauberstange, bis sie von beiden Seiten versickert. Tragen Sie die Zahnzement-Klebstoffmischung auf den Rest des freiliegenden Schädels auf, um die Kopfplatte am Schädel zu befestigen. Wickeln Sie die Maus in Stoff und befestigen Sie sie über ihre Kopfplatte am Kopfbefestigungsarm des in die Luft gehobenen Heimkäfigs, dann lassen Sie den Hauskäfig dem Licht ausgesetzt.
Nach einer Eingewöhnungszeit von 15 Minuten die Maus aus dem Hauskäfig entfernen. Wählen Sie im Weitfeldmodus des Mikroskops zwei bis drei Positionen des leicht identifizierbaren Gefäßsystems aus. Speichern Sie die Bilder der Blutgefäße und zeichnen Sie die x- und y-Koordinaten auf, die auf dem Motorcontroller erscheinen.
Stellen Sie sich die synaptischen Strukturen von Neuronen und die GCaMP6f-Aktivität in Astrozyten vor. In der repräsentativen Analyse wurde die Qualität des Schädelfensters mit wiederholter Bildgebung von Dendriten und GCaMP6f-exprimierenden Astrozyten über Tage bewertet. In einem guten Fenster erschienen die neuronalen Strukturen knackig mit deutlich sichtbaren dendritischen Stacheln.
Zwei neue Stacheln erschienen am zweiten Tag der Bildgebung. Nur eine Wirbelsäule blieb bestehen und war am fünften Tag sichtbar. Die Kalziumaktivität wurde in Astrozyten untersucht, die GCaMP6f zu verschiedenen Zeitpunkten exprimierten.
Ein globales Ereignis, das die gesamte Zelle umfasste, wurde während eines Fortbewegungskampfes beobachtet. Die beiden kritischen Schritte dieses Protokolls sind, dass der Knochen vor der Entfernung des Knochens ausreichend ausgedünnt werden muss, und die richtige Platzierung des Deckglases über der Öffnung. Die Bildgebung kann mit einer Verhaltensanalyse kombiniert werden, entweder während der Bildgebung oder nach dem Verhalten, z. B. dem Erlernen einer neuen motorischen Fähigkeit, um zu bestimmen, wie die Struktur und Funktion von neuronalen und Astrozyten durch Lernen moduliert wird.
