Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH DJB (AI041930, AI073142, AI075931 und AI091461) unterstützt.

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Hier bieten wir ein Protokoll für einen effizienten Gen-Targeting in Δ Ku80 Parasitenstämme um die effiziente Gewinnung von genetisch manipulierten Nachkommen, die gezielte Deletionen, Genaustausche und / oder markierten Gene besitzen können. Die sequentielle Ausführung dieser Verfahren stellt eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Mutanten Parasiten, die einzelne oder mehrere gezielte genetische Manipulationen 1-3 enthalten. Während die Erzeugung eines gezielten Löschung hängt von mehreren Faktoren ab, die Verwendung der Δ Ku80 Stamm mit der vorgestellten Strategie und Protokoll erhöht die Effizienz und Leichtigkeit der Herstellung genau definierte Mutanten von T. gondii zur funktionellen Genom-Studien. Das Genom von T. gondii während asexuellen Stadien ist haploid. So eine Überlegung zu machen bei der Planung, um ein Gen zu löschen ist, dass das Gen darf nicht wesentlich in vitro. Dennoch ist die Effizienz der targeting Gen-Knockouts in Δ Ku80 Stämme ist sehr hoch, und dies ermöglicht die Isolierung von Mutanten mit deutlich eingeschränkter Replikationsraten. Wenn eine gezielte Gen ist wichtig, Parasiten oft nicht mehr bei der Auswahl zu replizieren. Ein weiterer kritischer Faktor bei der gezielten genetischen Manipulation ist, dass perfekte Homologie mit mindestens 620 bp der genomischen Targeting Flanke wird benötigt, um nachweisbar zu erhalten gezielte Integrationen 2. Längere Homologieregionen erzeugen höhere Wirkungsgrade von Targeting und mit Targeting-DNA Flanken von ca. 1.000 bp ist ein zuverlässiges und effizientes Konzept 1-4. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass genomische Targeting Flanken aus dem gleichen Stamm von T. erzeugt gondii (RH, Pru) als Stamm, ist genetisch manipuliert wird. Mangel an ausreichender Homologie häufig in der gezielten Integration eines genomische Targeting Flanke führen, aber nicht die anderen. Unvollständige Integration bzw. gegen eine Knockout ma erhalteny auch aufgrund episomalen Beharrlichkeit. Unmittelbar nach der Transfektion werden alle Zielmoleküle Episome nicht integrierten und manchmal Targeting-Moleküle können als Episomen viele Generationen bestehen. Mit Ziel-DNA-Flanken von ~ 1 Kbp und Weiterbildung, um Parasiten unter Selektion vor Re-Subklonierung passieren häufig behebt Probleme mit episomalen Persistenz verbunden. Sobald ein Knockout wird validiert und die HXGPRT Markierung entfernt wird, kann das Gen-Targeting-Strategie auf einer zweiten GOI mehrere Deletionen in einem einzigen Parasiten Stamm 1-3 erzeugen wiederholt werden. Die Erzeugung von Deletionen, Ersatz oder markierten Gene können auch durch die Verwendung verschiedener Selektionsmarker (Bleomycin, CAT, Pyrimethamin resistent DHFR, etc.) erreicht werden. Obwohl die CAT Selektionsmarker derzeit in der Typ-II-Δ Ku80 Pru Genoms 1 kann diese Markierung entfernt werden unter Verwendung des HXGPRT </em&gt; Auswahl hier beschriebene Protokoll. In unseren Händen ist HXGPRT Auswahl die sicherste und effizienteste Marker mit der höchsten Effizienz Targeting wo ein single-copy gezielte Einsetzen ist ausreichend für robuste Auswahl MPA + X Medium. HXGPRT bietet auch die einzige derzeit nützlicher Ansatz für gezielte Löschen eines Selektionsmarker (Abbildung 3) mit 6-Thioxanthin (6TX) 2,3 Auswahl. Dabei dient dieses Protokoll bietet die einzige derzeitige Ansatz für die Entwicklung definiert Mutanten mit mehreren gezielten genetischen Manipulationen. Dieses Protokoll bietet eine wertvolle und effiziente Methode zur gezielten genetischen Manipulation in Δ Ku80 Stämme von Toxoplasma gondii und ist auf die Analyse eines einzelnen Gens, einer Familie von Genen, oder Genom-weiten funktionalen genomischen Studien. Vor der Verfügbarkeit von Δ Ku80 Stämme 1,2 waren diese Ansätze nicht allgemein möglich aufgrund der inefficiency dieser Methoden. Folglich ist dieses Protokoll weit für gezielte genetische Manipulation von Toxoplasma gondii und ist zugänglich für alle Ermittler bei der Bewältigung einer Reihe von Fragen auf Parasiten Biologie, Host-Reaktion und der funktionellen Genomik interessiert.

Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazelluläre gemeinsamen einzelligen Parasiten, die häufig chronisch infiziert und eine breite Palette von Tieren und Menschen 5. Es wird geschätzt, dass mehr als 1 Milliarde Menschen derzeit chronisch infizierten und von diesem Erreger. Neben der Bedeutung von Krankheiten verursacht durch T. gondii-Infektion, die zunehmende Verfügbarkeit von experimentellen Tools, leistungsstarke Genomik Ressourcen 6, einfache in vitro Wachstum und eine hervorragende Maus-Modellen gemacht haben T. gondii ein führender Modellsystem für die Untersuchung der intrazellulären breiteren eukaryotischen Krankheitserreger und andere bedeutende Apicomplexa die verheerende Krankheiten wie Malaria (Plasmodium sp.) und Cryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7 verursachen. Eine erhebliche Einschränkung der Toxoplasma gondii als Modellorganismus ist die ineffiziente Verwertung von Nachkommen, die gezielte genetische Manipulationen zu tragen. Diese problem in der Gen-Targeting ist aufgrund einer niedrigen Frequenz der homologen Rekombination relativ zu der sehr hohen Frequenz-homologe Rekombination in Wildtyp-Stämme von T. gondii, auch wenn umfangreiche DNA-Homologie wird in Ziel-DNA-Moleküle in genetischen Studien 2 verwendet wird. Wir haben kürzlich die genetisch Hauptweg der homologen Rekombination in der Aktivität blockiert I und Typ II-Stämme von Toxoplasma gondii durch Deletion des Gens kodierend für das Protein KU80 1,2. Die resultierende Typ I und Typ II Δ Ku80 Stämme weisen normale Wachstumsraten, Größe und Verhalten sowohl in vitro als auch in vivo während Tachyzoiten und bradyzoite Stadien in vitro und in vivo, jedoch weisen diese Stämme im Wesentlichen eine 100% Frequenz der homologen Rekombination und diese Phänotyp erhöht die Wahrscheinlichkeit rasch Isolieren gewünschten Nachkommen der gezielten genetischen Manipulation von mehreren hundert bis zu mehreren Thousand-fach 1,2,4. Aktuelle EU-weite Verwendung von Typ I und Typ II Δ Ku80 Stämme hat deutlich hochgefahren das Tempo, die Vielfalt sowie die Erfolgsquote der gezielte genetische Ansätze in T. gondii 1-4,8-13. Hier beschreiben wir ein umfassendes Protokoll zur gezielten Gen-Deletion, Gen-Ersatz, und Gen-Tagging in Δ Ku80 Stämme von T. gondii. Wir zeigen, wie zu entwerfen und zuverlässig gezielt genetische Manipulationen, bestimmte Gene oder genetische Loci in Δ Ku80 Stämme von Toxoplasma gondii.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

Gezielte genetische Manipulation mit homologen Rekombination ist die Methode der Wahl für die funktionelle Genomanalyse, um eine detaillierte Ansicht der Genfunktion und Phänotyp (s) zu erhalten. Die Entwicklung von Mutanten mit gezielter Deletionen, gezielte Mutationen, ergänzt Genfunktion und / oder markierten Gene liefert leistungsfähige Strategien zur Genfunktion zu befassen, insbesondere, wenn diese genetische Manipulationen effizient mit dem Gen-Locus von Interesse unter Verwendung vermittelte Integration durch gezielte Doppel überqueren homologe Rekombination. Aufgrund der sehr hohen homologen Rekombination funktionelle Genomanalyse von Toxoplasma gondii wurde zuvor durch das Fehlen effizienter Methoden zur gezielten Deletionen und Genaustausche bestimmten genetischen Loci begrenzt. Vor kurzem abgeschafft wir den Hauptweg von homologe Rekombination in Typ I und Typ II Stämme von T. gondii durch Löschen des Gens encoding der KU80 Protein 1,2. Die Stämme Δku80 normales Verhalten während Tachyzoiten (akute) und bradyzoite (chronische) Stufen in vitro und in vivo und weisen im Wesentlichen eine 100% Häufigkeit der homologen Rekombination. Die Δ Ku80 Stämme machen funktionellen Genomstudien möglich auf dem Gen als auch auf dem Genom Skala 1-4. Hier berichten wir über Methoden für die Verwendung von Typ I und Typ II Δku80Δhxgprt Stämme Gen-Targeting-Ansätze in T. voranbringen gondii. Wir skizzieren effiziente Methoden zur Erzeugung von Deletionen, Gen-Ersatz, und markierten Gene durch gezielte Insertion oder Deletion des Hypoxanthin-Xanthin-Guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) Selektionsmarker. Die beschriebene Gen-Targeting-Protokoll kann in einer Vielzahl von Weisen in Δku80 Stämme verwendet werden, um funktionelle Analyse des Parasitengenom voranzutreiben und einzelnen Stämme, die Durchführung zu entwickelnmehrere gezielte genetische Manipulationen. Die Anwendung dieser genetischen Verfahren und anschließende phänotypische Assays wird zeigen, grundlegende und einzigartige Aspekte der Biologie von T. gondii und damit verbundene erhebliche personelle Erreger der Malaria (Plasmodium sp.) und cryptosporidiosis (Cryptosporidium) verursachen.

Eine detaillierte Vorlage zum Aufbauen eines Targeting-Plasmid, ein Gen zu löschen, einschließlich der Platzierung von Restriktionsenzymstellen und Erzeugung der Primer, die genetische Targeting und Validierung von Gen-Targeting, sowie Plasmidkonstruktion Erleichterung für den nachfolgenden Löschung HXGPRT in einer dafür vorgesehenen Einstufiges Verfahren (1A-C, 2A, 3A). Ein allgemeines Schema für die Herstellung einer gezielten Gen-Deletion (2A), die Primer-Paare verwendet werden, um die Löschung eines Knockout validieren, zum Beispiel dargestellt, sind Typ I ROP18 (2B) und repräsentative Ergebnisse des PCR-Validierung gezeigt (Abbildung 2C). Diese repräsentatives Ergebnis ist gezeigt, um die Streuung der Ergebnisse, die auf genetischer Loci, die relativ schwer sind Ziel erreicht werden kann, darzustellen. Eine erfolgreich gezielte Gen-Deletion in der Abwesenheit des Gens in FolgeInteresse PCR-Produkt (PCR 1), das Vorhandensein des 3&#39;das genomische Targeting Flanke (PCR2) und die Gegenwart des selektierbaren Markers HXGPRT richtig zwischen 5 integriert und 3&#39;das genomische Targeting Flanken, die die Löschung definieren (PCR3 und PCR4) . Clones 3, 4, 5, 6, 8, 9 und 11 sind gezielte Deletionen (Knockouts), wo HXGPRT die indische Regierung (Abbildung 2C) ersetzt wurde validiert. Ein Klon, der keine einen Gendeletion kann durch eine Vielzahl von Bandenmuster dargestellt werden. Typischerweise wird ein Klon ohne Gen-Deletion die elterliche Stamm (elterlichen Muster) mit Bands für PCR1 und PCR2 beobachtet spiegeln, aber nicht für PCR3 oder PCR4 wie Klone 1 und 2 (Abbildung 2C) gesehen. Diese &quot;elterliche Muster&quot; ergibt sich aus ein paar mögliche Mechanismen. Gelegentlich tragen MPA beständig ausgewählt Parasiten nicht integrierten persistierenden Episomen der pΔGOI Targeting-Plasmid, und wir beachten, dass fortgesetzte Zuchtwahl oft zwingt diese Episomenzu integrieren. Wir beobachten einige seltene Hintergrund in der Typ-I-Δ Ku80 Kräften durch unbeabsichtigte Integration der pΔGOI Targeting Plasmid, das enthält eine HXGPRT cDNA über DHFR 5 &#39;und 3&#39; Promotorelemente, entweder in die DHFR-Locus oder in den teilweise gelöschten HXGPRT ausgedrückt Locus 14. Während dieses seltene Ereignis ist eine gezielte Integration, war es nicht die beabsichtigte Integration und dient als wichtiger Punkt bei der Gestaltung eines Gen-Ersatz-Strategie erinnern. DNA-Homologie größer als 120 bp auf Ihrem pΔGOI durchgeführt Targeting Plasmid kann eine Alternative für die Rekombination in Δ Ku80 Stämme 2, die zurück geben könnte einen unerwünschten Hintergrund. In der Typ-II-Pru Δ Ku80 Stamm diesem Hintergrund wird reduziert oder gar nicht im Vergleich zu Typ I, da die HXGPRT Selektionsmarker auf Typ-I-Sequenzen, die Nukleotid-Polymorphismen haben, wenn sie mit Typ-II-DNA im Vergleich basiert diereduziert diese seltene Hintergrund in Experimenten unter Verwendung der Typ-II-Pru Δ Ku80 Stamm 1. Wenn ein Gen-Locus wesentlich ist (kann nicht gelöscht werden), oder hat einen extrem niedrigen Gen-Targeting-Frequenz an der Stelle, oder wenn persistierende [nicht integrierten] Episomen nicht einfach über Wachstum und Selektion eliminiert, diese elterliche Muster wird das Muster in MPA beobachtet dominieren resistenten Klone. Alternativ wird das Targeting-DNA-Molekül beobachtet, manchmal nur an der 5 &#39;oder 3&#39;-genomische Targeting Flanke und eine Band ist entweder PCR3 oder PCR4 beobachtet (aber nicht beide) zusammen mit PCR1 und PCR2 als für Klon 10 zu sehen (5 integrieren &#39;Integration) und Klon 7 (3&#39; Integration) (Abbildung 2C). Diese Muster deuten die seltenen Auftreten einer einzigen Cross-Over-Integration des Targeting-Plasmid an der Stelle, die HXGPRT integriert aber diese gezielte Integration löscht nicht das Gen von Interesse. Dieses Muster (Spuren 7 &amp; 10 in 2C) emzeigersinn die Notwendigkeit, die PCR-Daten zu berichten, um zu überprüfen, dass die gezielte Integration stattgefunden anstelle eines einzigen homologen überqueren und eine zweite homologe Integration des Zielmoleküls. Selten, beobachten wir eine genetische Mischung von Klon 12 (2C), die sowohl eine elterliche Muster und einen gezielten Löschung Muster stellt vertreten. Dieses Muster wahrscheinlich entsteht gelegentlich von zwei Genotypen, Parasiten an derselben Stelle in einem Klonierungsvektor gut. Ein allgemeines Schema für die Entfernung von HXGPRT von Δ ku80Δgoi :: HXGPRT zu HXGPRT aus dem Stamm löschen dargestellt (Abbildung 3A). Die Primer-Paar verwendet, um das Entfernen von HXGPRT Δ Δ Ku80 GRA2 :: HXGPRT (3B) zu validieren verstärkt eine einzigartige ~ 1,2 kbp Band in PCR5 nach Klone 4, 7, 9, 11 und 12 (Fig. 3C) gesehen. Wenn HXGPRT nicht von dem Ort, a ~ 3 entfernt.4 Kbp Band beobachtet wird (Klone 1, 2, 3, 6, 8, 10, und die elterliche Kontrolle). Mehrere Mechanismen handeln, um die Entfernung von HXGPRT (6TX Auswahl) schwieriger und weniger effizient als die Integration von HXGPRT (MPA + X Auswahl). MPA Auswahl ist einfach effizienter als 6TX Auswahl 14,16. Außerdem werden höhere HXGPRT Ausdruck für 6TX Auswahl als MPA Auswahl 16,24 erforderlich. Folglich können Mutationen, die HXGPRT Enzymaktivität oder Mutationen oder epigenetischen Veränderungen, die die Expression von HXGPRT am Locus eines Gens reduzieren reduzieren kann möglicherweise die Abschaffung der Wirksamkeit 6TX Auswahl. Selbst mit diesen Herausforderungen 6TX Auswahl, ist die Erfolgsquote von 6TX Auswahl Δ Ku80 Stämme mehr als 90% beim ersten Versuch 1-3. Ein allgemeines Schema für die direkte C-terminale Markierung von Protein-kodierenden Gene dargestellt (Abbildung 4). DieseSchema verwendet die direkte Integration über Doppelkreuz über homologe Rekombination HXGPRT 3 &#39;des Gens markiert und auch beschäftigt Validierung ähnliche Strategien wie die oben beschriebenen. Wenn ein Gen, das im Verdacht steht, ein essentielles Gen der Nachweis erbracht, unter Verwendung eines zweiten Transfektion mit einem unabhängig isoliert zielende DNS-Plasmid werden kann. Alternative Methoden, wie z. B. Systeme für regulierte Genexpression, zur weiteren Überprüfung, ob ein Gen ist wichtig 25 verfügbar. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Abbildung 1. Überblick über die Konstruktion eines Targeting-DNA-Plasmid. A. Schema für die Gestaltung überlappen Primer zur PCR zu amplifizieren den 5 &#39;und 3&#39;-Ziel-Flanken mit 33 bp Überlappungen der Shuttle-Vektor pRS416 und HXGPRT Minigen Kassette. Grundierungen im Schaltplan dargestellt warenverwendet, um die 5 &#39;und 3&#39;-Ziel Flanken pΔROP18 10. B. Allgemeine Strategie zur Konstruktion eines Targeting-DNA-Molekül zu erzeugen. Das Rückgrat ist die pΔGOI pRS416 Shuttle-Vektor enthaltenden Uracil (URA) und Ampicillin (AMP) Selektionsmarker. Eingefügt in pRS416 ist a ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-Target-Flanke aus genomischer DNA mit Überlappungen zum HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit den F1 und R1 amplifiziert, a ~ 1 Kbp 3&#39; DNA-Target-Flanke aus genomischer DNA mit Überlappungen für verstärkte die HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit den F2 und R2 Primer und die HXGPRT Minigen Kassette. Die folgenden einzigartigen Restriktionsenzymverdau Seiten mit den Primern hinzugefügt: RE.X (Restriktionsenzym Schnitt X site) in der F1-Primer an die Plasmid-am 5&#39;-Ende der 5&#39;-DNA-Target-Flanke zu schneiden, in der R2 RE.Y Primer, um das Plasmid an das 3&#39;-Ende der 3&#39;-Ziel-DNA flankieren und RE.Z Schnitt in der R1 und F2 Primer Verbrauchsteuerpflichtige die HXGPRT minigene Kassette. C. Primer-Sequenzen verwendet, um das Targeting-Konstrukt für die Löschung der ROP18 erzeugen. Die fett Regionen T. entsprechen gondii genomische Sequenz und die nonbold Bereiche den Restriktionsenzymstellen und Sequenzen, die mit pRS416 und HXGPRT Minigen Kassette überlappen entsprechen. Die HX_F und HX_R Primerpaar verstärkt das HXGPRT Minigen Kassette 14. Primer lesen von 5 &#39;nach 3&#39;. Tabelle aus Fentress et al 10 angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Abbildung 2. Überblick über das Protokoll für die Löschung eines Gens mit HXGPRT. A. Disruption einer indischen Regierung in der Δ ku80Δhxgprt Belastung durch einen Doppel-Crossover homologe Rekombination Veranstaltung mit einem ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-Target Flanke und ein ~ 1 Kbp 3&#39; DNA-Target-Flanke auf dem Plasmid pΔGOI. Ein PCR-Strategie mit PCR1, PCR2, PCR3 und PCR4 (nicht maßstabsgetreu) wird gezeigt, dass Genotyp Überprüfung ermöglicht, um Klone mit gezielten Integration von HXGPRT und Löschung der indischen Regierung Locus validieren. B. Repräsentative Primerpaare entworfen, um die Löschung der ROP18 validieren . ROP18_DF und ROP18_DR verstärken PCR1, ROP18_ExF und ROP18_CxR verstärken PCR2, ROP18_CxF und DHFR_CxR verstärken PCR3 und DHFR_CxF und ROP18_CxR verstärken PCR4 (siehe Abbildung 2A). Primer lesen von 5 &#39;nach 3&#39;. Tabelle aus Fentress et al 10. C. Repräsentative Ergebnisse der Validierung einer gezielten Gen-Deletion (ROP18) mit HXGPRT angepasst. Nach der Transfektion von Plasmid pΔROP18 in Δ ku80Δhxgprt und Selektion in MPA +X, X + MPA-resistente Klone wurden für die Löschung der ROP18 getestet. Die Elternstammes Kontrolle ist für die PCR-1 (~ 400 bp) und PCR 2 (~ 650 bp) Produkt positiv und negativ für die PCR-3 (~ 1.200 bp) und PCR 4 (~ 1.300 bp) Produkt. Eine gezielte GOI Knockout ist positiv für die PCR2, PCR3 und PCR4 Produkte und ist für die PCR 1 Produkt negativ (siehe Abbildung 2A). Dargestellt sind repräsentative Platten der Ergebnisse PCR1 und PCR2 (oben), PCR3 (Mitte), und PCR4 (unten). Klone, 3, 4, 5, 6, 8, 9 und 11 zeigen die richtige Bandenmuster PCR 1, PCR2, PCR3 und PCR4 die ein Zielgen Lösch-Ereignis in dem Klon definiert. Klone 1, 2, 7, 10 und 12 sind nicht Deletionen und entsprechen andere potenzielle repräsentative Ergebnisse. (C = elterliche Kontrolle Stamm Δ ku80Δhxgprt, M = Größe Marker). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Abbildung 3. Übersicht des Protokolls für Re-Targeting das Gen von Interesse HXGPRT löschen. A. Strategie zur Entfernung des HXGPRT Selektionsmarker durch eine doppelte Crossover-Ereignis der homologen Rekombination in dem Stamm Δ ku80Δgoi :: HXGPRT eine ~ 1 kbp 5 &#39;Ziel-DNA flankieren und ein ~ 1 kbp 3&#39; DNA-Target-Flanke auf dem Plasmid pΔGOIc. Die PCR-Strategie für Genotyp Überprüfung dargestellt unter Verwendung eines Primer-Paares, um Assays für eine PCR-Produkt (PCR5), die die Löschung umfasst (nicht maßstabsgetreu). B. Eine repräsentative Primerpaar konstruiert, um das Entfernen des HXGPRT Selektionsmarker vom GRA2 validieren Locus in Stamm Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Grundierungen GRA2 _CLF und GRA2_CxR verstärken PCR5. Grundierungen<html> Lesen von 5 &#39;nach 3&#39;. C. repräsentativen Auswahl von 6TX-resistenten Klone, die nach Transfektion von Plasmid pΔGOIc erhalten in Δ ku80Δgoi :: HXGPRT und Auswahl werden kann 6TX. Klone, 4, 7, 9, 11 und 12 zeigen die richtige Bandenmuster PCR5 die gezielte Deletion der HXGPRT Marker (~ 1,2 kbp-Produkt, das umfasst das 3&#39;-Flanke mit geringfügige Überlappung mit dem 5&#39;-Flanke und außerhalb der 3 &#39;entspricht Flanke). Klone 1, 2, 3, 6, 8 und 10 (diese Band Licht) stellen die erwarteten Bandenmuster um ~ 3,4 kbp, die dem elterlichen Klon Genotyp entspricht, auch wenn diese Klone eine gewisse Resistenz zeigten an, die zulässige 6TX ihre Auswahl (dieser Phänotyp kann gelegentlich spontan entstehen durch Abschalten HXGPRT Ausdruck (siehe Hinweis im Protokoll 2.1 (Schritt 8) und Repräsentative Ergebnisse Abschnitt). (C = elterliche Kontrolle Stamm Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = Größe Marker).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Abbildung 4. Konstruktion eines Targeting-DNA-Molekül, um die C-terminalen Ende des Proteins kennzeichnen. Die Strategie beruht auf der Fähigkeit des HXGPRT Marker auch als 3&#39;-regulatorische Region stromabwärts funktionieren basiert. Das Rückgrat ist die pΔGOItag pRS416 Shuttle-Vektor mit Uracil (URA) und Ampicillin (AMP) Selektionsmarker. Eingefügt in pRS416 ist a ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA-Target-Flanke aus genomischer DNA mit Überlappungen zum HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit dem Fgoi und RTAG Primer, a ~ 1 Kbp 3 verstärkt&#39; Ziel-DNA Flanke von genomischer DNA mit Überlappungen für verstärkte die HXGPRT Minigen Kassette und pRS416 mit der F2 und R2Primer und die HXGPRT Minigen Kassette. Die 5&#39;-DNA-Target Flanke ersetzt die Terminationscodon mit dem Tag (HA, Myc, His, etc.) von einem Ersatz Terminationscodon gefolgt. MPA + X Auswahl integriert die C-terminalen Tags und einer stromabwärts HXGPRT und bewegt das 3&#39;-UTR zu einer Position nach der HXGPRT Marker. Die folgenden einzigartigen Restriktionsenzymverdau Seiten mit den Primern hinzugefügt: RE.X (Restriktionsenzym Schnitt X site) im Fgoi Primer, um das Plasmid an das 5&#39;-Ende der 5&#39;-DNA-Target Flanke geschnitten und in die RE.Y R2-Primer, um das Plasmid am 3&#39;-Ende des 3&#39;-DNA-Target Flanke und RE.Z im RTAG und F2 Primer geschnitten, um die Verbrauchsteuern HXGPRT Minigen Kassette zur Verwendung für Plasmidkonstruktion wieder gezielt das markierte Genlocus löschen die HXGPRT Marker, der die Platzierung der 3 &#39;UTR wiederherzustellen.

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Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Hier berichten wir ein Verfahren zur Verwendung von Typ I und Typ II<em&gt; Δku80</em&gt; Stämme<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Effizient zu erzeugen gezielte Deletionen und Gen-Ersatz für die funktionelle Genomanalyse.

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

genetic-manipulation-ku80-strains-for-functional-genomic-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

16.9K Aufrufe.  The Geisel School of Medicine at Dartmouth. Hier berichten wir ein Verfahren zur Verwendung von Typ I und Typ II Δku80 Stämme Toxoplasma gondii Effizient zu erzeugen gezielte Deletionen und Gen-Ersatz für die funktionelle Genomanalyse.

Serie: Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Gewinnung von hochgradig gereinigter Toxoplasma gondii Oocysten durch eine diskontinuierliche Cäsiumchloridgradienten

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Vorwärts Genetische Ansätze in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...